analisi del proteoma di adenocarcinoma cardias umana con il laser cattura microdissezione

analisi del proteoma umano di adenocarcinoma cardias da microdissezione laser
Abstract
sfondo
L'incidenza di adenocarcinoma gastrico cardiaca (GCA) è aumentata negli ultimi due decenni in Cina, ma i cambiamenti molecolari relative alla carcinogenesi avere non sono state ben caratterizzate.
Metodi
In questo studio, abbiamo utilizzato un approccio di proteomica comparativa per analizzare i cardias maligne e non maligne delle cellule epiteliali isolate da navigato microdissezione laser (LCM) da campioni chirurgici coppie di GCA umana.
Risultati
Ventisette punti corrispondenti a 23 proteine ​​sono state costantemente differenziale regolati. Quindici le proteine ​​hanno dimostrato di essere up-regolata, mentre otto proteine ​​hanno dimostrato di essere down-regolato in cellule maligne rispetto alle cellule epiteliali colonnari non maligne. Le proteine ​​identificate sembravano essere coinvolto nel metabolismo, chaperone, antiossidante, trasduzione del segnale, l'apoptosi, la proliferazione cellulare e la differenziazione. Inoltre, le espressioni di HSP27, 60, e PRX-2 in campioni GCA sono stati ulteriormente confermati da macchia immunoistochimica e occidentale analisi.
Conclusione
Questi dati indicano che la combinazione di LCM navigato con 2-DE fornisce una strategia efficace per scoprire proteine ​​che sono differenzialmente espressi in GCA. Tali proteine ​​possono contribuire a chiarire i meccanismi molecolari della GCA carcinogenesi. Inoltre, la combinazione fornisce potenziali biomarcatori clinici che aiutano nella diagnosi precoce e fornire ai potenziali bersagli terapeutici.
Sfondo
Varie analisi di dati di incidenza del cancro abbattuti dai paesi occidentali hanno rivelato rapido aumento dei tassi di adenocarcinoma dell'esofago e cardias in Negli ultimi decenni, rispetto ai tassi stabili e in calo per il carcinoma esofageo a cellule squamose (SCC) e l'adenocarcinoma gastrico distale (DGA) [1-3]. Questo fenomeno è evidente anche in Cina, eccetto che la crescente incidenza di gastrica Cardia adenocarcinoma (GCA) appare notevolmente superiore l'incidenza di cancro esofageo. Le prove indicano che GCA è un'entità clinica distinta come i suoi fattori di patogenesi e di rischio sono molto diverse da DGA. Pertanto, GCA è molto più diffuso, con una maggiore incidenza di metastasi linfonodali e una prognosi peggiore rispetto DGA [4]. L'incidenza annuale di GCA è di 50 /100.000 e può anche essere alto come 190 /100.000 in varie regioni della Cina [5]. La natura relativamente asintomatica nelle fasi iniziali della malattia e la mancanza di adeguati test di screening hanno determinato la maggioranza dei pazienti diagnosticati GCA essere in una fase già avanzata della malattia. Quindi, è necessario comprendere il meccanismo molecolare di cancerogenesi e per identificare i biomarcatori per la diagnosi precoce e il trattamento efficace di GCA umana.
Recentemente, il proteoma è emerso come una componente complemento del genoma. La supposizione è che potrebbe drasticamente aiutare a svelare i meccanismi biochimici e fisiologici delle malattie complesse multivariate a livello molecolare funzionale. Sebbene mutazione genetica e /o l'espressione del gene errant possono essere alla base di una malattia, le basi biochimiche per la maggior parte delle malattie sono causate da difetti di proteine. Pertanto, l'analisi di abbondanza di proteine ​​globale nei tumori umani, chiamata proteomica del cancro, potrebbe offrire molte opportunità e sfide per identificare nuovi marcatori tumorali e bersagli terapeutici, nonché nella comprensione patogenesi del tumore. Attualmente, elettroforesi bidimensionale (2-DE) e spettrometria di massa (MS) sono gli strumenti più largamente impiegato per la separazione e l'identificazione delle proteine. Tuttavia, l'eterogeneità è sempre una preoccupazione in studi di tessuto tumorale umano. Sebbene coltura cellulare è un approccio per superare questo problema, potrebbe non rappresentare accuratamente gli eventi molecolari che avvengono nel tessuto reale da cui sono stati derivati ​​[6]. Un confronto tra le linee cellulari di prostata umana e cellule tumorali degli stessi pazienti ha mostrato che il 20% dei profili proteici sono state modificate [7]. microdissezione laser (LCM) è uno sviluppo recente che può essere usato per procurare sottopopolazione altamente rappresentativa delle cellule da campioni di tessuto complessi eterogenei [8]. Questa tecnologia è stata utilizzata con successo in una gamma diversificata di studi che utilizzano l'analisi a valle del DNA e RNA, compresa l'espressione genica globale profiling [9] e analisi del proteoma di prostata [7], del colon [10], epatocellulare [11 ], della mammella [12], e tumori pancreatici [13]. Tuttavia, la combinazione di 2-DE e MS non è mai stata applicata allo studio della GCA umana.
Questo studio si propone di delineare la carcinogenesi di GCA e per identificare GCA-specifiche proteine ​​associate alla malattia come potenziali biomarcatori clinici per la diagnosi precoce e nuovi bersagli terapeutici. Abbiamo eseguito Navigated LCM ad arricchire entrambe le gastrici cellule epiteliali cardiache maligne e non maligne da campioni chirurgici coppie di GCA umana. Le proteine ​​estratte da queste cellule sono state separate mediante 2-DE. spot proteici differenziali sono stati identificati con le impronte digitali di massa peptide (PMF) sulla base di matrice assistita desorbimento laser /ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) e la ricerca di database. La validità di questi risultati è stata confermata da immunoistochimica e western-blot analisi
. Metodi
Materiali
strisce IPG (pH 3-10 non lineare) e soluzioni tampone IPG (pH 3-10 non lineare) sono stati acquistati da Amersham Pharmacia Biotech (APB, Svezia). DTT, urea, tiourea, Tris base, TX-100, CHAPS, glicina, l'acrilamide, Methylenebisacrylamide, SDS, TEMED, ammonio persolfato, nitrato d'argento, tripsina (grado sequencing), ACN, e TFA sono stati acquistati dalla Sigma (St. Louis, MO, USA). Infine, la completa cocktail inibitore della proteasi era da Roche (Lewes, UK). acqua di grado Milli-Q è stato utilizzato per tutte le soluzioni.
GCA campioni
nove paia di adenocarcinoma cardias umana e dei loro tessuti cardia nontumourous adiacenti sono stati ottenuti entro 30 minuti dopo una resezione chirurgica al secondo ospedale affiliato di Xi ' una Università Jiaotong nel 2005 (Tabella 1). Per evitare aree evidenti di ulcere o necrosi, i campioni sono stati prelevati da bordi dei tumori. Essi sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso. consensi informati sono stati ottenuti da tutti i pazienti. Nel frattempo, due patologi esperti hanno valutato la classificazione del tumore da un esame microscopico dei samples.Table 1 I dati clinici ed istologici di campioni tumorali di pazienti
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm di GEJ
1,5 × 2
moderatamente differenziato 2
63
m Entro 2 cm di GEJ
5 × 6
moderatamente differenziato 3
46
m Entro 2 cm di GEJ
4 × 5
moderatamente differenziato 4
60
m Entro 2 cm di GEJ
2 × 2,5
ben differenziato
5
73
m Entro 2 cm di GEJ
3 × 1
ben differenziato
6
70
M
Entro 2 cm di GEJ Pagina 2 × 1
ben differenziato 7
55
m Entro 2 cm di GEJ Pagina 2 × 3
mal differenziato
8
51
m Entro 2 cm di GEJ
4 × 6
scarsamente differenziato
9
63
m Entro 2 cm di GEJ
3 × 2,5
scarsamente differenziato
a) Luogo: epicentro del tessuto tumorale
preparazione del campione per LCM
Sezioni (8 um di spessore) sono stati tagliati su vetrini (predepurata utilizzando un detergente, lavato con acqua deionizzata, e immerso in etanolo) usando un Leica CM 1900 criostato (temperatura camera -28 ° C). Le sezioni erano o conservati a -80 ° C o tenuti nella camera criostato prima LCM. Ematossilina colorazione è stata effettuata solo per il monitoraggio di sezioni di tessuto e non è stato utilizzato in combinazione con LCM. Le sezioni sono state fissate (70% di etanolo per 1 min), ematossilina macchiata e disidratato (70% di etanolo per 45 s, 95% di etanolo per 45s, 2 × 100% di etanolo per 30s, e seguite da xilene 2 × per 5 min). Nel frattempo, le sezioni non colorate sono stati utilizzati per LCM. Essi sono stati fissati (70% etanolo per 30s), lavati in acqua deionizzata per 10s, e disidratato (70% di etanolo per 15 secondi, 95% di etanolo per 15s, 2 × 100% di etanolo per 15s, e seguita da xilene 2 × per 1 min ). Completa inibitori della proteasi cocktail compresse sono state
navigato LCM
Dopo aver fissato e la disidratazione, le sezioni non colorate sono stati asciugati e aria microdissezionate utilizzando il sistema Arcturus PixCellα (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM microscopio ripreso una sezione tinto ematossilina adiacente a quella di interesse. Questa immagine è stata visualizzata sullo schermo del computer utilizzando LCM LCM software di analisi dell'immagine (Arcturus, USA) ed è stato usato come una mappa per delimitare la regione per la dissezione su una sezione senza macchia adiacente. Le sezioni sono state poi acquisite utilizzando una um raggio laser di diametro 15 tipicamente a 50-80 potere mV con durata dell'impulso di 3-10 ms in modalità mitragliatrice e con una frequenza di emissione del laser di 1 colpo per 500 ms. In media, sono state scattate tra 10.000-12.000 colpi al tappo, e circa 25.000-30.000 cellule sono stati ottenuti per cap. Ogni tappo è stato catturato nel giro di un'ora. Sulla base di un attento riesame delle sezioni istologiche, ogni dissezione è stato stimato per contenere ≥ 95% delle cellule desiderate.
Tappi microdissezione sono stati inseriti in provette da microcentrifuga 0,5 ml contenente 50 uL di un tampone di lisi (7 M urea, 2 M tiourea, 4% w /v CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris-base, e completa inibitore della proteasi cocktail). Quindi le cellule sono state solubilizzati per inversione di tubi seguita da vortex-miscelazione per 1 min e breve impulso-centrifugazione a 12 000 × g. In seguito, i tessuti da più tappi (circa 800.000 ~ 1.000.000 di cellule) sono stati estratti nello stesso tampone di lisi fino sufficiente materiale era stato raccolto. I campioni sono stati centrifugati a 40.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Ove necessario, supernatanti sono stati conservati a -80 ° C fino all'utilizzo. La concentrazione proteica è stata determinata con il metodo di Bradford.
2-DE
Il primo-dimensionale focalizzazione isoelettrica (IEF) è stata effettuata sulla Pharmacia Immobiline IPG DryStrip sistema (Uppsala, Svezia). Per la prima dimensione di elettroforesi, i campioni contenenti 60 proteine ​​ug per i gel di analisi sono stati diluiti a 250 uL di una soluzione di reidratazione (7 M urea, 2% w /v CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v tampone di IPG (pH 3-10 non lineare), e traccia blu di bromofenolo) prima del caricamento su 13 cm strisce IPG (pH3-10 non lineari). IEF è stata poi effettuata utilizzando unità elettroforesi IPGphor secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, le strisce sono state equilibrate con una soluzione (6 M urea, 30% v /v di glicerolo, 2% w /v SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8.8), ridotti con 1% w /v DTT per 15 min e alchilata con 2,5% w /v iodoacetamide per 15 min. Strisce furono lavate in tampone di elettroforesi (25 di base mM Tris, 192 mM glicina, e 0,1% w /v SDS), applicato al 11% di gel di acrilamide e sigillati con agarosio fuso (0,5% w /v agarosio in tampone di elettroforesi contenente un traccia di blu di bromofenolo). SDS-PAGE è stata effettuata utilizzando Hoefer SE 600 camere verticali e tampone Tris-glicina (25 mM Tris e 192 mM glicina) contenente 0,1% w /v SDS, con la separazione iniziale a una costante 10 mA /gel per 30 minuti seguito da 20 mA /gel. La seconda dimensione SDS-PAGE è stata sviluppata finché il marker colorante blu di bromofenolo ha raggiunto il fondo del gel. Il tempo totale di esecuzione era tipicamente 4 a 4,5 ore. Gel sono stati fissati in 10% v /v di acido acetico, 40% v /v di etanolo prima sensibilizzazione per 30 minuti in un tampone contenente 30% v /v di etanolo, 0,2% w /v tiosolfato di sodio e 0,83 M acetato di sodio. Questo è stato seguito da tre lavaggi 15 min in acqua deionizzata. Le proteine ​​sono state poi colorate con 0,1% w /v di nitrato d'argento per 20 minuti, lavate due volte in acqua deionizzata per 1 min, e sviluppati in 2.5% w /v contenente carbonato di sodio 0,04% v /v di formaldeide (soluzione 37%). Lo sviluppo è stato interrotto con 1% v /v di acido acetico, ei gel sono stati lavati tre volte in acqua.
Analisi di immagine e l'analisi statistica
Umax IMAGESCANNER (Amersham Biosciences) è stato utilizzato per la scansione dei gel, mentre immagine master ™ software 2D Versione platino 5.0 (Amersham Biosciences) è stato utilizzato per il rilevamento di posizione, la quantificazione, e la congruenza. L'intensità di ciascun punto è stato quantificato in volume%. I dati sono stati poi analizzati utilizzando SPSS per Windows 11.5 ed Excel. di t-test
è stato utilizzato per analizzare le differenze nei livelli di proteina tra i campioni GCA e non tumorali, con un livello di confidenza del 95%.
MALDI-TOF-MS e ricerca del database
coerente e significativamente differenti per studenti punti selezionati per l'analisi mediante MALDI-TOF MS. macchie proteina di interesse sono stati asportati e macinate in piccoli pezzi seguiti da decolorante e lavaggio con acqua deionizzata per diverse volte fino a quando il colore giallo è scomparso. pezzi di gel furono lavate con 25 mM di bicarbonato di ammonio, disidratato con ACN, ed essiccati in una centrifuga a vuoto. In seguito, le proteine ​​in-gel sono stati digeriti con 0,02 ug /ul tripsina notte a 37 ° C. peptidi triptici stati poi ri-dissolto in una soluzione contenente 50% v /v ACN e 0,2% v /v TFA. A 2 uL porzione è stata macchiato su una piastra campione con 4 uL di soluzione di matrice CHCA (a-ciano-4-hydroxcinnamic acid, 10 mg /ml in 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA) e lasciata all'aria secco. Le macchie secche sono stati poi analizzati in un Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Questo è stato seguito eseguendo spettrometro in modalità ioni positivi e in modalità riflettore con le seguenti impostazioni: tensione di accelerazione, 20 KV; Tensione gride, 94%; guida di tensione del filo, 0,01%; e un ritardo di 200 ns. Gli spettri sono stati acquisiti manualmente con l'intensità del laser fissato a 3200 con 80 colpi al spettro. Poi il range di massa è stato fissato tra m
/z
500 e m
/z
5000. calibrazione interno è stato applicato con angiotensina II e l'insulina B picchi catena a 912,08 Da e 3495,95 Da rispettivamente.
le proteine ​​sono stati identificati dal peptide mass fingerprinting utilizzando il programma di ricerca Aldente [14] con i seguenti parametri di ricerca applicata: SWISS-PROT e TrEMBL sono stati utilizzati come i database di sequenze di proteine; una tolleranza di massa di 100 ppm e una scissione incompleta sono stati autorizzati; carboxyamidomethylation, metionina ossidati, e la fosforilazione sono stati considerati come possibili modifiche; il numero minimo di peptidi corrispondenti era 4; e lo ione peptide era [M + H] +.
tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina utilizzando immunoistochimica e occidentale blot
Per validare i modelli di espressione di tre proteine ​​nei tessuti GCA, immunoistochimica è stata eseguita esemplari che sono stati abbinati con 2-DE campioni. Deparaffinato 5 um sezioni spesse stati trattati con una perossidasi di idrogeno allo 0,3% per 3 min e con un anticorpo di blocco per 30 min. Dopo il calore mediata recupero dell'antigene, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo primario a 4 ° C per una notte come segue: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, l'America), 1: 300; e PRX-2 (Santa Cruz, l'America), 1: 150. Le sezioni sono state poi incubate con un anticorpo perossidasi (1: 500)., Sviluppata con diaminobenzine, e di contrasto con ematossilina
Per l'analisi Western Blot, i campioni di proteine ​​(30 ug) utilizzati in 2-DE sono stati eseguiti il ​​12% SDS-PAGE, trasferiti su membrane PVDF e quindi bloccato con PBS /5% latte scremato /0,01% Tween per 2-4 ore a temperatura ambiente. anticorpo primario è stato diluito in tampone di bloccaggio ed è stato aggiunto come segue: HSP27, 1: 200; HSP60, 1: 300; e PRx-2, 1: 200. Successivamente, è stato incubato con perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpo secondario e un anticorpo HRP-coniugato anti-GAPDH /β-actina per confermare loading proteine ​​uguali in ogni corsia per 1-2 ore a 37 ° C oa temperatura ambiente. I campioni sono stati lavati e rilevati con chemiluminescenza per 30-60 s (Minipore).
Risultati
differenze tra i campioni Profilo LCM navigati e interi tessuti al criostato undissected
Per valutare gli effetti del LCM navigato sui profili di proteina del tessuto, abbiamo eseguito 2-DE profili proteici di interi tessuti al criostato undissected e LCM-campioni di GCA. La Figura 1 mostra un esempio del processo LCM navigato. La maggior parte dei punti rilevati nei tessuti non tumorali e tumorali sezionati potrebbe essere osservato in tutta la tessuti criostato undissected, tranne che per diversi punti. Tuttavia, ci sono ancora alcuni punti si trovano in tutto il tessuto criostato undissected che non poteva essere osservata in entrambi i campioni LCM. Così, questa tecnologia potrebbe non solo arricchire non tumorali e tumorali cellule epiteliali, ma potrebbe anche diminuire la contaminazione nei tessuti, come l'emoglobina [10, 11]. Inoltre, il processo LCM navigato potrebbe eliminare gli effetti di colorazione sulla separazione delle proteine ​​mediante 2-DE [15]. Così, i nostri dati supportano la necessità di eseguire navigata LCM negli studi di proteomica dei tessuti GCA. Figura 1 laser Navigated cattura microdissezione del tessuto tumorale. (A) Ematossilina macchiato gastrica adenocarcinoma cardiale; tessuti (B) senza macchia GCA; (C) del tessuto tumorale dopo microdissezione; (D) Catturato cellule tumorali su pellicola LCM.
Differenze Profilo di espressione della proteina tra i tessuti circostanti GCA e tessuti non tumorali
abbiamo effettuato un LCM navigato e 2-DE per coppie appaiate di tessuti tumorali e non circostante tessuti tumorali di pazienti GCA. Circa 800-1000 spot proteici sono stati rilevati mediante colorazione argento. Per misurare la riproducibilità, ogni campione sottoposto l'esperimento tre volte. Ci sono stati 905 ± 74 e 867 ± 51 spot proteici nella mappa di rispettivamente GCA e del tessuto cardiaco gastrico non-tumorale,. Gli spot sono stati abbinati 799 ± 29 e 727 ± 34 a parte, e il relativo tasso medio corrispondente era 88,2% e il 83,8%. Inoltre, la posizione deviazione media di punti corrispondenti era rispettivamente 1.031 ± 0,205 millimetri e 1,44 ± 0,11 millimetri nella direzione IEF e SDS-PAGE,. Sebbene l'analisi dell'immagine ha mostrato che queste mappe 2-DE erano riproducibili, c'erano piccole differenze nell'intensità e numero di macchie. Tuttavia, l'analisi dei gel ha rivelato 27 spot proteici cui intensità varia notevolmente e costantemente tra non-tumore e tessuti tumorali (Fig. 2). Sono stati calcolati i rapporti di intensità piatte normalizzati di cancro ai tessuti paraneoplasis per ciascuna delle proteine ​​di interesse. sono stati selezionati, i punti che mostrano una differenza di due volte e con significatività statistica (p <0,05). Tre dei risultati 2-DE sono stati confermati da analisi immunoistochimica e Western Blot. Figura 2 2-DE mappa di tessuto cardias maligno e non maligno. Tutte le mappe mostrate sono preparati dallo stesso paziente. (A) 2-DE mappa di interi tessuti criostato undissected; (B) 2-DE mappa di tessuto non tumorale dopo LCM; (C) 2-DE mappa di tessuto GCA dopo LCM. Identificazione
proteine ​​
Entrambe le intere esemplari criostato undissected e LCM-campioni sono stati utilizzati per l'identificazione delle proteine. Ventisette diversi spot proteici tra tessuti GCA e tessuti non tumorali circostanti sono stati asportati. Tuttavia, solo 23 proteine ​​sono state identificate mediante MALDI-TOF-MS (Tabella 2). Questo fenomeno è probabilmente dovuto a modificazioni post-traslazionali come perossiredossina 1 (PRX-1), che era presente in due punti adiacenti (Fig. 2, del punto 11). Queste proteine ​​sono state classificate in una delle seguenti: proliferazione e differenziazione cellulare (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), l'apoptosi (PRX-1, PRX-2, GSTP, VDAC, ETFB), il metabolismo (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), correlato proteasi (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (actina 1, cheratina 8), accompagnatori (Hsp27, 60, 70, PDIA3), e RNA vincolante e trascrizione (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). La figura 3 mostra le mappe PMF di HSP60.Table 2 proteine ​​con l'espressione differenziale tra tessuti tumorali GCA e tessuti non tumorali appaiati adiacenti sono stati identificati da MALDI-TOF MS
up-regulation proteine ​​
Spot No.
proteico
adesione No.A)
Signor /PIB)
corrispondenti a
Cov (%) c)
T-test
Razione (tumore /non-tumorale) significa ± SD
1 proteina heat-shock beta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6.0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727 2
scossa di calore 70 kDa proteina 5 (HSP70)
P11021
70 /5.0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314 3
60 kDa proteina heat shock (HSP60) *
P10809
58 /5.2
12
37
0.0001
2,8308 ± 1,1426 4
proteina disolfuro isomerasi A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5.6
13
41
0,0280 4,2105
± 2,7294
5
annessina A4 (ANXA4)
P09525
36 /5.8 10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
annessina A2 (ANXA2)
P07335
38 /7.5 7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431 7
eterogeneo ribonucleoproteins nucleari A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9.0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
catepsina D catena pesante (CTSD)
P07339
27 /5.6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
proteina chinasi C e caseina chinasi substrato nei neuroni della proteina 1 (PACSIN1)
Q9BY11
51 /5.1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147 10
glutatione S-transferasi P (GSTP) *
P09211
23 /5.4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
perossiredossina-1 (PRX-1) *
Q06830
22 /8.3 Pagina 8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) -di legame protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6.7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-cheto reduttasi famiglia 1member C3 (AKR1C3)
P42330
37 /8.1 7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 /6.4 Pagina 8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
cheratina, tipo II citoscheletro 8 (cheratina 8) *
P05787
54 /5.5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
down-regulation proteine ​​
16
actina , citoplasmatici 1 (actina 1) *
P60709
42 /5.3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
ribonucleoproteins nucleari eterogenei H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
perossiredossina-2 (PRX-2) *
P32119
22 /5.7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
carbonico anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6.8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
alfa-enolasi * (ENO1)
P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alcol deidrogenasi 1C (ADH1C)
P00326
40 /8.6 7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Electron trasferimento flavoproteina subunità B (ETFB)
P38117
28 /8.3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
voltaggio-dipendenti anione canale -selettivo (VDAC) *
P21796
31 /8.6 7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot adesione n.
b ) valore teorico
c) copertura Sequenza%
* Le proteine ​​sono stati trovati nel carcinoma gastrico in precedenza.
Figura 3 identificazione MALDI-TOF MS di spot 3 in GCA.
immunoistochimica e occidentale blot per HSP 27, 60, e PRX-2 in GCA
per indagare ulteriormente se HSP27, 60, e PRX-2 sono espressi nei tessuti e per determinare quali cellule esprimono queste proteine, analisi immunoistochimica è stata effettuata utilizzando fissati in formalina e paraffinato campioni di tessuto embedded che sono stati abbinati con 2-DE campioni. L'espressione di HSP27 e 60 potrebbe essere visto in tutte le citoplasma di cellule di carcinoma, mentre potrebbe essere visto in alcune delle cytoplasms di epiteliale colonnare (Fig. 4A-D) in tessuti non tumorali. Al contrario, PRx-2 era quasi non trovata essere espresso nelle cellule di carcinoma ma in alcune delle citoplasma delle cellule epiteliali colonnari (Fig. 4E, F). Per esaminare questi livelli di espressione della proteina, analisi western blot è stata eseguita anche utilizzando gli stessi tessuti (Fig. 5). Come previsto, HSP27 e 60 sono stati trovati ad essere costantemente altamente espresso nel tessuto tumorale, mentre PRX-2 è stato soppresso. Figura 4 Analisi immunoistochimica per HSP27, 60, e PRx-2 in normale cardias umana e GCA. Espressione di HSP27 (A), 60 (C), e PRx-2 (E) erano nel citoplasma delle cellule tumorali; Espressioni di HSP27 (B), 60 (D) e PRX-2 (F) sono stati trovati in citoplasma delle cellule epiteliali normali colonnari; Ingrandimenti: A-F × 40, di contrasto con ematossilina
Figura 5 analisi Western Blot per convalidare l'aumentata espressione di HSP27, 60, e diminuita espressione di PRX-2 nei tessuti GCA.. . GAPDH e β-actina sono state usate come riferimenti
Discussione
Cardia è il confine anatomica tra l'esofago e lo stomaco; di conseguenza, non vi è costante polemica riguardante il loro rapporto in termini di epidemiologia, caratteristiche cliniche e classificazione tra adenocarcinoma esofageo (EA), GCA, e DGA. Per confrontare i loro profili proteici, abbiamo cercato la letteratura per trovare queste proteine. Tredici su 23 proteine ​​sono state trovate in DGA precedentemente (Tabella 2). Tra questi, HSP27, 60, 70, PDIA3 e CA2 hanno lo stesso pattern di espressione in GCA e DGA. Al contrario, l'espressione di basso livello di HSP27 è stato trovato in EA [16-20]. Pertanto, la tumorigenesi di GCA è diverso da EA e DGA, e quindi GCA deve essere un'entità patologica distinta.
Eterogeneità cellulare è stato un ostacolo significativo per l'analisi molecolare dei tessuti normali e malati. In primo luogo descritto da Emmert-Buck et al. nel 1996, microdissezione laser è una tecnica potente e preciso utilizzato per studiare i cambiamenti proteine ​​in un particolare sottoinsieme di cellule in un sistema a bassa manutenzione che è facile da utilizzare [8]. Come di consueto, varie macchie istochimiche della sezione di tessuto sono utilizzati per guidare il processo di dissezione. Tuttavia, molti casi hanno mostrato moderato a effetti drammatici di colorazione sulla separazione delle proteine ​​mediante 2-DE [21, 22]. Per eliminare la colorazione come potenziale effetto negativo, Navigated LCM è stato sviluppato di recente. Esso utilizza una sezione macchiato per guidare la dissezione del campione adiacenti senza macchia [23]. Questa tecnica è stata applicata con successo nello studio di campioni cerebrali [15]. Inoltre, a causa delle caratteristiche tipiche morfologiche del gastrica cardiaca cellule colonnare superficiale e la ghiandola cardiaca, sono facili da identificare su una sezione disidratato senza colorazione. Pertanto, LCM navigato diventata una strategia di ottica nel nostro approccio di proteomica. In questa ricerca, il numero di cellule maligne e maligne LCM-derivati ​​varia in modo sostanziale e erano spesso piccole rispetto con tutto il tessuto criostato undissected, nonostante i profili che erano molto simili tra i campioni LCM e quelli undissected. Ciò indicava che il LCM navigato può essere un approccio fattibile per lo studio del tessuto cardiaco gastrico e che sia compatibile con 2-DE e MALDI-TOF MS.
Abbiamo ottenuto il profilo proteico di GCA comparando le variazioni nella proteina profili dei tessuti circostanti non tumorali. Per ridurre le differenze individuali, campioni di tessuto sono stati ottenuti dallo stesso paziente, che ci permette di studiare l'espressione della proteina differenziale sotto simile sfondo genomico. Per quanto a nostra conoscenza, abbiamo riportato la prima analisi proteomica di GCA. Dei 27 spot proteici selezionati, 23 proteine ​​nell'intervallo massa molecolare da 15 a 75 kDa e con un punto isoelettrico tra 3 e 10 sono stati identificati mediante 2-DE e MALDI-TOF MS. La maggior parte di queste proteine ​​sono state descritte in precedenza come differenzialmente espressi sia a livello di mRNA che a livello proteico in altri tipi di cancro umano.
HSP sono un gruppo di proteine ​​da stress indotti da vari tipi di insulti ambientali e fisiopatologici. In questo studio, co-up-regolazioni di HSP27, 70, e 60 sono stati trovati nei tessuti tumorali cardiaci gastriche. Come accompagnatori, HSP27 e HSP70 potrebbe inibire l'apoptosi interagendo con apoptosoma e la caspasi del complesso di attivazione [24], sottolineando il loro ruolo nella progressione del tumore e la resistenza al trattamento [25]. Numerosi studi indicano che Hsp27 e HSP70 overexpressions segnalano una prognosi sfavorevole e prevedono una scarsa risposta alla chemioterapia. HSP60 sembra essere una chiave di mediatore infiammatorio endogeno ed è presumibilmente rilasciata dalle cellule danneggiate. Inoltre, insieme con HSP70, HSP60 ha un ruolo nella presentazione dell'antigene in malattie maligne [26]. HSP sono anche sovraespresso in seno, del colon-retto, dello stomaco, della prostata e carcinomi [10, 25]. Pertanto, sovraespressione di HSP27, 70 e 60 può essere biomarcatori utili per la carcinogenesi a GCA e può essere associato con il grado di differenziazione e la prognosi di GCA. Con gli proteine ​​identificate, due proteine ​​sono coinvolte nella regolazione della trascrizione e espressione di geni associati al tumore. PCBP1, up-regolato in GCA, è un regolatore post-trascrizionale RNA chaperone. È stato dimostrato che PCBP1, insieme con PTB-1 e hnRNPK, controlla alcuni geni proto-oncogene e geni espressione apoptosi-related come Bag-1, c-
myc, Apaf-1, XIAP e DAP5, stimolando l'attività del segmento entry ribosoma (IRES). PCBP1 è necessaria per aprire la RNA nella regione contenente la finestra di entrata ribosoma, mentre PTB-1 può essere richiesto per il reclutamento ribosoma [27, 28]. Recentemente, Pickering, B.M. et al. descritti che le parti glycan di PCBP1 potrebbero essere correlati alla capacità metastatica e potrebbero giocare un ruolo nella metastasi del carcinoma epatocellulare [27]. Poi l'up-regolazione di PCBP1 può disciplinare il meccanismo di cap-indipendente inizio della traduzione di cardiaci geni associati al tumore nello sviluppo di GCA. Come un soppressore del tumore, alfa-enolasi può regolare l'attività del promotore c-myc in forma di una proteina di legame c-myc (MBP-1). MBP-1 può quindi associare all'elemento P2 nel promotore c-myc e competere con la proteina legante TATA-box (TBP) per sopprimere la trascrizione di c-myc [29, 30]. D'altra parte, down-regolazione di alfa-enolasi è conforme con il lavoro di Chang YS et al.

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