Förhållandet mellan hypoxi-inducerbara faktor 1α och p21
WAF1 /CIP1 uttryck cell apoptos och kliniska resultat hos patienter med magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
hypoxi-inducerbara faktor-1α (HIF-1α) spelar en viktig roll i syre homeostas. Uttrycket av HIF-1α-inducerbara gener är associerat med tumörprogression. p21 medierar cellcykelstopp och är en av de nedströms gener som omfattas av HIF-1.
Patienter och metoder
Vi undersökte sambandet mellan HIF-1α och p21 uttryck, apoptos och tumörprogression med hjälp av vävnadsprover erhållna kirurgiskt från 126 patienter med magcancer.
Resultat
Immunhistokemisk analys visade att förlusten av p21 uttryck korrelerade positivt med patientens ålder och tumörstorlek. Lymfkörtel metastas var betydligt vanligare hos tumörer med förlust av p21 uttryck (P = 0,022). HIF-1α-positiv /p21-negativa tumörer hade en lägre apoptotisk index än några andra tumörprover, och patienter med HIF-1α-positiv /p21-negativa tumörer hade också en signifikant sämre prognos än de andra patientpopulationer.
Slutsats
Dessa resultat antyder att förlusten av HIF-1α-beroende p21-uttryck resulterar i minskad apoptos, ökad cellöverlevnad och mer aggressiva tumörer.
bakgrund
oreglerad tillväxt av cancerceller resulterar ofta i hypoxiska betingelser i tumörcell massor. Tumör hypoxi resultat från en obalans mellan förhöjd konsumtion av syre i de snabbt cykling tumörceller och otillräcklig syretillförsel på grund av avsaknaden av en fysiologisk vaskulära nätverket. Flercelliga organismer har utvecklats cellulära mekanismer som förmedlar en kaskad av adaptiva molekylära svar på hypoxi. HIF-1α är en transkriptionsfaktor som aktiverar genuttryck genom bindning till hypoxi responsiva elementet (HRE), en cis-verkande DNA-sekvens som föreligger uppströms om flera gener väsentliga för det cellulära svaret på hypoxi [1]. HIF-1 a-mottagliga gener fungerar även i glykolysen reaktionsvägen och i hematopoes och angiogenes, genom vilka alla celler förvärvar en hypoxi-anpassad metabolism och ökad syretillförsel [2]. Nyligen har HIF-1α vuxit fram som en nyckelregulator i tillväxten av magcancer [3].
Apoptos är en evolutionärt konserverad celldöd mekanism som också förekommer i den adaptiva cellulärt svar på hypoxisk stress. Apoptos är också en viktig garanti mot tumörutveckling. Tumörer som uppvisar förlust av p53-tumör-suppressorgen uppvisar reducerade nivåer av hypoxi-inducerad celldöd och en tillhörande ökning av tumörprogression [4]. P21-genen (WAF1) klonades i en genetisk screen för nedströms effektorer av p53 och separat i en skärm för uppströms regulatorer av cyklinberoende kinaser (CDK: er) såsom CDK-interagerande protein (CIP1) [5]. P21-promotom kan transaktiveras genom HIF-1 i en human prostatacancer cellinje, vilket tyder på att p21 är en HIF-1 målgen [6]. Dessutom var hypoxiinducerad p21 expression upphävts i celler som saknar HIF-1α, men inte i parentala celler [7].
HIF-1α kan därför främja både cellöverlevnad och tillväxtstopp genom induktion av hypoxi-responsiva gener. I den aktuella studien undersökte vi rollen av HIF-1α i hypoxisk kontroll av tumörprogression, genom att undersöka förhållandet mellan HIF-1α uttryck, p21 uttryck och apoptos i vävnadsprover från patienter med magcancer.
Material och metoder
Kliniska material
Försökspersonerna 126 patienter med magcancer (85 män, 41 kvinnor, åldersintervall, 27 till 88 år, medelålder, 65,2 år) som genomgick gastrektomi på vår institution 1994. Kurativ resektion utfördes i 77 patienter och icke-kurativ resektion i 49. resekerade vävnadsprover fixerades i en 10% -ig formaldehydlösning och bäddades in i paraffin. Sektioner (4 um tjocklek) monterades på objektglas. Samtliga prover undersöktes makroskopiskt och histologiskt, baserat på kriterier som föreslagits av de allmänna reglerna för magsäckscancer studien [8]. Histologisk undersökning genomfördes på vävnadsberedningar färgade med hematoxylin och eosin (H & E). I den aktuella studien, var tumörerna uppdelas i två histologiska typer: differentierad typ, innefattande papillär adenokarcinom och tubulär adenokarcinom, och odifferentierad typ, innefattande dåligt differentierade adenokarcinom, klackring cellkarcinom, och mucinöst adenokarcinom. Två paraffinblock framställdes för alla patienter "en innehållande både tumörvävnad och närliggande normal vävnad, och den andra innehåller tumörvävnad att invadera den djupaste nivån av magväggen.
Immunohistokemisk färgning
Samtliga prover immunfärgades med en monoklonal antikropp mot p21 WAF1 /CIP1 (SX118, utspädd 1:50, DAKO, Glostrup, Danmark), p53 (Gör-7, utspädd 1:50, DAKO, Glostrup, Danmark), och HIF-1α (NB 100- 105, späddes 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) [9] efter avparaffinering och rehydrering, objektglasen för p21 och p53 immunofärgning autoklaverades i citratbuffert (0,01 M, pH 6,0) vid 120 ° C under 10 minuter;.. 0,001 M EDTA (pH 8,0) användes för HIF-1αimmunostaining för att underlätta reaktivitet av den fasta inbäddade vävnadsantigen med antikroppen Endogent peroxidas blockerades genom inkubering av proverna i metanol innehållande 0,3% väteperoxid i 10 minuter prov ades sedan sköljdes i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkuberades med normalt kaninserum under 30 min. Sektioner inkuberades med de tidigare nämnda primära antikroppar under 2 timmar vid rumstemperatur, sköljdes därefter tre gånger i PBS. För detektion, använde vi en Histofine SAB-PO (M) kit (Nichirei Corp., Tokyo, Japan). Sektionerna inkuberades sedan med biotinylerad kanin-anti-mus-immunogloblin (Ig; IgG, IgA och IgM; Nicchirei Corp) under 10 minuter, tvättades tre gånger i PBS och behandlades med peroxidas-konjugerad streptavidin under 10 min. Efter en slutlig tvättning i PBS, var peroxidas etiketten detekteras genom inkubering av sektionerna i diamino-bensidin tetrahydro-klorid (DAB) under 3 minuter. Kärnkontra färgning gjordes med hjälp av Mayers hematoxylin lösning. För negativa kontroller, var primära antikroppar ersätts med icke-immun, normalserum. Automatiserad immunohistokemi utfördes också för att stödja immunfärgning som beskrivits ovan, med användning av en Ventana Discovery ™ System (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA).
Utvärdering av immunfärgning
p21-proteinet var närvarande i kärnorna av tumörceller (Figur 1A). I vissa fall, normal magslemhinna uttryckta p21-protein, och nukleär färgning kunde detekteras i de ytliga delarna av tumören, men inte i de djupare regionerna. Vi räknade antalet p21-positiva celler i hela tumör avsnittet, och utvärderade antalet p21-positiv celler i enlighet med djupet av skikten. Mönstret av HIF-1α immunfärgning i tumören var kärn- och /eller cytoplasmiska (Figur 1B). Nukleär färgning av HIF-1α var frånvarande i normal vävnad exklusive cytoplasmisk färgning. I alla prover, p53-protein kunde inte detekteras i normal vävnad, och närvarande i kärnan av tumörceller (Figur 1C). En cell med kärnimmunfärgning för p21, p53 eller HIF-1α (svag eller stark) bedömdes som positiva. Baserat på dessa kriterier, har områden av fokal färgning med den högsta andelen av p53- och p21-positiva nukleär färgning inom djupt tumörvävnad uppskattas. En tumör bedömdes som p21- eller p53-positiva när mer än 10% av tumörcellerna hade nukleär färgning, i överensstämmelse med tidigare rapporter [10]. HIF-1α uttryck var ofta tydlig i regioner runt de invaderande kanterna av tumören, och nekrotiska områden såsom de nära en djup sår. Vi gjorde tumörer som positiva för HIF-1α uttryck om kärnfärgning upptäcktes i mer än 10% av tumörcellerna, oberoende av cytoplasma reaktivitet på alla nivåer [9, 11]. Figur 1 A) p21 uttryck i intilliggande tumörvävnad. Kärnimmunfärgning är uppenbar (ursprunglig förstoring, 100 ×). B) HIF-1α uttryck i invaderande regioner av tumörer. Variationen i intensitet av kärnimmunfärgning är uppenbar, tillsammans med cytoplasmisk färgning (ursprunglig förstoring, 100 ×). C) Kärn immunofärgning av p53 i tumörvävnad (ursprunglig förstoring, 100 ×). D) Tumörvävnad färgas med H & E (ursprunglig förstoring, 200 ×). Tumörvävnad innehåller celler (pil) med kännetecknen för apoptos
värdering för apoptos
Vi gjorde apoptotiska celler som de visar de typiska kännetecknen för apoptos när vävnadsprover färgades med H &. E (figur 1D). Apoptotiska celler identifierades baserat på de karaktäristiska egenskaperna hos apoptos: packnings och migration av kärn- och cell konturer, nukleär fragmentation och utbuktning, och närvaron av apoptotiska kroppar [12]. Apoptotiska celler räknades i vävnadsprover från alla patienter. Fem hög effekt fält (× 400) med den mest förekommande fördelningen av tumörceller selekterades för räknas och mellan 1000 och 1500 tumörceller räknades. Den apoptotiska indexet beräknades sedan som procentandelen av apoptotiska celler. Områden med omfattande nekros undveks. En enda patolog vid varje institution över bilderna och räknade apoptotiska celler enligt de kriterier som beskrivs ovan.
Statistisk analys
BMDP Statistical Package programmet (BMDP, Los Angeles, CA) för IBM (Armonk, NY) 3090 stordator datorer användes för alla statistiska analyser [13]. Dataset jämfördes med chi-kvadrat och Students t-test med hjälp av BMDP 4F och 3S program. Den BMDP 1L program användes för att analysera överlevnadstid med Kaplan-Meier-metoden. Statistisk signifikans sattes vid P < 0,05 nivå.
Resultat
p21 uttryck och klinisk-patologisk faktorer
Tabell 1 visar korrelationen mellan uttryck eller förlust av uttryck av p21 med flera klinisk-patologisk faktorer. Sammantaget 71 (56,3%) av de 126 tumörprover var negativa för p21 uttryck. I tumörer från patienter under 65 år, förlust av p21 uttryck var betydligt mer frekvent än i tumörer från patienter över 65 års ålder (P = 0,026). Förlust av p21 uttryck var betydligt vanligare hos tumörer med stor storlek (P = 0,03), jämfört med mindre tumörer. När det gäller metastaser, tumörer med förlust av p21 uttryck tenderade att visa ökad frekvens av lymfatisk invasion (P = 0,089, tabell 1) och en signifikant högre frekvens av lymfkörtelmetastaser (P = 0,022, tabell 2) än p21-uttryckande tumörer. Tabell 3 visar förhållandet mellan p21 uttryck, och uttrycket av p53 och HIF-1α. Överuttryck av p53 detekterades i 57 (45,2%) tumörer, och HIF-1α uttryck upptäcktes i 49 (38,9%) tumörer. Immunhistokemisk analys visade inte ett samband mellan p21 uttryck och p53 uttryck eller p21 och HIF-1α uttryck (P = 0,444 och 0,609 respektive) .table ett Förhållandet mellan p21 uttryck och klinisk-patologisk faktorer
Faktorer
p21 (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
P-värde
Ålder (år) Hotel <
65 20
40
0,026
65 ≦
35
31
Kön
Man
38
47 0,731
Kvinna
17 24
djup invasion
T1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
histologi
differentierade
35
39
0,325
odifferentierad
20 32
Tumörstorlek storlek~~POS=HEADCOMP Hotel < 3 cm
23
22
0,03
3 cm ≦
22
49
lymfatiska invasion
Negativ
26
23
0,089
Positiv
29
48
Venös invasion
Negativ
42
57
0,595
Positiv
13
14
Tabell 2 Förhållande mellan p21 uttryck och metastaser
vid p21-negativa tumörer (%)
P-värde
Lymfkörtel metastaser
negativ
36/75 (48,0) Review 0,022
Positiv
35/51 (68,6) Review levermetastaser
Negativ
68/122 (55,7) Review 0,447
Positiv
3/4 (75,0) Review Peritoneal spridning
Negativ
62/112 (55,4) Review 0,525
Positiv
9/14 (64,3) Review Tabell 3 Förhållandet mellan p21 och p53, och HIF-1α uttryck
| vid | vid p21
|
| vid | vid Positiv (n = 55)
Negativ (n = 71)
P-värde
p53
Positiv (n = 57) katalog 27
30
0,444
Negativ (n = 69)
28 41
HIF-1α
Positiv (n = 49) katalog 20
29
0,608
Negativ (n = 77) katalog 35
42
apoptos i samband med HIF-1α och p21 uttryck
betyda apoptotiska index över alla 126 tumörer var 8,95 ± 6,24 (intervall 0-37). Tumörer delades in i fyra olika populationer baserat på HIF-1α och p21-expression och medelvärdet apoptotiska indexet för varje grupp beräknades (tabell 4). Tumörer som var HIF-1α-positiva /p21-negativa hade den lägsta apoptotiska index. Det fanns en signifikant skillnad mellan tumörer som var HIF-1α-positiva /p21-negativa, och de som var HIF-1α-negativa /p21-negativa (P = 0,037) .table 4 apoptos i samband med HIF-1α och p21 uttryck
Factor
Apoptotic index
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9,6 ± 7,33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (medelvärde ± SD) katalog Kliniskt utfall i samband med HIF-1α och p21 uttryck
genomsnittlig uppföljning tid för patienterna var 55 ± 28 (± 1 SD) månader (intervall, 1-82 månader). 5-års överlevnad av patienter med p21-negativa tumörer var lägre än den för p21-positiva tumörer, men skillnaden var inte statistiskt signifikant (data visas ej). De 126 patienterna återigen delas in i fyra populationer baserat på HIF-1α uttryck och p21 uttryck, och vi undersökt sambandet mellan HIF-1α uttryck och prognos i p21-positiva eller -negativ tumörprover. Tabell 5 visar 1-, 3- och 5-årsöverlevnaden för patienter och korrelationen med HIF-1α och p21 uttryck. Patienter med HIF-1α-positiva /p21-negativa tumörer hade en signifikant sämre prognos än de andra studiepopulationerna. I synnerhet hos patienter med HIF-1a-positiva tumörer, som hade förlorat uttryck av p21 hade en betydligt sämre prognos än de med p21 uttryck (P = 0,042) .table 5 års överlevnad i samband med HIF-1α och p21 uttryck
Factor
ett-års överlevnad
3-års överlevnad
5-års överlevnad
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0,003 *** P = 0,003 (%) Review Diskussion
Våra resultat visar att förlusten av p21 uttryck korrelerade positivt med yngre patientens ålder, och större tumör. Dessutom har många patienter med p21-negativa tumörer hade lymfkörtel metastas jämfört med dem med p21-positiva tumörer, på en betydligt högre frekvens. Dessa resultat tyder på att förlusten av uttryckning av p21 är involverad i processerna för tumörtillväxt och metastas, i samförstånd med tidigare rapporter [14, 15].
HIF-1α uttryck har kopplats till ett dåligt kliniskt utfall i vissa typer av humana cancerformer [16-18]. Dock har vissa rapporter tyder på att tumör uttryck av HIF-1α inte medför en överlevnadsfördel [18, 19]. Även om de flesta HIF-1 målgener kan främja tumörtillväxt genom deras förbättrade uttryck, HIF-1-aktiverade gener, inklusive p21, har också potential att hämma tillväxten under hypoxiska förhållanden [20, 21]. Ektopiskt uttryck av HIF-1α i endotelceller resulterade i uppreglering av p21, minskning av CDK aktiviteter, cellcykelstopp vid G 0 /G 1 Check Point, och efterföljande apoptos [22]. I den aktuella studien fann vi att apoptotiska celler var underrepresenterade i HIF-1α-positiva /p21-negativa tumörer. Under hypoxiska förhållanden kan HIF-1α hämma tumör proliferation genom p21-medierad cellcykelkontroll, vilket resulterar i selektion av celler som är resistenta mot apoptos och anti-cancerbehandlingar. De flesta tumörceller bibehåller förmågan att undergå apoptos som svar på hypoxiska påfrestning [23]. När den apoptotiska svaret på hypoxi är förlorad, kan tillväxttumörceller vara mer resistenta mot behandling och kan därför bidra till efterföljande tumörrecidiv [24]. De mekanismer genom vilka hypoxi selekterar för celler som är resistenta mot apoptos är oklart, men inblandning av p53-mutation har undersökts [25]. Rapporter har visat att hypoxi hämmar celltillväxt, och kan orsaka apoptos genom en p53-beroende väg [26]. HIF-1α har också visat att främja p53-beroende apoptos [27], men andra studier har visat att tillväxtstopp som svar på hypoxi är p53-oberoende [26]. I den aktuella studien fann vi inga bevis för ett samband mellan p53 och p21 uttryck. Vi utvärderade också förhållandet mellan HIF-1α och p53 uttryck för cell apoptos, men fann ingen statistisk signifikans mellan HIF-1α och p53-expression (data visas ej). Vår tidigare studie visade att kombinationen av HIF-1α uttryck med icke-funktionell p53 tenderade att indikera en dyster prognos [28].
Hos patienter med HIF-1a-positiva tumörer, sambandet mellan förlust av p21 uttryck och dåligt kliniskt utfall kan återspegla en fysiologisk skillnad i förmågan hos p21-positiva kontra p21-negativa tumörer att överleva under hypoxiska betingelser. Även om HIF-1α-beroende transkriptionell aktivering har associerats med tumörtillväxt, våra resultat tyder på att samtidig expression av p21 och HIF-1α kan fördröja tumörtillväxt i någon mån.
Molekylära mekanism som ligger bakom HIF-1α expression i canceroptioner särskilda uppmärksamhet [29]. Den utbredda förekomsten av uppregleras HIF-1α i vanliga cancerformer och medverkan av hypoxi vägar i tumörangiogenes argumentera säkert för dess betydelse och bred tillämplighet. Cellgifter och strålning som riktar HIF-1α kan vara effektiv och realistisk, och i själva verket har denna strategi har rapporterats [30]. Emellertid är de kvalitativa och kvantitativa skillnader i den hypoxiska svaret hos olika celltyper som inte välkänd [31]. Ytterligare forskning krävs därför för att utvärdera effekterna av HIF-1-medierade vägar på celltillväxt och apoptos i humana cancrar under hypoxiska mikromiljöer.
I den aktuella studien, vi visade att HIF-1α uttryck och förlust av p21expression i gastric cancer korrelerade med dålig patientens prognos jämfört med tumörer som behålls p21 uttryck, eller hade förlorat HIF-1α uttryck. En möjlig mekanism för detta föreslogs av upptäckten att apoptotiska celler underrepresenterade i HIF-1α-positiva /p21-negativa tumörer. Aggressiva tumörer som inte inducera p21 i en HIF-1α - beroende sätt kan ha ökat cellöverlevnad utan apoptos, och bidra till en dålig prognos för patienter
finansiering stöd
Institutionen för kirurgi och vetenskap, Graduate School of Medical. vetenskap, Kyushu University, Fukuoka, Japan.
förklaringar
tack
författarna tackar K. Miyamoto för tekniskt stöd.
författar~~POS=TRUNC original lämnat filer för Images of Nedan finns länkar till författarna "original lämnat filer för bilder. 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 4 Intressekonflikt
Författaren (s ) förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
| 
Immunceller reparerar skadad tarm hos barn med IBD
Forskare utvecklar 3D -tryckt piller som provar bakterier som finns i tarmen
Kost och näring påverkar mikrobiom i tarmslemhinnan
Studien belyser orsakerna till försvagande tarmvärk
Xylitol- och grapefruktfröextrakt visar löften om att förhindra SARS-CoV-2-infektion,
Antibiotikum X-206 effektivt mot SARS-CoV-2 in vitro
Tarmimmunceller kan vara ansvariga för metabolismförändringar finner studie
En ny studie har visat att immuncellerna i tarmen kan relateras till ämnesomsättningen. Resultaten av den nya studien med titeln, ”Tarm intraepiteliala T -celler kalibrerar metabolism och påskyndar hj
Växtbaserade dieter förbättrar hjärthälsan via tarmmikrobiomet
En ny studie publicerad i februari 2020 i Journal of the American College of Cardiology rapporterar att ett minskat intag av djurbaserade livsmedel och en kost baserad på växter kan resultera i en l
Nya värd-virala-mikrobiom-interaktioner under COVID-19 kan avgöra resultatet
Den nuvarande pandemin av coronavirus-sjukdomen 2019 (COVID-19), orsakad av det allvarliga akuta andningssyndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2), har spridit sig snabbt i över ett år. Även om det främst