Proteome analizė žmogaus skrandžio CARDIA adenokarcinoma lazeriniu surinkimo microdissection

proteomos analize žmogaus skrandžio CARDIA adenokarcinoma lazerio surinkimo microdissection pervežimas tezės
Background Viesbutis The skrandžio širdies adenokarcinomos atvejų (GCA) didėjo per pastaruosius du dešimtmečius Kinijoje, bet molekulinės pokyčiai, susiję su kancerogeninio poveikio nebuvo gerai charakterizuojamas.
metodai
šiame tyrime mes naudojome lyginamąją proteo požiūrį analizuoti piktybiniai ir nonmalignant skrandžio CARDIA epitelio ląstelių išskiriamas navigacija lazerinis surinkimo microdissection ( LCM) iš suporuotų chirurginių egzempliorių žmogaus GCA.
rezultatai
dvidešimt septynių taškų, atitinkančių 23 baltymų buvo nuosekliai diferencijuotai reguliuoti. buvo parodyta penkiolika baltymai turi būti iki reguliuojama, o aštuoni baltymai buvo įrodyta, kad būti žemyn reguliuojama piktybinių ląstelių, lyginant su nonmalignant kolonų epitelio ląstelių. Nustatytos baltymai pasirodė dalyvauja metabolizmo, palydovas, antioksidacinių, signalo perdavime, apoptozės, ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją. Be to, išraiškos HSP27, 60, ir PRX-2 GCA egzempliorių buvo toliau patvirtina imunohistocheminio ir Vakarų dėmė analizes.
Išvada
Šie duomenys rodo, kad navigacija LCM kartu su 2-DE suteikia veiksmingą strategiją atrasti baltymus, kurie skirtingai išreikštas GCA. Tokie baltymai gali prisidėti nušviečiantis molekulinius mechanizmus GCA kancerogenezėje. Be to, derinys užtikrina galimą klinikinę biologinius žymenis, kad pagalba ankstyvam ir pateikti galimą terapinį tikslus.
Background
analizių vėžio atvejų duomenų brokuotų iš Vakarų šalių, parodė sparčiai kylančios kainos adenokarcinomos stemplės ir skrandžio Cardia į pastaruosius kelis dešimtmečius, palyginti su stabilių ir mažėjančių tarifų stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma (SCC) ir distalinės skrandžio adenokarcinoma (DGA) [1-3]. Šis reiškinys taip pat matyti iš Kinijos, išskyrus tai, kad didėja sergamumas skrandžio CARDIA adenokarcinoma (GCA) atrodo pastebimai didesni nei stemplės vėžio atvejų. Duomenys rodo, kad GCA yra atskira klinikinė subjektas, kaip jos patogenezę ir rizikos veiksniai yra gana skiriasi nuo DGA. Todėl GCA yra daug labiau paplitę, su didesniu limfmazgių metastazių ir blogesne prognoze nei DGA [4]. Metinis dažnis GCA 50 /100,000 ir net gali būti toks didelis, kaip 190 /100,000 keliuose regionuose Kinijos [5]. Santykinai simptomų pobūdis ankstyvuoju ligos ir adekvačiu išankstiniu patikrinimu bandymų trūkumas lėmė iš GCA pacientams, kuriems diagnozuotas būti ne taip jau pažengęs ligos balsų dauguma. Tokiu būdu, ji yra būtina suprasti molekulinį mechanizmą kancerogenezėje ir nustatyti biologiniai žymenys už anksti diagnozuojant ir veiksmingai gydyti žmogaus GCA.
Pastaruoju metu Proteome iškilo kaip komplemento komponentę genomo. Prielaida yra ta, kad jis gali drastiškai padėti ardymas biocheminius ir fiziologinius mechanizmus sudėtingų daugiamatis ligų funkcine molekulinio lygio. Nors genų mutacija ir /ar klystantis genų ekspresija gali grindžiami liga, biocheminiai pagrindai daugeliu ligų sukelia baltymų defektų. Todėl, pasaulio baltymų gausa žmogaus navikų analizė, vadinamas vėžio proteomiką, galėtų pasiūlyti daug galimybių ir iššūkių nustatant naujų naviko žymenų ir terapinių tikslų, taip pat suprasti naviko patogenezę. Šiuo metu, dviejų dimensijų gelio elektroforezės (2-DE) ir masių spektrometrija (MS) yra labiausiai plačiai naudojama įrankiai atskirti ir nustatyti baltymų. Tačiau heterogeniškumas visada tyrimuose žmogaus naviko audinyje rūpestis. Nors ląstelių kultūra yra vienas iš būdų išspręsti šią problemą, jis gali tiksliai atspindi molekulinius renginius, vykstančius faktinio audinio, iš kurio jie buvo gautas [6]. Palyginus žmogaus prostatos ląstelių linijų ir vėžinių ląstelių iš tos pačios pacientai, parodė, kad 20% iš baltymų profiliai buvo pakeista [7]. Lazerinis surinkimo microdissection (LCM) yra nauja tendencija, kuri gali būti naudojama siekiant įsigyti labai reprezentatyvi pogrupis ląstelių iš sudėtingų nevienalyčių audinių [8] pavyzdžius. Ši technologija buvo naudojamas labai sėkmingai įvairių masyvas tyrimai, naudojant pasroviui analizę tuo DNR ir RNR lygio, įskaitant pasaulinė genų ekspresijos profiliavimo [9] ir analizuoja iš prostatos [7], storosios žarnos [10], kepenų ląstelių [11 proteomos ], krūties [12], ir kasos navikai [13]. Tačiau 2-DE ir MS derinys niekada nebuvo taikomi prie žmogaus GCA tyrimo.
Šis tyrimas siekia nusakyti GCA kancerogenezės ir nustatyti GCA-konkrečioms ligoms susijusių baltymų, kaip potencialių klinikinių biologinių žymenų, ankstyvas ir naujų terapinių tikslų. Mes atlikome navigacija LCM praturtinti tiek piktybiniai ir nonmalignant skrandžio širdies epitelyje ląsteles nuo suporuotas chirurginių egzempliorių žmogaus GCA. Išskirta iš šių ląstelių baltymai buvo atskirti 2-DE. Diferencialinės baltymų dėmės buvo identifikuojama peptidas masinio pirštų atspaudų (PMF), remiantis matricos servo lazerio desorbcijos /jonizacijos laiko ir orlaivio masės spektrometrija (MALDI-TOF MS) ir duomenų bazių paieškos. Šių išvadų pagrįstumas buvo patvirtintas Imunohistocheminiais ir Vakarų dėmė analizes.
Metodai
medžiagos
VVG juostos (pH 3-10 netiesinė) ir VVG buferiniai tirpalai (pH 3-10 netiesinė) buvo perkamos iš Amersham Pharmacia Biotech "(APB", Švedija). DDT, karbamido, -tiokarbamidą, tri bazę, TX-100, chaps, glicinas, akrilamido, metilenbisakrilamido SDS, TEMED, amonio persulfate, sidabro nitratas, Tripsinas (sekos laipsnio), ACN ir TFA buvo įsigytas iš Sigma (St. Louis, MO, JAV). Galiausiai, visiškai proteazės inhibitorius kokteilis buvo iš Roche (Lewes, Jungtinė Karalystė). Milli Q tinkantis vanduo buvo naudojamas visų sprendimų.
GCA mėginiai
Devyni porų žmogaus skrandžio CARDIA adenokarcinoma ir jų gretimų nontumourous CARDIA audinius buvo gauti per 30 minučių po chirurginės rezekcijos antrame susijusi ligoninę XI " Jiaotong universitetas 2005 metais (1 lentelė). Tam, kad būtų išvengta matomų sritis opa arba nekrozės, mėginiai buvo gaunami iš navikų kraštų. Jie buvo nedelsiant užšaldomos skystame azoto ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol naudojimo. Informuoti sutikimai buvo gauti iš visų pacientų. Tuo tarpu, du patyrę patologai įvertino naviko rūšiavimas pagal mikroskopiškai analizuojant samples.Table 1 Klinikinės ir histologinių duomenų pacientų navikų mėginiuose
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm seks
1,5 × 2
Vidutiniškai diferencijuoti
2
63
m
per 2 cm seks
5 × 6
Vidutiniškai diferencijuoti
3
46
m
Per 2 cm seks
4 × 5
Vidutiniškai diferencijuoti
4
60

M Per 2 cm seks
2 2,5
× Na diferencijuotas
5
73
m
per 2 cm seks
3 × 1
Na diferencijuotas
6
70
m
per 2 cm seks
2 × 1
Na diferencijuotas
7
55
m
Per 2 cm seks
2 × 3
Prastai diferencijuotas
8
51
m
Per 2 cm seks

blogai diferencijuotą
4 × 6
9
63
M Per 2 cm apie seks
3 × 2,5
blogai diferencijuotą
a) iš kur: epicentras naviko audinyje
Mėginio paruošimas LCM
skirsniuose (8 um storio) buvo sumažinti ant skaidres (precleaned naudojant ploviklį, plauti dejonizuotu vandeniu ir artimųjų etanolio), naudojant "Leica CM 1900 kriostatas (temperatūra kameroje -28 ° C). Skyriai arba buvo saugomi -80 ° C arba laikomi Kriostatas kameroje prieš LCM. Hematoksilinu dažymo buvo atliktas tik stebėti audinių skyriuose ir nebuvo naudojamas kartu su LCM. Skyriai buvo fiksuotas (70% etanolio 1 min), hematoksilinu tamsintas ir dehidracija (70% etanolio 45 S, 95% etanolio ir 45 metų, 2 × 100% etanolyje 30s ir po ksileno 2 × 5 min). Tuo tarpu, nedažytų skyriai buvo naudojami LCM. Jie buvo fiksuotas (70% etanolio ir 30s), išplautos dejonizuoto vandens 10s ir dehidracija (70% etanolio ir 15s, 95% etanolio ir 15s, 2 × 100% etanolyje 15s ir po ksileno 2 × 1 min ). Užbaigti proteazės inhibitorius kokteilis tabletės buvo
navigacija LCM
Po nustatymo ir dehidratacija, nedažytų skyriai buvo džiovinami ore ir microdissected naudojant Arktūras PixCellα sistemą (Arcturus, Mountain View, CA, JAV). LCM mikroskopas Nuimti labai hematoksilinu tamsintas skyrių greta vienas interesus. Šis paveikslėlis buvo rodomas LCM kompiuterio ekrane naudojant LCM Vaizdo analizės programinė įranga (Arcturus, JAV) ir buvo naudojamas kaip žemėlapyje atriboti skrodimui regioną gretimo nedažytų skyriuje. Tuomet skyriai buvo perimta naudojant 15 um skersmens lazerio spindulį paprastai 50-80 mV galia su impulso trukme 3-10 ms kulkosvaidžio režimu ir lazerio šaudymo dažnis 1 smūgis per 500 ms. Vidutiniškai, tarp 10,000-12,000 kadrai buvo paimti už dangteliu ir maždaug 25,000-30,000 ląstelės buvo gautos už dangtelio. Kiekvienas dangtelis buvo perimta per vieną valandą. Remiantis kruopščiai peržiūros histologiniai sekcijas, kurių kiekviena skrodimo buvo apskaičiuota, kad yra ≥ 95% pageidaujamų ląsteles.
Microdissection kepurės buvo įdėtas į 0,5 ml Mikrocentrifuga vamzdžių, kuriuose yra 50 UL lizės buferyje (7 M karbamidas, 2 M -tiokarbamidą, 4% m /v žandikauliais, 65 mm DDT,% prieš 0,5 /VTX-100, 40 mMTris bazė, ir visiškai proteazės inhibitorius kokteilio). Po to ląstelės buvo ištirpinami apverčiant vamzdžių, po to sūkurio-maišymo 1 min ir trumpas impulso-centrifuguojant 12, 000 × g. Vėliau, audiniai iš kelių kepurės (apie 800.000 ~ 1.000.000 ląstelių) buvo paimti į tą pačią lizės buferiniame tirpale, kol pakankamai medžiagos buvo surinktos. Mėginiai buvo centrifuguojamas 40.000 × g 1 valandą, esant 4 ° C temperatūroje. Jei reikia, supernatantų, buvo laikomi -80 ° C temperatūroje, kol tolesniam naudojimui. Baltymų koncentracija buvo nustatoma pagal Bradfordo metodu.
2-DE
pirmojo matmenų Izoelektrinis fokusavimas (ief) buvo atliktas Pharmacia Immobiline VVG DryStrip sistemos (Uppsala, Švedija). Pirmą aspektą elektroforezės mėginiai, kuriuose yra 60 ug baltymai analizės geliai buvo praskiestas iki 250 ul su rehidratavimo tirpalo (7 M karbamido, 2% w /v CHAPS, 50 mM DTT,% prieš 0,5 /t, IPG buferio (pH 3-10 netiesinė), ir mikroelementų Bromfenolio mėlyna) prieš pakraunant į 13 cm IPG juostelėmis (pH3-10 netiesinių). tada Šlapimo nelaikymo epizodų dažnis buvo atliekama naudojant IPGphor elektroforezės bloką pagal gamintojo instrukcijas. Po to, rėžiai pusiausvyrini su tirpalu, (6 M karbamido, 30% v /v glicerolio, 2% m /v SDS, ir 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), yra redukuojamas su 1% w /v DTT 15 min , ir alkilinta, su 2,5% m /v iodoacetamide 15 min. tada juostelės buvo perplaunamos elektroforezės buferiu (25 mM Tris-bazinės, 192 mM glicino, ir 0,1% m /v SDS), taikomas 11% akrilamido gelyje, ir apgaubtas lydytu agarozės (0,5% w /v agarozės elektroforezės buferis turinčioms pėdsakas bromfenolio mėlyna). SDS-PAGE atliekami naudojant HOEFER SE 600 vertikali kameros ir tri-glicino buferis (25 mM Tris ir 192 mM glicino), kuriame yra 0,1% m /v SDS, su pradinio atskyrimo esant pastoviam 10 mA /gelio 30 min, po to 20 mA /gelis. Antra-matmenų SDS-PAGE buvo sukurtas tol, kol bromfenolio mėlynasis dažų gaudantis pasiekė apatinėje gelio. Bendras veikimo laikas buvo paprastai nuo 4 iki 4,5 val. Geliai buvo fiksuoti% v 10 /prieš acto rūgšties, 40% v /v etanolio prieš įjautrinimo 30 min buferyje, kuriame yra 30% v /v etanolio, 0,2% m /t natrio tiosulfato, ir 0.83 M natrio acetato. Tai buvo po tris 15 min plovimų į dejonizuoto vandens. tada baltymai buvo tamsintas su 0,1% w /v sidabro nitrato 20 min, plauti du kartus dejonizuoto vandens 1 min, ir sukūrė 2,5% m /t natrio karbonatas, kurio sudėtyje 0,04% v /v formaldehido (37% tirpalas). Plėtros, kuri buvo sustabdyta su 1% v /v acto rūgšties, ir geliai tris kartus buvo plaunamos vandeniu.
Vaizdo analizė ir statistinę analizę
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) buvo naudojami nuskaityti gelių, o vaizdo Master ™ 2D Platina Versija 5.0 programinė įranga (Amersham biomokslai) buvo naudojamas taškiniam aptikimo, kiekybinio ir atitikimo. Kiekvieno vietoje intensyvumas buvo įvertintas, tūrio%. tada duomenys buvo analizuojami naudojant SPSS for Windows 11.5 "ir" Excel. Stjudento t
-test buvo naudojamas analizuoti į baltymų koncentracijos tarp GCA ir ne navikų mėginiuose skirtumus, su patikimumo lygis yra 95%.
MALDI-TOF MS ir duomenų Paieška
nuosekliai ir gerokai skiriasi dėmės pasirinktas analizės MALDI-TOF MS. Baltymų dėmės objektai buvo pašalintų ir malta į mažus gabaliukus, po to blukinimo ir plovimo dejonizuotu vandeniu kelis kartus, kol geltona spalva dingo. tada Gelio vienetų buvo skalaujami 25 mm amonio hidrokarbonato, dehidratuoti su ACN ir džiovinti vakuuminėje centrifuguojama. Po to, baltymai, esantys-gelio buvo suardomas su 0,02 ug /ul tripsino per naktį 37 ° C temperatūroje. Triptinius peptidai buvo tada iš naujo ištirpinamos tirpalo, susidedančio iš 50% v /v ACN ir 0,2% v /v TFA. A 2 mkl alikvotinė buvo pastebėtas ant mėginio plokštelės su 4 ul adatinių tirpalo CHCA (a-ciano-4-hydroxcinnamic rūgšties, 10 mg /ml, o 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA) ir leidžiama į orą sausas. Išdžiovintas dėmės buvo analizuojami Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, JAV). Tai buvo po veikia teigiamai jonų režimu ir į atšvaitą režimu su šiais nustatymais spektrometras: greitinimo įtampa, 20 kV; girgždesys įtampa, 94%; Gido kabelis įtampos, 0,01%; ir 200 ns vėlavimas. Spektrai įsigijo patys su lazerio intensyvumas, nustatyta 3200 80 kadrų per spektrą. Tada masė asortimentas buvo nustatyti tarp m
/z pervežimas 500 ir m
/z
5000. Vidaus kalibravimas buvo taikomas naudojant Angiotenzinas II ir insulino B grandinę pikus 912.08 Da ir 3495.95 DA, atitinkamai.
baltymai buvo nustatyti peptidų masinio pirštų atspaudų naudojant paieškos programą Aldente [14] su taikomi šie paieškos parametrai: Swiss-PROT ir TrEMBL buvo naudojamas kaip baltymų sekų duomenų bazių; masė tolerancija 100 ppm ir vieną nepilną skilimo buvo leista; carboxyamidomethylation, oksiduoti metioninas ir fosforilinimo buvo laikomi galimais pakeitimais; minimalus skaičius suderintų-peptidų buvo 4; ir peptidas jonų buvo [M + H] +.
Imunohistocheminis ir Vakarų dėmė analizė
patvirtinti išraiškos būdus trijų baltymų GCA audinių, imunohistocheminis buvo atliekama naudojant formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų audinio egzemplioriai, buvo suderinta su 2-DE pavyzdžių. Devaškuoto 5 um storio sekcijos buvo gydomi 0,3% vandenilio peroksidazės 3 min ir su blokavimo antikūno 30 min. Po terminio-tarpininkaujant antigeno gavimą, dalys buvo inkubuotos su pirminiais antikūnais, esant 4 ° C temperatūroje per naktį taip: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, JAV), 1: 500; Hsp60 (Santa Krusas, Amerika), 1: 300; ir PRX-2 (Santa Krusas, Amerika), 1: 150. tada skyriai buvo inkubuojamos su peroksidazės žymėto antikūnų (1: 500)., sukurta su diaminobenzine ir counterstained hematoksilinu
Dėl Vakarų dėmė analizę, baltymų mėginius (30 UG), vartojamas 2-DE buvo paleisti 12% SDS-PAGE, perkeliamas ant PVDF membranų, ir tada užblokuotas su PBS /5% lieso pieno /0,01% Tween 2-4 valandas kambario temperatūroje. Pirminis antikūnas buvo praskiesto blokuojančiu buferiu ir buvo pridėtas, kaip nurodyta: HSP27, 1: 200; Hsp60, 1: 300; ir PRX-2, 1: 200. Po to, ji buvo inkubuojamos su krienų peroksidazės (HRP) konjuguoto vidurinį antikūną ir HRP-konjuguoto anti-GAPDH /ß-aktino antikūną patvirtinti vienodą baltymų pakrovimo į kiekvienai juostai 1-2 valandas 37 ° C arba kambario temperatūroje. Bandiniai buvo plaunami ir aptiktos su padidintu cheminės liuminescencijos 30-60 s (Minipore).
Rezultatai
profilis skirtumus navigacija LCM pavyzdžius ir visą undissected Kriostatas audinių
įvertinti navigacija LCM poveikį profilių audinių baltymų, mes atliekame 2-dE baltymų profilius visai undissected kriostatas audinių ir LCM-pavyzdžių GCA. 1 paveiksle matyti kad, navigacija LCM proceso pavyzdys. Dauguma aptikta išpjaustytų ne naviko ir navikų audiniuose, dėmės gali būti pastebėta, kad visos undissected Kriostatas audinių, išskyrus keletą dėmių. Tačiau vis dar yra keletas vietų rasti visai undissected Kriostatas audinio, kuris negalėjo būti laikomasi abiejų LCM pavyzdžius. Tokiu būdu, ši technologija gali ne tik praturtinti ir ne auglio ir auglio epitelio ląsteles, bet taip pat galėtų sumažinti audiniuose užteršimo, kaip hemoglobino [10, 11]. Be to, navigacija LCM procesas gali pašalinti dėmių poveikį baltymų atskyrimo 2-DE [15]. Taigi, mūsų duomenys patvirtina, kad būtina atlikti navigacija LCM į proteominius studijų GCA audiniuose. 1 pav navigacija lazerinis surinkimo microdissection naviko audinyje. (A), hematoksilinu tamsintas skrandžio CARDIA adenokarcinoma; (B), nedažytų GCA audinių; (C) Naviko audinių po microdissection; (D), Nufotografuota auglio ląsteles LCM filmas.
Profilis skirtumus baltymų raiškos tarp GCA audinių ir aplinkinių ne navikų audiniuose
Mes atlikome navigacija LCM ir 2-DE už suderintų porų navikų audiniuose ir aplinkinių ne- navikų audiniuose, iš GCA pacientų. Maždaug 800-1000 baltymų dėmės buvo aptikta sidabrine žyme. Norint išmatuoti atgaminimas, kiekvienas mėginys buvo atlikta eksperimentą tris kartus. Nebuvo 905 ± 74 ir 867 ± 51 baltymų dėmes į GCA ir ne naviko skrandžio širdies audinio, atitinkamai žemėlapyje. Suderintos dėmės buvo 799 ± 29 ir 727 ± 34 atskirai ir atitinkamas vidutinis atitikimo lygis buvo 88,2%, o 83,8%. Be to, vidutinė pozicija nuokrypis suderintų dėmės buvo 1,031 ± 0,205 mm, o 1,44 ± 0,11 mm, ief ir SDS-PAGE kryptimi, atitinkamai. Nors vaizdas analizė parodė, kad šių 2-DE žemėlapiai buvo atkuriamas, ten buvo šiek tiek skiriasi intensyvumu ir skaičiaus dėmės. Nepaisant to, gelių analizė atskleidė 27 baltymų dėmes, kurių intensyvumas kinta iš esmės ir nuolat tarp ne auglys ir navikų audiniuose (2 pav.). Apskaičiuoti normalizuotų vietoje intensyvumo vėžio paraneoplasis audinių kiekviena interesų baltymų santykis. Dėmės, rodantys dvejopas skirtumą ir statistinio reikšmingumo (p < 0,05) buvo atrinkti. Trys iš 2-DE rezultatus patvirtino imunohistocheminis ir Vakarų dėmė analizes. 2 pav 2-DE žemėlapis piktybiniai ir nonmalignant skrandžio CARDIA audinio. Visi žemėlapiai parodyta yra ruošiami iš to paties paciento. (A), 2-DE žemėlapis neskaldytų undissected Kriostatas audiniuose; (B) 2-DE žemėlapis ne-naviko audinio po LCM; (C) 2-DE žemėlapis GCA audinio po LCM.
Baltymai identifikavimo
abiejų visą undissected Kriostatas egzempliorių ir LCM-egzempliorių buvo naudojami baltymų identifikavimui. Dvidešimt septynių skirtingų baltyminių dėmių tarp GCA audinių ir aplinkinių ne navikų audiniuose buvo pašalintų. Tačiau, tik 23 baltymai buvo žymimas MALDI-TOF-MS (2 lentelė). Šis reiškinys yra greičiausiai dėl potransliacinis pakeitimų, pavyzdžiui, peroxiredoxin 1 (PRX-1), kuris buvo esančių dviejų gretimų dėmės (2 pav., Vietoje 11). Šie baltymai buvo suskirstyti į bet kurią iš šių: ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptozė (PRX-1, PRX-2, GSTP, VDAC, ETFB), medžiagų apykaitos (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), proteazės susijęs (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (aktino 1, Keratino 8), šaperonų (HSP27, 60, 70, PDIA3) ir RNR privalomas ir transkripcija (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). 3 paveiksle matyti, PMF žemėlapius HSP60.Table 2 baltymai, diferencinė ekspresija tarp GCA navikų audiniuose bei gretimų suporuotas ne navikų audiniuose buvo identifikuojami pagal MALDI-TOF MS
Iki reguliavimą baltymai

vietoje Nr
baltymai
prisijungimas No.a)
MR /PIB)
atitikimo
cov (%); c)
, T-testas
racionas (naviko /ne auglys) reiškia ± SD
1
šilumos šoko baltymas beta 1 (HSP27) *
P04792
23 /6,0
9
54
0,0040
3,4279 2,0727
2
± Šiluminio šoko 70 kDa baltymas 5 (HSP70)
P11021
70 /5,0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314
3
60 kDa šilumos šoko baltymas (Hsp60) *
P10809
58 /5,2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426
4
proteino disulfido izomerazė A3 (PDIA3) *
P30101
54 5.6
/13
41
0,0280
4,2105 ± 2.7294
5
aneksino A4 (ANXA4)
P09525
36 5.8
/10 34
0,0140
4,7153 7,3434
6
± aneksino A2 (ANXA2)
P07335
38 7.5
/7
26
0,0150 5,5431
7
6,0722 ± Heterogeninės branduolinės ribonucleoproteins A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9,0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
katepsino D sunkiosios grandinės (CTSD)
P07339
27 12
/5.6
baltymų kinazės C kazeino kinazės substratas neuronuose baltymas 1 (PACSIN1)
Q9BY11
61
0,0012
3,7703
9
4,3552 ± 51 /5,1
5
24
0,0028
1,2147 10
2,6026 ±
glutationas S-transferazės P (GSTP) *
P09211
23 /5,4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-1 (PRX-1) *
Q06830
22 /8,3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
poli (RC) -binding protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6,7
12
63
0.0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-keto reduktazės šeimos 1member C3 (AKR1C3) pervežimas P42330
37 /8,1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM)
P50440
44 6.4
/8 23
0,0390 15
2,7839 ± 0,4680
Keratino, II tipo Citoskeletas 8 (Keratino 8) *
P05787
54 5.5
/9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
down-regulation baltymai
16
aktino , citoplazmos 1 (aktino 1) *
P60709
42 5.3
/6 30
0,2603 0,1539
17
0,0160 ± Heterogeniniai branduolinės ribonucleoproteins H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6,4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (PRX-2) *
P32119
22 5,7
6
/24 0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
Anglies anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6,8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alfa-enolase * (ENO1)
P06733
47 /7,0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alkoholio dehidrogenazės 1C (ADH1C)
P00326
40 /8,6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
elektrono pernašos flavoprotein b subvieneto (ETFB)
P38117
28 8.3
/6
26
0,0240 0,1415 23
0,2655 ±
įtampos priklausomų anijonas -selective kanalas (VDAC) *
P21796
31 8.6
/7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Šveicarijos Prot prisijungimas Nr.
b ) teorinė vertė
c) seka aprėptis%
* baltymai buvo rasta skrandžio vėžio anksčiau.
3 paveikslas MALDI-TOF MS identifikavimą vietoje 3 iš GCA.
Imunohistocheminis ir Vakarų dėmė analizė HSP 27, 60, ir PRX-2 GCA
toliau tirti, ar HSP27, 60, ir PRX-2 yra išreikštas audinių ir nustatyti, kurie elementai išreikšti šiuos baltymus, imunohistocheminis analizė atlikta naudojant formalinu fiksuotos ir paraffin- įterptųjų audinio mėginiai, kurie buvo suderinta su 2-DE pavyzdžių. Iš HSP27 ir 60 išraiška gali būti vertinamas visose ląstelėse Vėžys cytoplasms, o tai galėtų būti vertinama kai kurių kolonų epitelio (pav. 4A-D) cytoplasms nepriklausančiose navikų audiniuose. Priešingai, PRX-2 buvo beveik nebuvo nustatyta, kad būti išreikšta karcinoma ląstelių, o į kai kurias pagalbines kolonų epitelinių ląstelių (pav. 4E, F) cytoplasms. Patikrintų šiuos baltymo ekspresiją lygius, Western blot analizė taip pat buvo atlikta naudojant tuos pačius audinius (Fig. 5). Kaip ir tikėtasi, HSP27 ir 60 buvo nustatyta, kad nuosekliai labai išreikštas naviko audinyje, o PRX-2 buvo slopinamas. 4 pav Imunohistocheminis analizė HSP27, 60, ir PRX-2 normaliam žmogaus skrandžio Cardia ir GCA. Išraiškos HSP27 (A), 60 (C), ir PRX-2 (E), buvo tokie naviko ląstelių citoplazmoje; Išraiškos HSP27 (B), 60 (D) ir PRX-2 (F) buvo rasta citoplazmoje įprastomis kolonų epitelinių ląstelių; Didinimas: A-F × 40, counterstained hematoksilinu
5 paveikslas Vakarų dėmė analizė įteisinti padidėjusį išraišką HSP27, 60, ir sumažėjo išraiška PRX-2 GCA audiniuose.. . GAPDH ir β-aktino buvo naudojamas kaip nuorodos
Diskusijos
Cardia yra anatominis pasienio tarp stemplės ir skrandžio; vadinasi, ten yra pastovus nesutarimai dėl jų santykius, kalbant apie epidemiologijos, klinikiniais požymiais ir klasifikacija tarp stemplės adenokarcinoma (EA), GCA, ir DGA. Norėdami palyginti baltymų profilius, mes ieškojau literatūros rasti šiuos baltymus. Trylika iš 23 baltymai buvo rasta DGA anksčiau (2 lentelė). Tarp jų, HSP27, 60, 70, PDIA3 ir CA2 turi tą pačią išraišką modelį į GCA ir DGA. Priešingai, žemo lygio išraiška HSP27 buvo rastas EA [16-20]. Todėl GCA tumorogenezės skiriasi nuo EA ir DGA, todėl GCA turėtų būti atskira patologinis subjektas.
Mobilieji heterogeniškumas buvo didelė kliūtis į molekulinės analizės normaliomis ir ligotus audiniuose. Pirma aprašyta Emmertą-Buck et al. 1996 m, lazerio surinkimo microdissection yra galingas ir tikslią techniką naudojami tyrimo baltymų pakeitimus tam tikroje pogrupyje ląstelių mažai priežiūros sistema, kuri yra lengva valdyti [8]. Kaip įprasta, įvairių histocheminės dėmes iš audinių skirsnio ženklai naudojami, kad padėtų išpjaustymas procesą. Tačiau keli atvejai parodė, vidutinio sunkumo ir dramatiškų padarinių dažymo baltymų atskyrimo 2-DE [21, 22]. Norėdami pašalinti dėmių, kaip galimą neigiamą poveikį, navigacija LCM buvo sukurta neseniai. Jis naudoja tamsintas skyrių vadovauti iš nedažytų gretimų pavyzdį [23] skrodimo. Šis metodas buvo sėkmingai taikomos smegenų mėginių [15] tyrime. Be to, dėl to, kad būdingų morfologinių charakteristikų skrandžio širdies paviršinių stulpelio elementų ir širdies liaukos, jie yra lengvai nustatyti ant dehidratuotų skyriuje be dažymo. Todėl, navigacija LCM tapo optinė strategija mūsų proteomiką požiūrio. Šiame tyrime, iš LCM-kilęs nonmalignant ir piktybinių ląstelių skaičius gerokai skyrėsi ir dažnai buvo mažas, palyginti su visa undissected Kriostatas audinių, nepaisant profilius, kurie buvo labai panašus tarp LCM mėginių ir undissected tie. Tai rodė, kad navigacija LCM gali būti įmanoma požiūris skrandžio širdies audinių tyrimo ir kad ji yra suderinama su 2-DE ir MALDI-TOF MS.
Gavome baltymų profilį GCA lyginant pokyčius baltymo profiliai aplinkinių ne naviko audiniuose. Sumažinti individualius skirtumus, audinio mėginiai buvo paimti iš to paties paciento, leidžia mums mokytis diferencinę baltymo ekspresiją pagal panašaus genomo fone. Kiek mums žinoma, mes apie pirmąjį proteo analizę GCA. Iš 27 pasirinktų baltymų dėmių, 23 baltymai jų molekulinio masės diapazone nuo 15 iki 75 kDa ir su izoelektrinis taškas yra tarp 3 ir 10 buvo žymimas 2-DE ir MALDI-masių spektrometras. Dauguma šių baltymų buvo aprašyta anksčiau kaip skirtingai, išreikštą arba ne mRNR lygiu arba baltymų lygiu kitų tipų žmogaus vėžio.
HSPs yra streso baltymų, kurias sukelia įvairių rūšių aplinkosaugos ir patofiziologinių įžeidinėjimų grupė. Šiame tyrime, CO-up-nuostatai HSP27, 70, ir 60 buvo rasta skrandžio širdies navikų audiniuose. Kaip šaperonų, HSP27 ir HSP70 gali slopinti apoptozę, sąveikaudamas su apoptosome ir aktyvacijos kompleksas [24] kaspazė, pagrindinės jų vaidmenis naviko progresavimo ir atsparumas gydymui [25]. Daugybė tyrimų rodo, kad HSP27 ir Hsp70 overexpressions signalas prastas prognozes ir pranašauja prastą atsaką į chemoterapiją. Hsp60 atrodo, kad būti pagrindinis endogeninius uždegiminius tarpininkas ir yra matyt išleistas pažeistų ląstelių. Be to, kartu su HSP70, Hsp60 turi vaidmenį antigeno pateikimo piktybinių ligų [26]. HSPs taip pat ekspresija krūties, gaubtinės, skrandžio ir prostatos karcinoma [10, 25]. Todėl, raiškos iš HSP27, 70, ir 60 gali būti naudingi biomarkeriai pagal kancerogenezėje, esantys GCA ir gali būti susijęs su diferenciacijos laipsnį ir GCA prognozė.
Tarp nustatytų baltymų, du baltymai dalyvauja transkripcijos reguliavimo ir išraiška naviko susijusių genų. PCBP1, iki-reguliuojami GCA, yra RNR šaperonas po transkripcijos reguliatorius. Buvo įrodyta, kad PCBP1 kartu su PTB-1 ir hnRNPK, kontroliuoja keletą Proto-onkogeno genus ir apoptozę susijusių genų ekspresiją, pavyzdžiui, Bag-1, C-pervežimas myc, aPAF-1, XIAP ir DAP5, per stimuliuoja vidaus ribosomos įėjimo segmento (IRES) veiklą. PCBP1 privalo atidaryti RNR regione, kuriame ribosomos įrašo langą, o PTB-1 gali būti reikalaujama ribosomų įdarbinimo [27, 28]. Neseniai Pickering, B.M. ir kt. aprašyta, kad glikaną dalys PCBP1 gali būti susiję su metastazavusiu gebėjimą ir gali vaidinti svarbų vaidmenį kepenų vėžio metastazių [27]. Tada up-reguliavimas PCBP1 gali reguliuoti Cap-nepriklausomas mechanizmas vertimo pradedant širdies auglių susijusių genų į GCA plėtrai. Kaip naviko slopintuvas, Alfa-enolase gali reguliuoti C-myc promotoriaus veikla su C-MYC surišančio baltymo (MBP-1) forma. MBP-1 tada gali prisijungti prie P2 elementas c-myc promotoriaus ir konkuruoti su TATA dėžė privalomu baltymo (TBP) slopinti c-myc [29, 30] transkripciją. Kita vertus, down-regulation alfa-enolase yra pagal Chang YS et al darbo.

• Klinikinė reikšmė paliatyviosios pašalintas skrandis dėl pacientams, sergantiems nepagydoma išplitusiu skrandžio vėžiu išlikimo: sisteminė apžvalga ir metaanalizė
• MicroRNA-645, iki reguliuojama žmogaus adencarcinoma skrandžio stemplės jungties, slopina apoptozę nukreipiant auglio slopinamojo IFIT2