Proteomianalyysi Ihmisen mahalaukun cardia adenokarsinoomaa laser kaapata mikrodissektion

Proteomianalyysi Ihmisen mahalaukun cardia adenokarsinoomaa laser kaapata mikrodissektion
tiivistelmä
tausta
ilmaantuvuus mahalaukun sydämen adenokarsinooma (GCA) on kasvanut kahden viime vuosikymmenen aikana Kiinassa, mutta molekyyli liittyvät muutokset syövän synnyn olla ei ole määritelty. Tool menetelmät
tässä tutkimuksessa käytimme vertailevaa proteomic lähestymistapa analysoida pahanlaatuinen ja ei-pahanlaatuisten mahalaukun cardia epiteelisoluihin eristettiin suunnistaa laser kaapata mikrodissektion (LCM) saatuna kirurgisista näytteistä ihmisen GCA.
tulokset
Kaksikymmentäseitsemän paikkoja vastaavat 23 proteiinit johdonmukaisesti säädellään eri tavalla. Viisitoista proteiinit osoitettiin olevan säädelty, kun taas kahdeksan proteiinit osoitettiin olevan säädellä vähentävästi pahanlaatuisten solujen verrattuna pahanlaatuisten sarakemuotoon epiteelisolujen. Tunnistetut proteiinit näyttivät olla mukana aineenvaihduntaa, chaperone, antioxidation, signaalitransduktion, apoptoosin, soluproliferaatiota ja erilaistumista. Lisäksi ilmauksia HSP27, 60, ja Prx-2 GCA näytteet varmistettiin lisäksi immunohistokemiallisella ja western blot-analyysit.
Päätelmä
Nämä tiedot osoittavat, että yhdistelmä suunnistaa LCM 2-DE on tehokas strategia löytämässä proteiineja, jotka ilmentyvät differentiaalisesti GCA. Tällaiset proteiinit voivat edistää selvittämisessä molekyylimekanismeihin GCA syövän synnyn. Lisäksi yhdistelmä tarjoaa mahdolliset kliiniset biomarkkereita, jotka auttavat varhainen havaitseminen ja tarjota mahdollisia terapeuttisia kohteita.
Tausta
Erilaisia ​​analyysejä syövän esiintyvyys tietojen poimittu länsimaat ovat paljastaneet nopeasti kasvavat hinnat adenokarsinooma ruokatorven ja mahalaukun cardia vuonna viime vuosikymmeninä, verrattuna vakaa ja laskee hinnat ruokatorven okasolusyöpä (SCC) ja distaalisen mahalaukun adenokarsinooman (DGA) [1-3]. Tämä ilmiö näkyy myös Kiinassa, paitsi että lisääntyvä mahalaukun cardia adenokarsinoomaa (GCA) näkyy selvästi korkeampi kuin esiintyvyys ruokatorven syöpään. Todisteet osoittavat, että GCA on selvä kliininen kokonaisuus sen synnyssä ja riskitekijät ovat aivan erilaiset kuin DGA. Siksi GCA on huomattavasti yleisempää, jossa esiintyi enemmän imusolmuke etäpesäke ja huonompi ennuste kuin DGA [4]. Vuosittainen ilmaantuvuus GCA on 50 /100,000 ja saattaa jopa olla jopa 190/100000 useilla alueilla Kiina [5]. Suhteellisen oireeton luonto alkuvaiheessa sairauden ja riittämättömyys seulontatestien ovat johtaneet useimmissa GCA potilaiden diagnosoitu olevan jo pitkälle edennyt tauti. Näin ollen on välttämätöntä ymmärtää molekyylitason mekanismia syövän ja tunnistaa biomarkkereita varhaisen diagnoosin ja tehokkaan hoidon ihmisen GCA.
Äskettäin proteomin on noussut komplementtikomponentin genomin. Olettamus on, että se voisi merkittävästi auttaa purkamiseen biokemiallisia ja fysiologisia mekanismeja monimutkaisten monimuuttuja sairauksien toiminnallisen molekyylitasolla. Vaikka geneettinen mutaatio ja /tai errant geeniekspression voi toimia perustana taudin, biokemiallinen perusta useimmat sairaudet johtuvat proteiinia vikoja. Siksi analyysi maailmanlaajuisen proteiinin runsauden ihmisen kasvaimissa, nimeltään syöpä proteomiikka, voi tarjota monia mahdollisuuksia ja haasteita tunnistamaan uusia kasvainmerkkiaineet ja terapeuttisten kohteiden sekä ymmärtää kasvain synnyssä. Tällä hetkellä, kaksiulotteinen geelielektroforeesi (2-DE) ja massaspektrometrialla (MS) ovat yleisimmin käytetään välineitä erottamiseksi ja tunnistamiseksi proteiineja. Kuitenkin heterogeenisuus on aina huolenaihe tutkimuksissa ihmisen kasvain kudosta. Vaikka soluviljelmässä on yksi tapa ratkaista tämä ongelma, se ei ehkä ole tarkasti edustaa molekyyli- tapahtumista todellinen kudosta, josta ne on johdettu [6]. Vertailu ihmisen eturauhasen solulinjojen ja syöpäsolujen samoilla potilailla osoitti, että 20% proteiinia profiilien muutettiin [7]. Laser capture mikrodissektion (LCM) on viimeaikainen kehitys, jota voidaan käyttää hankkimaan erittäin edustava alipopulaatio solujen monimutkainen heterogeeninen kudosnäytteistä [8]. Tämä tekniikka on käytetty menestyksekkäästi monipuolista tutkimusten avulla alavirtaan analyysi DNA- ja RNA-tasot, kuten globaali geeniekspressioprofilointi [9] ja analyysit proteomiin eturauhasen [7], paksusuolen [10], hepatosellulaarinen [11 ], rintojen [12], ja haiman kasvaimet [13]. Kuitenkin yhdistelmä 2-DE ja MS ei ole koskaan sovellettu tutkimus ihmisen GCA.
Tutkimuksen tavoitteena on hahmotella karsinogeneesi GCA ja tunnistaa GCA-tietyn taudin liittyvien proteiinien mahdollisina kliininen biomarkkereita varhaiseen havaitsemiseen ja uusien terapeuttisten tavoitteita. Suoritimme suunnistaa LCM rikastuttaa sekä pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten mahan sydämen epithelia soluja pariksi kirurgisista näytteistä ihmisen GCA. Uutetut proteiinit näistä soluista erotettiin 2-DE. Differential proteiinitäplien tunnistettiin peptidi massa sormenjälkien (PMF), joka perustuu matriisiin laserdesorptio /ionisaatio aika-of-lennon (MALDI-TOF MS) ja hakuja tietokannoista. Voimassaoloaikaa Näiden havaintojen vahvistettiin immunohistokemiallisella ja western-blot-analyysit. Tool Menetelmät
Materiaalit
IPG nauhat (pH 3-10 epälineaarinen) ja IPG puskuriliuokset (pH 3-10 epälineaarinen) hankittiin Amersham Pharmacia Biotech (APB, Ruotsi). DTT, urea, tiourea, Tris-emäs, TX-100, CHAPS, glysiini, akryyliamidi, metyleenibisakryyliamidi, SDS, TEMED, ammoniumpersulfaatti, hopeanitraatti, trypsiini (sekvensointi grade), ACN, ja TFA hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Lopuksi, koko proteaasiestäjäseostabletit oli Roche (Lewes, UK). Milli-Q-laatu vettä käytettiin kaikki ratkaisut.
GCA näytteet
Yhdeksän paria ihmisen mahalaukun cardia adenokarsinoomaa ja niiden viereisten nontumourous cardia kudokset saatiin 30 minuutin kuluessa kirurgiset resektiota toisessa sidoksissa sairaalan Xi " Jiaotong yliopiston vuonna 2005 (taulukko 1). Jotta vältetään selviä alueita haavauma tai nekroosi, näytteet hankitaan reunojen kasvaimia. Ne jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta potilailta. Samaan aikaan kaksi kokenutta patologit arvioitiin kasvaimen luokittelua mikroskooppinen tarkastelu samples.Table 1 Clinical ja histologinen data potilaan kasvainnäytteestä
Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm GEJ
1,5 × 2
kohtalaisen eriytetty
2
63
M
Within 2 cm GEJ
5 x 6
Kohtalaisen eriytetty
3
46
M
Within 2 cm GEJ
4 × 5
Kohtalaisen eriytetty
4
60
M
Within 2 cm GEJ
2 x 2,5
No eriytetty
5
73
M
Within 2 cm GEJ
3 × 1
No eriytetty
6
70
M
Within 2 cm GEJ
2 × 1
No eriytetty
7
55
M
Within 2 cm GEJ
2 × 3
Huonosti eriytetty
8
51
M
Within 2 cm GEJ
4 × 6
Huonosti eriytetty
9
63
M
Within 2 cm of GEJ
3 × 2,5
Huonosti eriytetty
a) Paikka: episentteristä kasvainkudoksen
Näytteiden valmistus LCM
pääluokat (8 um paksuja) leikattiin päälle dioja (precleaned pesuaineella, pestiin deionisoidulla vedellä, ja upotetaan etanoli) käyttämällä Leica CM 1900 kryostaattiin (kammion lämpötila -28 ° C). Leikkeet joko säilytettiin -80 ° C: ssa tai pidetään kryostaattikammio ennen LCM. Hematoksyliiniä värjäys suoritettiin ainoastaan ​​seurantaa kudosleikkeiden ja ei käytetty yhdessä LCM. Leikkeitä kiinteä (70% etanolia 1 min), hematoksyliinillä värjätty ja kuivattu (70% etanolia 45 s, 95% etanolia ja 45 s, 2 x 100% etanolia 30s, ja sen jälkeen ksyleeni 2 x 5 min). Samalla värjäämätön osat käytettiin LCM. Ne kiinnitettiin (70% etanolia 30 s), pestiin deionisoituun veteen 10s, ja kuivattu (70% etanolia 15s, 95% etanolia ja 15 s, 2 x 100% etanolia 15s, ja sen jälkeen ksyleeni 2 x 1 min ). Täydellinen proteaasiestäjäseostabletit tabletit
suunnistaa LCM
Asennuksessa kuivuminen, värjäämätön leikkeet ilmakuivattiin ja microdissected käyttäen Arcturus PixCellα järjestelmä (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM mikroskooppi kuvantaa hematoksyliinillä värjätty jakso vieressä yksi kiinnostava. Tämä kuva on näkyvissä LCM tietokoneen näytöllä käyttäen LCM kuva-analyysi-ohjelmisto (Arcturus, USA) ja käytettiin kartan rajata alueen leikkelemiseksi viereisen värjäämätön osassa. Sitten leikkeitä siepattiin käyttäen 15 um halkaisijan lasersäde tyypillisesti 50-80 mV valtaa pulssinkesto 3-10 ms konekiväärin tilassa ja laserilla laukaisutiheydellä 1 ammuttu kohti 500 ms. Keskimäärin välillä 10,000-12,000 kuvausajankohdat per korkki, ja noin 25.000-30.000 solut saatiin kohti korkki. Kukin cap vangittiin tunnin kuluessa. Perustuen huolellinen tarkastelu histologisen, joista jokainen leikkely arvioitiin sisältävän ≥ 95% haluttua solujen.
Mikrodissektiomenetelmiä caps työnnettiin 0,5 ml mikrosentrifugiputkille joka sisälsi 50 ui lyysipuskuria (7 M ureaa, 2 M tioureaa, 4% paino /tilavuus CHAPS, 65 mM DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mM Tris-Base, ja täydellinen proteaasiestäjäseostabletit). Sitten solut solubilisoitiin käännellen putkia seurasi vortex-sekoittamalla 1 min ja lyhyt pulssi sentrifugoimalla 12 000 x g. Jälkeenpäin kudokset useista korkit (noin 800000 ~ 1.000.000 solua) uutetaan samaan hajotuspuskuria kunnes riittävä aineisto oli kerätty. Näytteet sentrifugoitiin 40000 x g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Tarvittaessa supernatantit säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä.
2-DE
ensimmäisen ulottuvuuden isoelektrisen fokusoinnin (IEF) suoritettiin Pharmacia Immobiline IPG DryStrip järjestelmä (Uppsala, Ruotsi). Ensimmäisen ulottuvuuden elektroforeesia näytteitä, jotka sisältävät 60 ug proteiinia analyysiä varten geelit laimennettiin 250 ui kanssa nesteytys-liuoksella (7 M urea, 2% paino /tilavuus CHAPS, 50 mM DTT, 0,5% v /v IPG-puskuria (pH 3-10 epälineaarinen), ja jäljittää bromifenolisineä) ennen kuin ne lastataan 13 cm IPG nauhat (pH 3-10 epälineaarinen). IEF suoritettiin sitten käyttäen IPGphor elektroforeesiyksiköstä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen liuskat tasapainotettiin liuoksella (6 M ureaa, 30% tilavuus /tilavuus glyserolia, 2% paino /tilavuus SDS: ää ja 50 mM Tris-HCl, pH 8,8), pelkistetään 1% w /v DTT 15 min ja alkyloidaan 2,5% w /v jodiasetamidia 15 min. Nauhat huuhdeltiin sitten elektroforeesin puskurissa (25 mM Tris-emäs, 192 mM glysiini ja 0,1% paino /tilavuus SDS), levitetään 11% akryyliamidigeeleissä, ja suljettiin sulatetun agaroosin (0,5% w /v agaroosia elektroforeesin puskurissa, joka sisältää jälkeäkään bromofenolisininen). SDS-PAGE suoritettiin käyttäen Hoefer SE 600 pystysuoraa kammiota ja Tris-glysiini-puskuria (25 mM Tris ja 192 mM glysiiniä), joka sisälsi 0,1% paino /tilavuus SDS: ää, jossa alkuerotuksen vakiona 10 mA /geeli 30 minuutin ajan, jota seuraa 20 mA /geeli. Toisen ulottuvuuden SDS-PAGE on kehitetty vasta bromifenolisinistä väriainetta merkki oli saavuttanut geelin alaosassa. Yhteenlaskettu ajoaika oli tyypillisesti 4-4,5 tuntia. Geelit kiinnitettiin 10% v /v etikkahappoa, 40% v /v etanolia ennen herkistymisen 30 min puskurissa, joka sisälsi 30% v /v etanolia, 0,2% w /v natriumtiosulfaatilla, ja 0,83 M natriumasetaattia. Tätä seurasi kolme 15 minuutin pesua deionisoidulla vedellä. Sitten proteiinit värjättiin 0,1% w /v hopeanitraattia 20 minuutin ajan, pestiin kahdesti deionisoidulla vedellä 1 minuutin ajan, ja kehitettiin 2,5% w /v natriumkarbonaattia, joka sisälsi 0,04% v /v formaldehydiä (37% liuos). Kehitys pysäytettiin 1% v /v etikkahappoa, ja geelit pestiin kolme kertaa vedellä.
Kuva-analyysi ja tilastollinen analyysi
Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) käytettiin skannata geelit, kun taas kuva Master ™ 2D Platinum Version 5.0 ohjelmisto (Amersham Biosciences) käytettiin spot havaitsemiseen, kvantifiointiin, ja vastaavia. Intensiteetti kunkin täplän kvantifioitiin% tilavuudesta. Sitten aineisto analysoitiin SPSS for Windows 11.5 ja Excel. Studentin t
-testiä käytettiin analysoimaan eroja proteiinin tasojen GCA ja ei-kasvain näytteet, joiden luotettavuustasolla 95%.
MALDI-TOF-MS ja tietokanta
Tasaisen ja merkittävästi erilaiset paikkoja valitaan analysoitavaksi MALDI-TOF MS. Proteiinitäplät kohteisiin leikattiin irti ja jauhettiin pieniksi palasiksi seurasi värin poisto ja pesu deionisoidulla vedellä useita kertoja, kunnes keltainen väri hävisi. Geelipalat huuhdeltiin sitten 25 mM ammoniumbikarbonaattia, kuivattu ja ACN ja kuivattiin tyhjiösentrifugissa. Jälkeenpäin proteiinit-geeli pilkottiin 0,02 ug /ul trypsiinillä yön yli 37 ° C: ssa. Trypsiinipeptidit Sitten liuotetaan uudelleen liuokseen, joka sisälsi 50% v /v ACN ja 0,2% tilavuus /tilavuus TFA: ta. A2 ui alikvootti täpläksi näyte levy 4 ui matriisiliuosta CHCA (a-syaani-4-hydroxcinnamic happoa, 10 mg /ml 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA: ta) ja annettiin ilman kuiva. Kuivattu täplät analysoitiin sitten Voyager DE MALDI-TOF MS (Framingham, MA, USA). Tätä seurasi käynnissä spektrometri on positiivinen ioni -tilassa ja heijastin tilassa seuraavat asetukset: kiihdytysjännite 20 kV; gride jännite, 94%; ohjauslangnan jännite, 0,01%; ja viive 200 ns. Spektrit saatiin manuaalisesti laserintensiteetin asetettu 3200 80 laukausta kohti spektrin. Sitten massa-alue asetettiin välille m
/z
500 ja m Twitter /z
5000. Sisäinen kalibrointia sovellettiin käyttäen angiotensiini II ja insuliinin B-ketjun huiput 912,08 Da ja 3495,95 Da, vastaavasti.
proteiinit tunnistettiin peptidi massa sormenjälkien avulla hakuohjelma Aldente [14] seuraavien hakuparametreihin sovellettu: SWISS-PROT ja TrEMBL käytettiin proteiinisekvenssiä tietokannoista; massa toleranssi 100 ppm ja yksi epätäydellinen pilkkominen sallittiin; carboxyamidomethylation, hapetetut metioniini, ja fosforylaatio pidettiin mahdollisia muutoksia; vähimmäismäärä sovitetun-peptidien oli 4; ja peptidi-ioni oli [M + H] +.
immunohistokemiallinen ja western blot-analyysi
validoimiseksi ekspressiokuvioita kolmen proteiinien GCA kudoksissa, immunohistokemia suoritettiin käyttäen formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotettujen kudosten yksilöitä, joita on sovitettu 2-DE näytteitä. Liuottimella 5 um: n paksuisia leikkeitä käsiteltiin 0,3% vetyperoksidaasia 3 min ja jonka esto vasta-aineella 30 minuutin ajan. Sen jälkeen kun lämpö-välitteinen antigeenin haku, leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli seuraavasti: HSP27 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, America), 1: 300; ja Prx-2 (Santa Cruz, America), 1: 150. Sitten leikkeitä inkuboitiin peroksidaasilla leimattua vasta-ainetta (1: 500), joka on kehitetty diaminobenzine, ja vastavärjättiin hematoksyliinillä.
Western-blot-analyysi, proteiini näytteet (30 ug), jota käytetään 2-DE ajettiin 12% SDS-PAGE, siirrettiin PVDF-membraaneille ja blokattiin sitten PBS /5% kuorittu maito /0,01% Tween 2-4 tuntia huoneen lämpötilassa. Ensisijainen vasta-aine laimennettiin estopuskurissa ja lisättiin seuraavasti: HSP27, 1: 200; HSP60, 1: 300; ja Prx-2, 1: 200. Sen jälkeen, sitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta ja HRP-konjugoitua anti-GAPDH /β-aktiini-vasta-ainetta vahvistaa yhtä suuri kuin proteiinin loading kussakin vyöhykkeessä 1-2 tunnin ajan 37 ° C: ssa tai huoneenlämmössä. Näytteet pestiin ja detektoitiin tehostetun kemiluminesenssin 30-60 s (Minipore).
Tulokset
Profiili eroja suunnistaa LCM näytteiden ja koko undissected kryostaatti kudosten
arvioimiseksi vaikutuksia suunnistaa LCM on profiilit kudosproteiini-, suoritimme 2-DE proteiiniprofiileja kokonaisia ​​undissected kryostaatti kudosten ja LCM-näytteitä GCA. Kuvio 1 esittää esimerkkiä suunnistettavan LCM prosessi. Suurin osa paikoista havaittu dissekoiduissa kuin kasvain ja tuumorikudoksia voitiin havaita koko undissected kryostaatti kudoksiin, lukuun ottamatta useita paikkoja. On kuitenkin olemassa vielä joitakin paikkoja löytyy koko undissected kryostaatti- kudosta, jota ei voitu havaita molemmissa LCM näytteistä. Siten tämä teknologia voi vain rikastuttaa kuin kasvain ja kasvain epiteelisolujen mutta voisi myös heikentää saastumisen kudoksissa kuten hemoglobiini [10, 11]. Lisäksi suunnistaa LCM prosessi voisi eliminoimaan värjäys proteiinin erotus 2-DE [15]. Siten meidän tiedot tukevat tarvetta suorittaa suunnistaa LCM on proteomic tutkimuksissa GCA kudoksiin. Kuva 1 Navigated laser kaapata mikrodissektion kasvainkudoksen. (A) Hematoksyliini-värjätty mahalaukun cardia adenokarsinoomaa; (B) unstained GCA kudos; (C) kasvainten kudoksessa jälkeen mikrodissektion; (D) Siepattu tuumoria LCM elokuva.
Profiili eroja proteiiniekspressiossa välillä GCA kudosten ja ympäröivän ei-tuumorikudoksista
Teimme suunnistaa LCM ja 2-DE varten pareittain kasvaimen kudosten ja ympäröivän ei- kasvain kudokset GCA potilaista. Noin 800-1000 proteiinitäplien havaittiin hopeavärjäyksellä. Mitata toistettavuus, jokainen näyte tehtiin kokeen kolme kertaa. Oli 905 ± 74 ja 867 ± 51-proteiinin paikkoja kartta GCA ja ei-kasvain mahalaukun sydänkudoksen, vastaavasti. Sovitetun täplät olivat 799 ± 29 ja 727 ± 34 erikseen, ja kunkin keskimääräinen sovitus oli 88,2% ja 83,8%. Lisäksi keskimääräinen poikkeama täsmäävän paikkoja oli 1,031 ± 0,205 mm ja 1,44 ± 0,11 mm IEF ja SDS-PAGE suuntaan, vastaavasti. Vaikka kuva-analyysi osoitti, että 2-DE kartat olivat toistettavia oli vähäisiä eroja intensiteetti ja määrä paikkoja. Kuitenkin, analyysi geelien paljasti 27-proteiinin täplinä, joiden voimakkuudet vaihtelivat merkittävästi ja johdonmukaisesti välillä ei-kasvain ja tuumorikudoksissa (Fig. 2). Suhteet normalisoitu spot intensiteettien syövän paraneoplasis kudoksiin kunkin kiinnostavia proteiineja laskettiin. Täplät osoittavat kaksinkertainen ero ja tilastollinen merkitsevyys (p < 0,05) valittiin. Kolme 2-DE-tulokset vahvistettiin immunohistokemiallisella ja western blot-analyysit. Kuva 2 2-DE kartta pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten mahalaukun cardia kudosta. Kaikki kartat esitetään valmistetaan samasta potilaasta. (A) 2-DE kartan koko undissected kryostaatti kudoksia; (B) 2-DE-kartta ei-kasvainkudoksen jälkeen LCM; (C) 2-DE kartan GCA kudoksen jälkeen LCM.
Protein tunnistaminen
Sekä koko undissected kryostaatti yksilöt ja LCM-näytteitä käytettiin proteiinin tunnistamiseen. Kaksikymmentä seitsemän eri proteiinitäplien välillä GCA kudosten ja ympäröivän ei-kasvainkudoksista leikattiin. Kuitenkin vain 23-proteiinit tunnistettiin MALDI-TOF-MS (taulukko 2). Ilmiö johtuu todennäköisesti translaation jälkeisiä modifikaatioita, kuten peroxiredoxin 1 (Prx-1), joka oli läsnä kaksi vierekkäistä täplät (Fig. 2, spot 11). Nämä proteiinit luokiteltiin on jokin seuraavista: solujen proliferaatiota ja erilaistumista (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptoosin (Prx-1, Prx-2, GSTP, VDAC, ETFB), aineenvaihdunta (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), proteaasi liittyvät (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (Actin 1, keratiini 8), saattajia (HSP27, 60, 70, PDIA3), ja RNA sitova ja transkription (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Kuvio 3 esittää PMF kartat HSP60.Table 2 proteiinit ero ilmentymisen välillä GCA kasvainkudoksissa ja viereisen pariksi ei-tuumorikudoksissa tunnistettiin MALDI-TOF-MS:
Up-regulation proteiinien
Spot nro
Protein
liittymistä No.a)
Mr /PIB) B Match
Cov (%) c) B-T-test
Ration (kasvain /ei-kasvain) Tarkoittaa ± SD
1
Heat-shock-proteiinin beeta-1 (HSP27) *
P04792
23 /6.0
9
54
0,0040
3,4279 ± 2,0727
2
Lämpöshokki 70 kDa proteiinia 5 (HSP70) B P11021
70 /5.0
22
42
0,0030
3,2597 ± 1,5314
3
60 kDa lämpöshokkiproteiini (HSP60) *
P10809
58 /5,2
12
37
0,0001
2,8308 ± 1,1426
4
Protein isomeraasin A3 (PDIA3) *
P30101
54 /5.6
13
41
0,0280
4,2105 ± 2,7294
5
anneksiini A4 (ANXA4) B P09525
36 /5.8
10
34
0,0140
4,7153 ± 7,3434
6
anneksiini A2 (ANXA2) B P07335
38 /7,5
7
26
0,0150
6,0722 ± 5,5431
7
heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiineissa A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) *
P22626
37 /9.0
16
43
0,0050
10,7775 ± 9,5547
8
Cathepsin D raskaan ketjun (CTSD) B P07339
27 /5.6
12
61
0,0012
4,3552 ± 3,7703
9
proteiinikinaasi C ja kaseiinikinaasi alustan neuronien proteiinia 1 (PACSIN1) B Q9BY11
51 /5.1
5
24
0,0028
2,6026 ± 1,2147
10
Glutathione S- transferaasin P (GSTP) *
P09211
23 /5,4
5
44
0,0026
3,8757 ± 2,2198
11
Peroxiredoxin-1 (Prx-1) *
Q06830
22 /8.3
8
59
0,0140
4,2744 ± 4,1568
12
Poly (rC) sitoutuvilla protein1 (PCBP1) *
Q15360
37 /6.7
12
63
0,0070
2,7401 ± 0,5321
13
Aldo-keto-reduktaasin perhe 1member C3 (AKR1C3) B P42330
37 /8.1
7
25
0,0040
2,7762 ± 1,1820
14
Glycineamidinotransferase (GATM) B P50440
44 /6,4
8
23
0,0390
2,7839 ± 0,4680
15
Keratiini, tyypin II cytoskeletal 8 (Keratiini 8) *
P05787
54 /5,5
9
25
0,0020
3,5063 ± 0,6423
Down-regulation proteiinien
16
Actin , sytoplasminen 1 (Actin 1) *
P60709
42 /5.3
6
30
0,0160
0,2603 ± 0,1539
17
heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiineissa H3 (hnRNPH3)
P31942
37 /6.4
5
28
0,0015
0,6028 ± 0,6229
18
Peroxiredoxin-2 (Prx-2) *
P32119
22 /5,7
6
24
0,0250
0,2376 ± 0,1202
19
Hiilihappoanhydraasi anhydrase2 (CA2) *
P00918
29 /6.8
6
33
0,0130
0,3675 ± 0,1270
20
Alpha-enolaasi * (ENO1) B P06733
47 /7.0
16
42
0,0030
0,2898 ± 0,1340
21
alkoholidehydrogenaasi 1C (ADH1C) B P00326
40 /8.6
7
49
0,0280
0,2287 ± 0,1680
22
Electron siirto flavoproteiini alayksikköä b (ETFB) b P38117
28 /8.3
6
26
0,0240
0,2655 ± 0,1415
23
Jännite riippuva anioni selektiivinen kanava (VDAC) *
P21796
31 /8.6
7
39
0,0120
0,4474 ± ​​0,0297
a) Swiss-Prot tulonumero.
b ) Teoreettinen arvo
c) Sequence kattavuus%
* proteiinit on löydetty mahasyövän aiemmin.
Kuva 3 MALDI-TOF MS tunnistaminen spot 3 GCA.
immunohistokemiallinen ja western blot analyysi HSP 27, 60, ja Prx-2 GCA
edelleen tutkia, HSP27, 60, ja Prx-2 ilmaistaan ​​kudoksissa ja mitkä solut ekspressoivat näitä proteiineja, immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin käyttäen formaliinilla kiinnitetyt ja parafiini- upotettu kudosta yksilöitä, joita etsitään 2-DE näytteitä. Ilmaus HSP27 ja 60 voidaan nähdä kaikissa cytoplasms ja karsinoomasoluja, vaikka se voitaisiin nähdä joitakin cytoplasms pylväsmatriisien epiteelin (Fig. 4A-D) ei-tuumorikudoksissa. Sen sijaan, Prx-2 oli melkein ei havaittu ilmaistaan ​​karsinoomasoluista vaan joissakin cytoplasms pylväsmatriisien epiteelisolujen (Fig. 4E, F). Tutkia näitä proteiinin ilmentymisen tasot, western blot-analyysi suoritettiin myös käyttäen samaa kudoksissa (Fig. 5). Kuten odotettua, HSP27 ja 60 havaittiin johdonmukaisesti ilmentyy voimakkaasti kasvainkudoksen, kun taas Prx-2 tukahdutettiin. Kuva 4 immunohistokemiallinen analyysi HSP27, 60, ja Prx-2 ihmisen normaalia mahalaukun cardia ja GCA. Ilmauksia HSP27 (A), 60 (C), ja Prx-2 (E) oli sytoplasmassa kasvainsolujen; Expressions of HSP27 (B), 60 (D) ja Prx-2 (F) löydettiin sytoplasmassa normaalien columnar epiteelisolujen; Suurennoksilla: A-F × 40, vastavärjättiin hematoksyliinillä.
Kuvio 5 Western blot -analyysi validoinnin lisääntyneen ilmentymisen HSP27, 60, ja vähentynyt ilmentyminen Prx-2 GCA kudoksissa. GAPDH ja β-aktiini käytettiin vertailukohteina.
Keskustelu
Cardia on anatominen rajamailla ruokatorven ja mahalaukun; siksi, on jatkuvaa kiistaa koskevat niiden suhdetta suhteen epidemiologian, kliiniset piirteet, ja luokittelu keskuudessa ruokatorven adenokarsinooma (EA), GCA, ja DGA. Vertaamaan proteiiniprofiilit etsittiin kirjallisuudesta löytää näitä proteiineja. Kolmetoista ulos 23 proteiineja on löydetty DGA aikaisemmin (taulukko 2). Joukossa, HSP27, 60, 70, PDIA3, ja CA2 on sama ilmentämiskuviota GCA ja DGA. Sitä vastoin alhaisen tason ekspression HSP27 havaittiin EA [16-20]. Siksi tuumorigeneesiä GCA eroaa EA ja DGA, ja siten GCA pitäisi olla erillinen patologinen kokonaisuus.
Cellular heterogeenisuus on ollut merkittävä este molekyylitason analyysi normaaleissa ja sairaissa kudoksissa. Ensin kuvataan Emmert-Buck et al. vuonna 1996, laser kaapata mikrodissektion on tehokas ja tarkka tekniikka, jota käytetään tutkia proteiinin muutoksiin tietyn alijoukon solujen vähän huoltoa järjestelmä, joka on helppo käyttää [8]. Kuten tavallista, eri histokemialliset tahroja kudoksen osassa käytetään ohjaamaan leikkely prosessi. Kuitenkin useat tapaukset ovat osoittaneet kohtalaisesta dramaattisia vaikutuksia värjäys proteiinin erotus 2-DE [21, 22]. Poistamaan värjäystä mahdollisena haitallinen vaikutus, suunnistaa LCM on kehitetty viime aikoina. Se käyttää värjättyä osio ohjata leikkelyn unstained viereisen mallin [23]. Tätä tekniikkaa on sovellettu onnistuneesti tutkimuksessa aivonäytteiden [15]. Lisäksi johtuen tyypilliset morfologiset ominaisuudet mahalaukun sydämen pinnallinen columnar solun ja sydämen rauhanen, ne on helppo tunnistaa on kuivattu jakso ilman värjäystä. Siksi suunnistaa LCM tuli optinen strategia meidän proteomiikka lähestymistapa. Tässä tutkimuksessa lukumäärät LCM johdettujen ei-pahanlaatuisten ja pahanlaatuisten solujen vaihtelivat huomattavasti ja olivat usein pieniä verrattuna koko undissected kryostaatti kudoksissa, huolimatta profiilit, jotka olivat hyvin samankaltaisia ​​tarkasteltaessa LCM näytteiden ja undissected niistä. Tämä osoitti, että suunnistaa LCM voi olla toteuttamiskelpoinen lähestymistapa tutkimus mahalaukun sydänkudoksen ja että se on yhteensopiva 2-DE ja MALDI-TOF MS.
Saimme proteiinin profiilia GCA vertaamalla muutoksia proteiinin profiilit ympäröivän ei-kasvainkudoksia. Vähentää yksilölliset erot, otettiin kudosnäytteet samasta potilaasta, joiden avulla voimme tutkia ero proteiinin ilmentymistä samoissa genomista tausta. Parhaan tietämyksemme, raportoimme ensimmäistä proteomiikka analyysin GCA. 27 valittua proteiinia paikkoja, 23 proteiinien molekyylimassa välillä 15-75 kDa ja isoelektrinen piste välillä 3 ja 10 tunnistettiin 2-DE ja MALDI-TOF MS: llä. Useimmat näistä proteiineista on kuvattu aikaisemmin ilmentyvät differentiaalisesti joko mRNA-tasolla tai proteiinitasolla muun tyyppisissä ihmisen syövän.
HSP: t ovat ryhmä stressin indusoimia proteiineja eri ympäristö- ja patofysiologisia loukkauksia. Tässä tutkimuksessa, co-up-asetusten HSP27, 70, ja 60 havaittiin mahalaukun sydämen tuumorikudoksissa. Kuten chaperones, HSP27 ja HSP70 voisi estää apoptoosin vuorovaikutuksessa apoptosome ja kaspaasin aktivointi monimutkaisia ​​[24], taustalla niiden roolit kasvainprogression ja vastustuskykyä hoitoon [25]. Lukuisat tutkimukset osoittavat, että HSP27 ja HSP70 overexpressions signaali huono ennuste ja ennustaa huono vastaus kemoterapiaa. HSP60 näyttää olevan keskeinen endogeeninen tulehduksellinen välittäjänä ja on oletettavasti vapautuu vaurioituneita soluja. Lisäksi yhdessä HSP70, HSP60 on rooli antigeenin esittely pahanlaatuiset sairaudet [26]. HSP: t ovat myös yli-ilmentyy rinta-, paksusuolen ja peräsuolen, mahan, ja eturauhasen karsinoomien [10, 25]. Siksi yliekspressio HSP27, 70, ja 60 voivat olla hyödyllisiä biomarkkereita syövän syntymistä GCA ja voi liittyä erottelun taso on sama ja ennuste GCA.
Joukossa tunnistettu proteiineja, kaksi proteiinia osallistuvat transkription säätelyyn ja ilmentyminen kasvaimeen liittyviä geenejä. PCBP1, säädellään ylöspäin GCA, on RNA kaperonia transkription jälkeisen säädin. On osoitettu, että PCBP1 yhdessä PTB-1 ja hnRNPK, ohjaa joitakin proto-onkogeenin geenien ja apoptoosiin liittyvien geenien ilmentymistä, kuten Bag-1, c-
myc, Rahastolla-1, XIAP, ja DAP5, stimuloimalla toiminnan sisäisen ribosomin segmentti (IRES). PCBP1 avaamiseen tarvitaan RNA alueen sisältävä ribosomin ikkunan, kun taas PTB-1 voidaan tarvita ribosomien rekrytointi [27, 28]. Äskettäin Pickering, B.M. et ai. kuvataan, että glykaanirakenteeseen osat PCBP1 saattavat liittyä metastaattisen kyvyn ja saattavat vaikuttaa maksasolukarsinoomassa etäpesäkkeitä [27]. Sitten säätely ylöspäin PCBP1 voi säädellä cap-riippumaton mekanismi käännöksen aloittamisesta sydämen kasvaimeen liittyvien geenien kehittämiseen GCA. Tuumorisuppressorina, Alpha-enolaasi voi säädellä c-myc-promoottorin aktiivisuuden muodossa c-myc sitovan proteiinin (MBP-1). MBP-1 voi sitten sitoutua P2 elementti c-myc-promoottorin ja kilpailla TATA-box sitovan proteiinin (TBP) tukahduttaa transkription c-myc [29, 30]. Toisaalta, alas-säätely Alpha-enolaasi- on sopusoinnussa työn Chang YS et al.

• Kliininen merkitys palliatiivisen gastrectomy selviytymisen potilaiden parantumattomasti edennyt mahasyöpä: järjestelmällinen katsaus ja meta-analysis
• MicroRNA-645, säädellään ylöspäin ihmisen adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteyksessä, estää apoptoosin kohdentamalla tuumorisuppressoriproteiinia IFIT2