Proteome Analyse vum Mënsch gastric Cardia adenocarcinoma vun Laser knipsen microdissection

Proteome Analyse vum Mënsch gastric Cardia adenocarcinoma vun Laser knipsen microdissection VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung D'Heefegkeet vun gastric härzwierksam adenocarcinoma (GCA) gouf an de leschten zwee Joerzéngten zu China waarden, mä de molekulare Ännerungen ze carcinogenesis Zesummenhang hunn net gutt Zeeche gewiescht. VerfÜgung Method an dëser Etude VerfÜgung, déi mir engem Komparativ proteomic Approche der malignant an nonmalignant gastric Cardia epithelial Zellen vun navigated Laser knipsen microdissection (LCM) aus vläit chirurgesch uplanzen vum Mënsch GCA isoléiert ze analyséieren.
Resultater VerfÜgung Twenty-siwen Flecken zu 23 Proteinen entspriechend konsequent waren differentially reegelen. Fifteen Proteinen sech weider-reegelen gewisen gin, während aacht Proteinen verwandelt reegelen-gin gewise goufen an malignant Zellen am Verglach mat nonmalignant columnar epithelial Zellen. D'identifizéiert Proteinen wossten zu ukuerbelt, chaperone, antioxidation, Signal transduction, apoptosis, Zell Prolifératioun, an dat Équipe ze ginn. Zousätzlech, Ausdrock vun HSP27, 60, an Prx-2 zu GCA uplanzen confirméiert weider duerch immunohistochemical a westlech blot analyséiert. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung eng effikass Strategie Dës Donnéeë weisen, datt d'Formatioun vun navigated LCM mat 2-DE Editus fir entdecken Proteinen datt zu GCA differentially ausgedréckt ginn. Esou Proteinen am elucidating de molekulare Mechanisme vun GCA carcinogenesis bäidroen kënnen. Ausserdeem, stellt d'Kombinatioun Potential Medeziner biomarkers datt Hëllef an fréi ze erkennen a Potential therapeutesch Ziler gëtt. VerfÜgung Background VerfÜgung Verschidde Analysë vun Kriibs Heefegkeet Daten aus westlechen Länner culled hunn séier Tariffer vun adenocarcinoma vun der esophagus an gastric Cardia Aarbechtsmarché de leschte Jorzéngten, am Verglach mat der stabil an zréckgeet Tariffer fir esophageal squamous Zell carcinoma (SCC) an distal gastric adenocarcinoma (DGA) [1-3]. Dëse Phänomen ass och visuell an China, ausser dass d'waarden Heefegkeet vun gastric Cardia adenocarcinoma (GCA) schéngt virun allem méi héich wéi d'Heefegkeet vun esophageal Kriibs. Beweiser datt GCA ass eng eegestänneg Medeziner Entity- wéi seng pathogenesis a Gefor Faktoren aus DGA ganz verschidden sinn. Dofir, GCA ass wäit méi verwandelt, mat enger méi héijer Heefegkeet vun lymph Node Metastasen an engem aarmen hätt wéi DGA [4]. De Joresbudget Heefegkeet vun GCA ass 50 /100.000 a vläicht souguer esou héich wéi 190 /100.000 vun e puer Regioune vu China [5] gin. Déi relativ asymptomatic Natur an d'Grondsteen vun der Krankheet an dem Manktem vun adequate Duerchmusterung Tester hunn zu enger Majoritéit vun GCA Patienten Schoss op en schon fortgeschratt Etapp vun der Krankheet diagnostizéiert ginn. Sou, ass et néideg de molekulare Mechanismus vun carcinogenesis ze verstoen an d'biomarkers fir d'fréi Diagnos an efficace Behandlung vu mënschlechen GCA z'identifizéieren. VerfÜgung Viru Kuerzem, huet d'proteome als komplementar Komponent vun der Nepgen erweist. D'supposition ass datt et drastesch an unraveling der biochemical a Fro gestallt Mechanisme vun komplex multivariate Krankheeten um funktionell molekulare Niveau hëllefe kéinten. Obwuel genetesch stattfannen an /oder ëmhirsträifend Gentherapie Ausdrock enger Krankheet underlie kann, de biochemical Base fir déi Krankheeten sinn duerch FAQ Mängel verursaacht. Dofir, eng Analyse vun de globale FAQ Heefegkeet vun de Mënscherechter erhéijen, Kriibs proteomics genannt, konnt vill Chancen an Erausfuerderunge Offer an Erkenntnesser nei entholl lues an therapeutesch Ziler souwéi an entholl pathogenesis Versteesdemech. Moment, zwee-Dimensiounen gelies electrophoresis (2-DE) a Mass spectrometry (MS) sinn am meeschte verbreet ugestallten Handwierksgeschir fir ofgetrennt an Erkenntnesser Proteinen. Allerdéngs, heterogeneity ass ëmmer eng Suerg vun de Studien vum Mënsch entholl Otemschwieregkeeten. Obwuel Zell Kultur eng Approche ass dëse Problem iwwerwonnen, kéint et net korrekt der molekulare Evenementer vertrieden Plaz vun der haiteger Otemschwieregkeeten Vereedegung vun deem se ofgeleet goufen [6]. E Vergläich tëschent Mënsch Aarbecht Zell Linnen an entholl Zellen aus der selwechter Patienten gewisen, datt 20% vun de FAQ Profiler beschiedegt goufen [7]. Laser knipsen microdissection (LCM) ass eng rezent Entwécklung déi benotzt kënne héich Vertrieder subpopulation vun Zellen aus komplex heterogen Otemschwieregkeeten Echantillon ze erklären [8]. Dës Technik ass an engem ënnerschiddlechen vill Studien benotzt afgerappt Analyse bei der DNA an RNS Niveauen, och global Gentherapie Ausdrock profiling [9] an Analysë vun der proteome vun Aarbecht [7], Colon [10], hepatocellular ganz erfollegräich benotzt [11 ], Broscht [12], an pancreatic erhéijen [13]. Allerdéngs huet d'Kombinatioun vun 2-DE an MS ni un der Etude vun der Mënschheet GCA applizéiert ginn. VerfÜgung Dës Etude Zieler der carcinogenesis vun GCA zu Profil an GCA-spezifesch Krankheet-verbonne Proteinen als potentiell Medeziner biomarkers fir fréi ze erkennen an ze identifizéieren an nei therapeutesch Ziler. Mir standing navigated LCM ze beräicheren souwuel d'malignant an nonmalignant gastric härzwierksam epithelia Zellen aus vläit chirurgesch uplanzen vum Mënsch GCA. D'Proteinen vun deenen Zellen ofgebaut goufen déi 2-DE getrennt. Ënnerscheed FAQ Flecken sech duerch peptide Mass Fangerofdrock (PMF) baséiert op Matrixentgasung-assisteiert Laser Eispist /Ionisatiounsgehalt Zäit-vun-Vol Mass spectrometry (MALDI-Ënnerportal MS) an Datebank Recherche identifizéiert. D 'Validitéit vun dëse Conclusiounen vun immunohistochemical a westlech-blot bestätegt gouf analyséiert. VerfÜgung Method VerfÜgung spontan VerfÜgung IPG Strips (pH 3-10 nonlinear) an IPG gefiermt Léisungen (pH 3-10 nonlinear) aus Amersham kaaft huet Pharmacia Biotech (APB, Schweden). DTT, urea, thiourea, Tris huel, Suerge-100, Haréi, glycine, acrylamide, methylenebisacrylamide, SDS, TEMED, ammonium persulfate, Sëlwer kontrolléiren, Trypsin (sequencing Schouljoer), ACN, an TFA sech aus Fläch (St. Louis kaaft, MO, USA). Endlech, war de komplette protease inhibitor Cocktail aus Roche (Lewes, UK). Milli-Q Schouljoer Waasser war fir all d'Léisungen benotzt. GCA Echantillon VerfÜgung néng Puer Mënsch gastric Cardia adenocarcinoma an hir bascht nontumourous Cardia Stoffer VerfÜgung waren um zweete laizistesch Spidol vun immens no engem chirurgesch resection bannent 30 Minutte kritt " eng Jiaotong University zu 2005 (Table 1). Fir kloer Beräicher vun oppent oder necrosis ze verhënneren, huet de Echantillon vun de Bord vun der erhéijen procured. Si waren direkt an flëssegem Stéckstoff gefruer an bei -80 ° C bis benotzen gespäichert. Informéiert Autorisatioune goufen aus all Patienten kritt. Mëttlerweil, évaluéiert zwee erfuerene pathologists der entholl senger Analyse vun engem microscopic Ënnersiche vun der samples.Table 1 Séminairen a histological Donnéeën vun Patient entholl Echantillon VerfÜgung Case

Age

Gender

Locationa)

Size(cm)

Grade

1
58
M
Within 2 cm vun GEJ VerfÜgung 1,5 × 2 VerfÜgung Mëttelméisseg ënnerscheet VerfÜgung 2 VerfÜgung 63 VerfÜgung M VerfÜgung An 2 cm vun GEJ VerfÜgung 5 × 6 VerfÜgung Mëttelméisseg ënnerscheet VerfÜgung 3 VerfÜgung 46 VerfÜgung M VerfÜgung an 2 cm vun GEJ VerfÜgung 4 × 5 zur VerfÜgung Mëttelméisseg VerfÜgung 4 VerfÜgung 60 VerfÜgung M VerfÜgung an 2 cm vun GEJ VerfÜgung ënnerscheet 2 × 2,5 VerfÜgung Ma ënnerscheet VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 73 VerfÜgung M VerfÜgung an 2 cm vun GEJ VerfÜgung 3 × 1 VerfÜgung Ma ënnerscheet VerfÜgung 6 VerfÜgung 70 VerfÜgung M VerfÜgung an 2 cm vun GEJ VerfÜgung 2 × 1 VerfÜgung Ma ënnerscheet VerfÜgung 7 VerfÜgung 55 VerfÜgung M VerfÜgung an 2 cm vun GEJ VerfÜgung 2 × 3 VerfÜgung LINN ënnerscheet VerfÜgung 8 VerfÜgung 51 VerfÜgung M VerfÜgung an 2 cm vun GEJ VerfÜgung 4 × 6 VerfÜgung LINN ënnerscheet VerfÜgung 9 VerfÜgung 63 VerfÜgung M VerfÜgung an 2 cm vun GEJ VerfÜgung 3 × 2,5 VerfÜgung LINN ënnerscheet VerfÜgung engem) Location: Biewen vun entholl Otemschwieregkeeten VerfÜgung fir LCM VerfÜgung Moment Sample Virbereedung (8 um décke) sech op drënner Géigewier (precleaned engem Nodeems benotzt, mat deionised Waasser gewäsch, a vun Ethanol) mat enger Leica CM 1900 cryostat (Chambre Temperatur -28 ° C zappt). D'Sektiounen sech entweder bei -80 ° C oder huet am cryostat Chambre virun LCM gespäichert. Haematoxylin staining war nëmmen fir Iwwerwachung vun Otemschwieregkeeten Rubriken duerchgefouert a war verzweifelt LCM net benotzt. Sektiounen sech fest (70% Ethanol fir 1 min), haematoxylin Kierchefënster an léif (70% Ethanol fir 45 ass, 95% Ethanol fir 45s, 2 × 100% Ethanol fir 30s, an duerch xylene 2 × fir 5 min duerno). Mëttlerweil ware unstained Rubriken fir LCM benotzt. Si waren fest (70% Ethanol fir 30s), an deionised Waasser fir 10s gewäsch, a léif (70% Ethanol fir 15s, 95% Ethanol fir 15s, 2 × 100% Ethanol fir 15s, an duerno vun xylene 2 × fir 1 min ). Komplett protease inhibitor Cocktail Pëllen sech VerfÜgung LCM Navigated VerfÜgung No Bauer an eppes, unstained Rubriken sech Loft gedréchent an microdissected mat der Arcturus PixCellα System (Arcturus, Mountain View, CA, USA). LCM microscope engem haematoxylin Kierchefënster Rubrik nieft dem eent vun Interessi Radioberäich. Dëst Bild ass op der LCM Computerbildschierm ugewisen benotzt LCM Bild Analyse Software (Arcturus, USA), a gouf als Plang benotzt fir d'Regioun fir dissection op eng bascht unstained Rubrik delimit. D'Sektiounen sech dann eng 15 um Duerchmiesser Laser hëlze benotzt ageholl typesch bei 50-80 mV Muecht mat duech Dauer vun 3-10 ms an Maschinn Pistoul Modus a mat engem Laser misst Frequenz vun 1 Schoss pro 500 ms. Op der Moyenne, tëscht 10,000-12,000 ëmgetosch goufen pro Kap geholl, an ongeféier 25,000-30,000 Zellen sech pro Mutz kritt. All Mutz war bannent enger Stonn ageholl. Baséierend op engem virsiichteg review vun der histologic Rubriken, war all dissection geschate ≥ 95% vun der gewënschter Zellen ze enthalen. VerfÜgung Microdissection Mutzen an 0,5 microcentrifuge Krunn ML gesaat huet mat 50 ech vun engem lysis Prellbock (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w /v Haréi, 65 mm DTT, 0,5% v /VTX-100, 40 mMTris-Base, a komplett protease inhibitor Cocktail). Dunn huet d'Zellen vun Stuerz vun iech duerno vortex-Vermëschung fir 1 min an dowéinst Pulsatiounsperiod-centrifugation bei 12, 000 × g solubilised. Uschléissend, Stoffer aus Multiple Mutzen (ronn 800.000 ~ 1.000.000 Zellen) huet an der selwechter lysis gefiermt ofgebaut, bis genuch Material gesammelt haten. D'Echantillon waren um 4 ° C bei 40.000 × g fir 1 Stonn centrifuged. Wou néideg, supernatants sech bei -80 ° C bis weider benotzt ginn. Protein Konzentratioun war vun der Bradford Method alles. VerfÜgung 2-DE VerfÜgung Déi éischt-Dimensiounen isoelectric Fredi (IEF) war duerchgefouert op Pharmacia Immobiline IPG DryStrip System (Uppsala, Schweden). Fir d'éischt Dimensioun vun electrophoresis, d'Echantillonen mat 60 ug FAQ fir Analyse gels sech mat engem abordablel Léisung (7 M urea, 2% w /v Haréi, 50 mm DTT, 0,5% v /v IPG Prellbock (pH zu 250 UL verdënntem 3-10 nonlinear), an Spuer bromophenol blo), ier op 13 cm IPG Strips Luede (pH3-10 nonlinear). IEF war standing dann laut IPGphor electrophoresis Eenheet benotzt fir d'Uweisungen d'Hiersteller. Doropshin huet sech d'Dicher mat enger Léisung equilibrated (6 M urea, 30% v /v glycerol, 2% w /v SDS, an 50 mm Tris-HCl, pH 8,8), reduzéiert mat 1% w /v DTT fir 15 min , an alkylated mat 2,5% w /v iodoacetamide fir 15 min. Strips sech dann zu electrophoresis Prellbock (25 mm Tris huel, 192 mm glycine, an 0,1% w /v SDS) rinsed, applizéiert zu 11% acrylamide gels, an zouene mat ageschmolt agarose (0,5% w /v agarose zu electrophoresis gefiermt mat engem Spure vun bromophenol blo). SDS-PAGE war mat vertikalen CHAMBERS Hoefer SE 600 duerchgefouert an enger Tris-glycine Prellbock (25 mm Tris an 192 mm glycine) mat 0,1% w /v SDS, mat initialen Trennung op engem konstante 10 MA /gelies fir 30 min duerno vun 20 MA /gelies. Déi zweet-Dimensiounen SDS-PAGE entwéckelt gouf bis d'bromophenol blo Hoerfaarw Bewaacher ënnen vun der gelies erreecht hat. D'total Laf Zäit war typesch 4 bis 4,5 Stonnen. Gels sech zu 10% v /v acetic Seier, 40% v /v Ethanol virun drëm fir 30 min an enger gefiermt wouvun 30% v /v Ethanol, 0,2% w /v Natrium thiosulphate, an 0,83 M Natrium acetate fest. Dëst war déi dräi 15 min Mëtten an deionised Waasser gefollegt. D'Proteinen sech dann fir 20 min mat 0,1% w /v Sëlwer Nitratveruerdnung Kierchefënster, zweemol am deionised Waasser fir 1 min gewäsch, an zu 2,5% w /v Natrium kënne mat 0,04% v /v formaldehyde (37% Léisung) entwéckelt. D'Entwécklung huet mat 1% v /v acetic Seier opgehalen, an d'gels waren dräi Mol am Waasser. VerfÜgung Image Analyse a statistesch Analyse VerfÜgung Umax ImageScanner (Amersham Biosciences) Katakombe benotzt der gels ze scannen, iwwerdeems Image Master ™ 2D Platin Version 5.0 Software (Amersham Biosciences) war fir Plaz ze erkennen, quantification, an Aklang benotzt. D'Intensitéit vun all Plaz war vun% Volumen laachen. Daten goufen dunn 11,5 an Excel benotzt SPSS fir Windows analyséiert. Student d't VerfÜgung Azeton benotzt gouf d'Differenzen an FAQ Niveau tëscht GCA an Net-entholl Echantillonen, mat engem Selbstvertrauen vun 95% ze analyséieren. VerfÜgung MALDI-Ënnerportal-MS an Datebank Sich VerfÜgung, aus a vill verschidde Flécken fir Analyse vun MALDI-Ënnerportal MS ausgewielt. Protein Flécken vun interesséieren sech nees kleng Stécker vun destaining an wäschen mat deionised Waasser fir e puer Mol duerno excised an Schwéngs- bis giel Faarw verschwonnen. Gelies Stécker sech dann mat 25 mm ammonium bicarbonate, léif mat ACN rinsed, an zu engem Vakuum Fall gedréchent. Uschléissend, Proteinen am-gelies huet Nuecht op 37 ° C mat 0,02 ug /ech trypsin verdaut. Tryptic peptides sech dann zu enger Léisung mat 50% v /v ACN an 0,2% v /v TFA-du opgeléist. Eng 2 ech aliquot war mat 4 UL vun Matrixentgasung Léisung CHCA (e-cyano-4-hydroxcinnamic Seier, 10 mg /ML zu 50% v /v ACN, 0,2% v /v TFA) op enger Prouf zappen iewer an zu Loft erlaabt dréchen. D'gedréchent Flecken sech dann zu engem Voyager DE MALDI-Ënnerportal MS (Framingham, MA, USA) analyséieren. Dëst war dann déi Spektrometer an engem positive ioun Modus lafen an Spigelteleskop Modus mat de folgenden Astellungen: schnelle Volt, 20 KV; gride Volt, 94%; guide Drot Volt, 0,01%; an engem Retard vun 200 NS. Spektren sech um 3200 Formatioun pro Spektrum mat 80 Wäitschëss manuell mam Laser Intensitéit chrétienne. Dunn huet d'Mass Rei tëscht m VerfÜgung /Z VerfÜgung 500 an m VerfÜgung /Z Formatioun VerfÜgung 5000. Interne Eechung applizéiert gouf benotzt angiotensin II an Insulin B Kette Moundalpen bei 912,08 Da an 3495,95 Da bzw.. VerfÜgung Proteinen sech duerch peptide Mass fingerprinting mat der Sich Programm Aldente [14] mat der folgender Sich Parameteren applizéiert identifizéiert: SWISS-PROT an TrEMBL sech als d'FAQ Haaptrei Datenbanken benotzt; eng Mass Toleranz vun 100 ppm an eng onkomplett Rëss sech erlaabt; carboxyamidomethylation, oxidised methionine, an phosphorylation sech wéi méiglech Ännerungen considéréiert; de Minimum Zuel vun reagéiert-peptides war 4; an der peptide ioun war [M + H] +. VerfÜgung Immunohistochemical a westlech blot Analyse VerfÜgung Fir den Ausdrock Musteren vun dräi Proteinen am GCA Stoffer validéieren, immunohistochemistry Leeschtung war mat formalin-fix a paraffin-Ënnerbewosstsinn Otemschwieregkeeten ugedait datt mat 2-DE Echantillon reagéiert huet. Dewaxed 5 um décke Rubriken huet fir 3 min mat engem 0.3% Waasserstoff peroxidase behandelt a mat engem Outil antibody fir 30 min. No Hëtzt-mediated antigen retrieval, Rubriken huet Nuecht op 4 ° C mat Primärschoul antibody incubated wéi follegt zesummen: HSP27 (Fläch, St. Louis, MO, USA), 1: 500; HSP60 (Santa Cruz, Amerika), 1: 300; an Prx-2 (Santa Cruz, Amerika), 1: 150. Sektiounen sech dann mat engem peroxidase-Label antibody incubated (1: 500). Mat diaminobenzine entwéckelt, an counterstained mat hematoxylin VerfÜgung Fir westlech blot Analyse, d'FAQ Echantillon (30 ug) benotzt an 2-DE waren op 12% lafen SDS-PAGE, op PVDF Schläimhait transferéiert, an dann mat PBS /5% z'iesse Mëllech /0,01% Tween fir 2-4 Stonnen bei Raumtemperatur gespaart. Primärschoul antibody war zu erauszesichen gefiermt verdënntem a war dobäi wéi follegt zesummen: HSP27, 1: 200; HSP60, 1: 300; an Prx-2, 1: 200. Uschléissend, et war mat engem horseradish peroxidase (HRP) incubated -conjugated Secondaire antibody an enger HRP-conjugated anti-GAPDH /β-actin antibody selwecht FAQ Luede fir 1-2 Stonnen bei 37 ° C oder Raumtemperatur zu all Geschäftswelt ze confirméieren. D'Echantillon waren fir 30-60 ass mat verstäerkte chemiluminescence gewäsch a festgestallt (Minipore). VerfÜgung Resultater VerfÜgung Profil Differenzen tëscht navigated LCM Echantillon a ganz undissected cryostat Stoffer VerfÜgung d'Auswierkunge vun navigated LCM op d'Profiler vun diskutéieren Otemschwieregkeeten FAQ, standing mir 2-dE FAQ Profiler vun ganzt undissected cryostat Stoffer an LCM-Echantillon vun GCA. Figur 1 weist e Beispill vun der navigated LCM Prozess. Majoritéit vun de geneeë Flecken an der Leschten Net-entholl an entholl Stoffer konnt an der ganzer undissected cryostat Stoffer observéiert ginn, ausser e puer Flecken. Mä et ginn nach e puer Flecken op der ganzer undissected cryostat Otemschwieregkeeten fonnt, déi net zu zwee LCM Echantillon observéiert ginn hätt. Sou, hätt dës Technologie net nëmme beräichert Net-entholl an entholl epithelial Zellen mä kéint och de kontaminéierte zu Stoffer wéi glycosilée [10, 11] manner. Desweideren, konnt de navigated LCM Prozess d'Auswierkunge vun staining op FAQ Trennung vun 2-DE [15] eliminéiert. Sou, ënnerstëtzen eis Daten déi brauchen navigated LCM an der proteomic Studie vun GCA Stoffer zu Leeschtunge. Figur 1 Navigated Laser knipsen microdissection vun entholl Otemschwieregkeeten. (A) Haematoxylin-Kierchefënster gastric Cardia adenocarcinoma; (B) Unstained GCA Otemschwieregkeeten; (C) klinescher Otemschwieregkeeten der microdissection; (D) Text entholl Zellen op LCM Film. VerfÜgung Profil Differenzen an FAQ Ausdrock tëscht GCA Stoffer a ronderëm Net-entholl Stoffer VerfÜgung Mir standing engem navigated LCM an 2-DE fir reagéiert Puer entholl Stoffer an der Géigend Net- entholl Stoffer aus GCA Patienten. Ongeféier 800-1,000 FAQ Flecken sech duerch Sëlwer staining fonnt. Ze moossen reproducibility, mécht all Prouf der Experimenter dräi Mol. Et goufen 905 ± 74 an 867 ± 51 FAQ Flecken an der Plang vun GCA an Net-entholl gastric härzwierksam Otemschwieregkeeten, bzw.. D'stemmt Flecken waren 799 ± 29 an 727 ± 34 getrennt, an de respektiven Duerchschnëtt passende Saz war 88,2% a 83,8%. Ausserdeem war den Duerchschnëtt Positioun deviation vun reagéiert Flecken 1,031 ± 0,205 mm an 1,44 ± 0,11 mm am IEF an SDS-PAGE Richtung, bzw.. Obwuel d'Bild Analyse gewisen, datt dës 2-DE Kaarten reproducible waren, goufen et kleng Differenzen an der Intensitéit an Zuel vun Flecken. Trotzdeem, Teamchef eng Analyse vun der gels 27 FAQ Flecken hir intensities variéiert méi a konsequent tëscht Net-entholl an entholl Stoffer (Figebam. 2). D'nennen vun normalized Plaz intensities vu Kriibs ze paraneoplasis Stoffer fir jiddereng vun de Proteinen vun interesséieren sech berechent. Flecken weist eng zwee-Weeër Ënnerscheed an der Statistik Bedeitung (p &Si besteet; 0,05) sech ausgewielt. Dräi vun den 2-DE Resultater goufen duerch immunohistochemical a westlech blot Analysë confirméiert. Figur 2 2-DE Kaart vun malignant an nonmalignant gastric Cardia Otemschwieregkeeten. All d'Kaarten gewise ginn aus dem selwechten Patient preparéiert. (A) 2-DE Kaart vun ganzt undissected cryostat Stoffer; (B) 2-DE Kaart vun Net-entholl Otemschwieregkeeten der LCM; (C) 2-DE Kaart vun GCA Otemschwieregkeeten der LCM. VerfÜgung Protein Identifikatioun VerfÜgung zwee ganz undissected cryostat uplanzen an LCM-uplanzen sech fir FAQ Identifikatioun benotzt. Twenty-siwe verschiddene FAQ Flecken tëscht GCA Stoffer an Net-entholl Stoffer Ëmfeld sech excised. Mä nëmmen 23 Proteinen sech duerch MALDI-Ënnerportal-MS (Table 2) identifizéiert. Dëse Phänomen ass wahrscheinlech wéinst Post-respektiv Modifikatioune wéi peroxiredoxin 1 (Prx-1), déi zu zwee bascht Flecken dobäi war (Figebam. 2, Plaz 11). Dës Proteinen ausseet an all vun den folgenden: Zell Prolifératioun an dat (ANXA2, ANXA4, hnRNPA2 /B1), apoptosis (Prx-1, Prx-2, GSTP, VDAC, ETFB), ukuerbelt (ADH1C, AKR1C3, CA2, GATM ), protease dinn (CTSD, PACSIN1), cystoskeleton (Actin 1, Keratin 8), chaperones (HSP27, 60, 70, PDIA3), an RNS bindend an Transkriptiouns (hnRNPH3, PCBP1, ENO1). Figur 3 weist de PMF Kaarten vun HSP60.Table 2 Proteinen mat Ënnerscheed Ausdrock tëscht GCA entholl Stoffer an bascht vläit Net-entholl Stoffer vun MALDI-Ënnerportal MS VerfÜgung Up-Regulatioun Proteinen
icon_thumright Nr VerfÜgung Protein VerfÜgung Zougank No.a) Här /pIb VerfÜgung) VerfÜgung Match Cov VerfÜgung (%) c) VerfÜgung T-Test VerfÜgung Ratioune (entholl /Nët-entholl) Also ± Fils VerfÜgung 1 VerfÜgung Heat-Schock FAQ Beta-1 (HSP27) * VerfÜgung P04792 VerfÜgung 23 /6.0 VerfÜgung 9 VerfÜgung 54 VerfÜgung 0,0040 VerfÜgung 3,4279 ± 2,0727 VerfÜgung 2 VerfÜgung Heat Schock 70. kDa FAQ 5 (HSP70) VerfÜgung P11021 VerfÜgung 70 /5.0 VerfÜgung 42 22
0,0030 VerfÜgung 3,2597 ± 1,5314 VerfÜgung 3 VerfÜgung 60 kDa Hëtzt Schock FAQ (HSP60) * VerfÜgung P10809 VerfÜgung 58 /5.2 VerfÜgung 12 zu 37
0,0001 VerfÜgung 2,8308 ± 1,1426 VerfÜgung 4 VerfÜgung Protein disulfide isomerase A3 (PDIA3) * VerfÜgung P30101 VerfÜgung 54 /5,6 VerfÜgung 13 zu 41 VerfÜgung 0,0280 VerfÜgung 4,2105 ± 2,7294 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung Annexin A4 (ANXA4) VerfÜgung P09525 VerfÜgung 36 /5.8 VerfÜgung 10 zu 34 VerfÜgung 0,0140 VerfÜgung 4,7153 ± 7,3434 VerfÜgung 6 VerfÜgung Annexin A2 (ANXA2) VerfÜgung P07335 VerfÜgung 38 /7.5 VerfÜgung 7 VerfÜgung 26 VerfÜgung 0,0150 VerfÜgung 6,0722 ± 5,5431 VerfÜgung 7 VerfÜgung heterogen nuklear ribonucleoproteins A2 /B1 (hnRNP A2 /B1 ) * VerfÜgung P22626 VerfÜgung 37 /9.0 VerfÜgung 16 zu 43 VerfÜgung 0,0050 VerfÜgung 10,7775 ± 9,5547 VerfÜgung 8 VerfÜgung Cathepsin D schwéier Ketten (CTSD) VerfÜgung P07339
27 /5,6 VerfÜgung 12 zu 61 VerfÜgung 0,0012 VerfÜgung 4,3552 ± 3,7703 VerfÜgung 9 VerfÜgung Protein kinase C an casein kinase Realitéiten an Zelle FAQ 1 (PACSIN1) VerfÜgung Q9BY11 VerfÜgung 51 /5.1 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 24 VerfÜgung 0,0028 VerfÜgung 2,6026 ± 1,2147 VerfÜgung 10 VerfÜgung Glutathione S- transferase P (GSTP) * VerfÜgung P09211 VerfÜgung 23 /5.4 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 44 VerfÜgung 0,0026 VerfÜgung 3,8757 ± 2,2198 VerfÜgung 11 VerfÜgung Peroxiredoxin-1 (Prx-1) * VerfÜgung Q06830 VerfÜgung 22 /8.3 VerfÜgung 8 VerfÜgung 59
0,0140 VerfÜgung 4,2744 ± 4,1568 VerfÜgung 12 VerfÜgung puer dovun (RC) -binding protein1 (PCBP1) * VerfÜgung Q15360 VerfÜgung 37 /6,7 VerfÜgung 12 zu 63 VerfÜgung 0,0070
2,7401 ± 0,5321 VerfÜgung 13 VerfÜgung Aldo-keto reductase Famill 1member C3 (AKR1C3) VerfÜgung P42330 VerfÜgung 37 /8.1 VerfÜgung 7 VerfÜgung 25 VerfÜgung 0,0040 VerfÜgung 2,7762 ± 1,1820 VerfÜgung 14 VerfÜgung Glycineamidinotransferase (GATM) VerfÜgung P50440 VerfÜgung 44 /6.4 VerfÜgung 8 VerfÜgung 23 VerfÜgung 0,0390 VerfÜgung 2,7839 ± 0,4680 VerfÜgung 15 VerfÜgung Keratin, Typ II cytoskeletal 8 (Keratin 8) * VerfÜgung P05787 VerfÜgung 54 /5.5 VerfÜgung 9 VerfÜgung 25 VerfÜgung 0,0020 VerfÜgung 3,5063 ± 0,6423 VerfÜgung Down-Regulatioun Proteinen VerfÜgung 16 VerfÜgung Actin , cytoplasmic 1 (Actin 1) * VerfÜgung P60709 VerfÜgung 42 /5.3 VerfÜgung 6 VerfÜgung 30 VerfÜgung 0,0160 VerfÜgung 0,2603 ± 0,1539 VerfÜgung 17 VerfÜgung heterogen nuklear ribonucleoproteins H3 (hnRNPH3) VerfÜgung P31942 VerfÜgung 37 /6.4 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 28 VerfÜgung 0,0015 VerfÜgung 0,6028 ± 0,6229 VerfÜgung 18 VerfÜgung Peroxiredoxin-2 (Prx-2) * VerfÜgung P32119
22 /5.7 VerfÜgung 6 VerfÜgung 24 VerfÜgung 0,0250 VerfÜgung 0,2376 ± 0,1202 VerfÜgung 19 VerfÜgung Carbonic anhydrase2 (CA2) * VerfÜgung P00918 VerfÜgung 29 /6,8 VerfÜgung 6
33 VerfÜgung 0,0130 VerfÜgung 0,3675 ± 0,1270 VerfÜgung 20 VerfÜgung Alpha-enolase * (ENO1) VerfÜgung P06733 VerfÜgung 47 /7.0 VerfÜgung 16 zu 42 VerfÜgung 0,0030
0,2898 ± 0,1340 VerfÜgung 21 VerfÜgung Alkohol dehydrogenase 1c (ADH1C) VerfÜgung P00326 VerfÜgung 40 /8.6 VerfÜgung 7 VerfÜgung 49 VerfÜgung 0,0280 VerfÜgung 0,2287 ± 0,1680 VerfÜgung 22 VerfÜgung Elektronen Transfermaart flavoprotein subunit b (ETFB) VerfÜgung P38117 VerfÜgung 28 /8.3 VerfÜgung 6 VerfÜgung 26 VerfÜgung 0,0240 VerfÜgung 0,2655 ± 0,1415 VerfÜgung 23 VerfÜgung Volt-ofhängeg anion -selective Kanal (VDAC) * VerfÜgung P21796 VerfÜgung 31 /8.6 VerfÜgung 7 VerfÜgung 39 VerfÜgung 0,0120 VerfÜgung 0,4474 ± ​​0,0297 VerfÜgung engem) Schwäizer-PROT Bäitrëtt keen. VerfÜgung b ) VerfÜgung c) liichtkraaftarm duerginn% VerfÜgung Theoretesch Wäert * D'Proteinen hu virdrun an gastric Kriibs fonnt ginn. VerfÜgung 3 MALDI-Ënnerportal MS Identifikatioun vun Plaz 3 an GCA Dorënner. VerfÜgung Immunohistochemical a westlech blot Analyse fir 27 HSP, 60, an Prx-2 zu GCA VerfÜgung weider ze ermëttelen, ob HSP27, 60, an Prx-2 sinn zu Stoffer ausgedréckt an ze bestëmmen déi Zellen ausdrécklech dës Proteinen, war immunohistochemical Analyse standing formalin-fix benotzt an paraffin- Ënnerbewosstsinn Otemschwieregkeeten ugedait datt mat 2-DE Echantillon reagéiert huet. Den Ausdrock vun HSP27 an 60 hätt zu all cytoplasms vun carcinoma Zellen ze gesinn, wann et an e puer vun de cytoplasms vun columnar epithelial (Figebam. 4A-D) vun Net-entholl Stoffer gesinn gin konnt. an der carcinoma Zellen ausgedréckt gin, mee éischter an e puer vun de cytoplasms vun columnar epithelial Zellen (Figebam. 4E, F) am Géigesaz, war Prx-2 bal net fonnt. Fir dës FAQ Ausdrock Niveauen, westlech blot Analyse ënnersicht war standing och d'selwecht Stoffer benotzt (Figebam. 5). Wéi erwaart, HSP27 a 60 ware fonnt konsequent gin héich zu entholl Otemschwieregkeeten ausgedréckt, hierkommen Prx-2 opgeléist gouf. Figur 4 Immunohistochemical Analyse fir HSP27, 60, an Prx-2 zu Mënsch normal gastric Cardia an GCA. Ausdrock vun HSP27 (A), 60 (C), an Prx-2 (E) waren an der Zytoplasma vun entholl Zellen; Ausdrock vun HSP27 (B), 60 (D) an Prx-2 (F) sech zu Zytoplasma vun normal columnar epithelial Zellen fonnt; Vergréissert: E-F × 40, counterstained mat hematoxylin VerfÜgung 5 Western blot Analyse D'Grondidee fir d'fräi Meenungsäusserung vun HSP27 ausseet, 60, an erofgaangen Ausdrock vun Prx-2 zu GCA Stoffer.. . GAPDH an β-actin als Referenze benotzt goufen VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Cardia ass d'Präparaten borderland tëscht der esophagus an de Mo.; Dohier och, do ass konstant kontroverse betreffend hir Relatioun zu Conditioune vun epidemiology, Medeziner Fonctiounen, a Klassifikatioun ënnert esophageal adenocarcinoma (W), GCA, an DGA. Fir hir FAQ Profiler vergläichen, gesichte mir der Literatur dës Proteinen ze fannen. Dräizéng aus 23 Proteinen goufen zu DGA virdrun (Table 2) fonnt. Ënnert hinnen, HSP27, 60, 70, PDIA3, an CA2 hutt de selwechten Ausdrock Muster an GCA an DGA. Am Géigesaz, war zu MOL fonnt engem niddregen-Niveau Ausdrock vun HSP27 [16-20]. Also, ass d'tumourigenesis vun GCA anescht aus MOL an DGA, an domat misst GCA eng eegestänneg agebousst Entity- ginn. VerfÜgung bewosst heterogeneity e wesentleche Barrière fir de molekulare Analyse vun normal an diseased Stoffer gouf. Éischt vun Emmert-Buck et al beschriwwen. an 1996, ass Laser knipsen microdissection eng staark a preziser gehaen zu FAQ Ännerungen an engem bestëmmte Ziel vun Zellen zu engem niddregen-Ënnerhalt System Etude dass Bedreiwen ass einfach [8]. Wéi gewinnt, si verschidde histochemical eweg vun der Otemschwieregkeeten Rubrik benotzt der dissection Prozess ze guidéieren. Allerdéngs hunn eng Rei Fäll vun 2-DE [21, 22] moderéiert ze dramatesch Konsequenzen vun staining op FAQ Trennung gewisen. Fir staining als potentiell gefouert Discussioun Effekt eliminéiert, navigated LCM gouf kierzlech entwéckelt. Et notzt eng Kierchefënster Rubrik der dissection vun der unstained bascht specimen zu Guide [23]. Dës Technik ass erfollegräich vun der Etude vun Gehir Echantillon [15] applizéiert. Zousätzlech, wéinst der typesch morphological Charakteristiken vun der gastric härzwierksam iwwerflächlech columnar Zell an der Fra drüs, si einfach op eng léif Rubrik ouni staining z'identifizéieren. Dowéinst, gouf navigated LCM optesch Strategie an eisen proteomics Approche. An dëser Fuerschung, variéiert d'Zuel vun LCM-ofgeleet nonmalignant an malignant Zellen aktiv a sech dacks kleng am Verglach mat der ganzer undissected cryostat Stoffer, futti der Profiler dass tëscht der LCM Echantillonen an der undissected mannste ähnlecht goufen. Dëst uginn, datt d'navigated LCM eng Konsequenz Approche fir d'Etude vun gastric härzwierksam Otemschwieregkeeten kann an datt et ass kompatibel mat 2-DE an MALDI-Ënnerportal MS. VerfÜgung Mir kritt d'FAQ Profil vun GCA vun den Ännerungen an d'FAQ vergläichen Profiler vun Net-entholl Stoffer Ëmfeld. Fir eenzel Ënnerscheeder reduzéieren, Otemschwieregkeeten Echantillon waren aus dem selwechten Patient kritt, Meldunge eis Ënnerscheed FAQ Ausdrock ënner ähnleche Frankräich Hannergrond ze studéieren. Fir de beschte vun eisem Wëssen, gemellt mir déi éischt proteomic Analyse vun GCA. Vun der 27 ausgewielt FAQ Flecken, 23. Proteinen an de molekulare Mass Gamme vu 15 bis 75 kDa a mat engem isoelectric Punkt tëscht 3 a 10 goufen déi 2-DE an MALDI-Ënnerportal MS identifizéiert. Déi meescht vun dëse Proteinen sech virdrun beschriwwen als differentially entweder um mRNA Niveau oder op d'FAQ Niveau an aner Zorte vu mënschlechen Kriibs ausgedréckt. VerfÜgung HSPs sinn eng Grupp vu Stress Proteinen vun verschiddenen Zorte vun Ëmwelt- a pathophysiologic insults entschlof. An dëser Etude, Co-up-Reglementer vun HSP27, 70, an 60 goufen der gastric härzwierksam entholl Stoffer fonnt. Als chaperones, konnt HSP27 an HSP70 apoptosis inhibit mat apoptosome an der caspase vun Aktivéierung komplex [24] andeem proposéiert, hir Rollen am entholl Werdegang a Resistenz zu Behandlung Basisdaten [25]. Vill Studien weisen, dass HSP27 an HSP70 overexpressions aarmséileg hätt Signal an engem schlechte Äntwert ze Chimiotherapie virauszesoen. HSP60 schéngt e Schlëssel endogenous demagogesch Vermëttler gin an viraussiichtlech vun beschiedegt Zellen verëffentlecht ass. Desweideren, zesumme mat HSP70, huet HSP60 eng Roll an antigen Presentatioun vun malignant Krankheeten [26]. HSPs sinn och an Broscht, colorectal, gastric, an Aarbecht carcinomas [10, 25] overexpressed. Dofir, overexpression vun HSP27, 70, an 60 kann nëtzlech biomarkers fir carcinogenesis zu GCA gin an kann mat dem Ofschloss vun de dat an der Iwwregens hätt vun GCA verbonne ginn. VerfÜgung Dorënner identifizéiert Proteinen, zwee Proteinen an d'Regulatioun vun Transkriptiouns implizéieren an Ausdrock vun entholl-verbonne Genen. PCBP1, an GCA up-reegelen, ass eng RNS chaperone Post-transcriptional regulator. Et ass dat PCBP1 Gewise ginn, zesumme mat PTB-1 an hnRNPK, Kontrollen puer proto-oncogene Genen an apoptosis-Zesummenhang Genen Ausdrock, wéi Bag-1, c- VerfÜgung myc, Apaf-1, XIAP, an DAP5, duerch d'Aktivitéit vun intern Ribosom Element Segment Spannend (IRES). PCBP1 ass néideg der RNS an der Regioun opzemaachen der Ribosom Element Fënster mat, iwwerdeems PTB-1 kann fir Ribosom Rekrutement [27, 28] verlaangt ginn. Kuerzem, Pickering, B.M. et al. beschriwwen, datt zu metastatic Fähegkeet der glycan Deeler vun PCBP1 Zesummenhang wier an eventuell eng Roll an hepatocellular carcinoma Metastasen [27] spillen. Dann de Suivi-Regulatioun vun PCBP1 kann de Cap-onofhängeg Mechanismus vun Iwwersetzung Initiatioun vun härzwierksam entholl-verbonne Genen an der Entwécklung vun GCA regléieren. Als entholl suppressor, kann Alpha-enolase der c-myc Promoteur Aktivitéit an der Form vun engem c-myc bindend FAQ (MBP-1) regléieren. MBP-1 kënnt dann festleeën zu der P2 Element vun der c-myc Promoteur a Konkurrenz mat der TATA-Këscht bindend FAQ (TBP) d'Reunioun vun c-myc zu oofgesinn [29, 30]. Wéinst dem verwandelt-Regulatioun vun Alpha-enolase ass am Aklang mat der Aarbecht vun Chang sten et al.

• Séminairen Bedeitung vun der palliativer gastrectomy op d'Iwwerliewe vu Patienten mat soll fortgeschratt gastric Kriibs: eng systematesch iwwerschaffen an meta-analysis
• MicroRNA-645, an-reglementéiert Mënsch adencarcinoma vun gastric esophageal menaarbecht, bremst apoptosis vun gezielt suppressor entholl IFIT2