| Stomach Health > elodec Zdravje >  > Stomach Knowledges > raziskave

Razmerje hipoksija-inducibilnih faktor 1 a in p21WAF1 /CIP1 izražanja celične apoptoze in klinični izid pri bolnikih z rakom želodca

Razmerje hipoksija-inducibilnih faktor 1 a in p21 WAF1 /CIP1 izraz za mobilne apoptoze in klinični izid pri bolnikih z rakom želodca
Abstract
Ozadje
hipoksija-inducibilnih faktor-1 a (HIF-1 a) ima bistveno vlogo pri kisika homeostaze. Ekspresijo HIF-1α-inducibilnih genov je povezano z napredovanje tumorja. p21 posreduje aretacijo celičnega ciklusa in je eden od genov nadaljnjih usmerjenih, ki jih HIF-1.
Bolniki in metode
smo preučili odnos med HIF-1 a in p21 izražanja, apoptoza in napredovanja tumorja uporabo tkivne vzorce, pridobljene kirurško od 126 bolnikih z rakom želodca.
Rezultati
analizo imunohistokemičnim je pokazala, da izguba p21 izražanja povezana pozitivno s starostjo bolnikov in velikost tumorja. Bezgavka metastaze je bistveno bolj pogosta pri tumorjih z izgubo p21 izražanja (P = 0,022). HIF-1α pozitivnih /p21-negativne tumorji so imeli manjšo apoptotske indeks od drugih vzorcev tumorjev, in so imeli tudi bolniki s HIF-1α-pozitivni /P21-negativna tumorjev bistveno slabšo prognozo kot druge populacije bolnikov.
Zaključek
Ti rezultati kažejo, da izguba HIF-1α odvisnih rezultatov p21 izražanja v zmanjšala apoptozo, povečanje preživetja celic in bolj agresivnih tumorjev.
Ozadje
neurejenega rast rakavih celic pogosto povzroči hipoksičnih pogojih v tumorske celice mase. Rezultati tumor hipoksija iz neravnovesje med povišano porabo kisika v hitro menjavo tumorskih celicah in nezadostne preskrbe s kisikom zaradi pomanjkanja fiziološke vaskularnega omrežja. Mnogoceličar so se razvile celične mehanizme, ki posredujejo kaskado nastavljivih molekularnih odzivov na hipoksijo. HIF-1α je transkripcijski faktor, ki aktivira izražanje genov z vezavo na hipoksijo odziven element (HRE), ki je cis deluje sekvence DNA predloženega gorvodno več genov bistvena za celični odziv na hipoksijo [1]. HIF-1 a, ki se odzivajo geni delujejo tudi v glikolize poti in hematopoeze in angiogenezo, po vseh, ki celice pridobijo-hipoksije prilagoditi presnovo in večjo oskrbo s kisikom [2]. Pred kratkim je HIF-1α izkazalo kot ključni regulator v rasti raka želodca [3].
Apoptoza je evolucijsko ohranjeni mehanizem celične smrti, ki se pojavlja tudi v prilagodljivem celični odziv na hipoksično stres. Apoptoza Tudi to je pomembno varovalo pred razvojem tumorja. Tumorji, ki kažejo izgubo v p53 tumor-supresorski gen kažejo zmanjšano, hipoksija povzroča celične smrti in povezano povečanje napredovanja tumorja [4]. P21 gena (WAF1) smo klonirali v genetskem zaslon za nadaljnje efektor z p53 in posebej na zaslonu nabavnih regulatorji ciklin-odvisne kinaze (CDK), kot CDK-stiku beljakovin (CIP1) [5]. Promotor p21 lahko transactivated z HIF-1 v humani celični liniji raka prostate, kar kaže, da je p21 HIF-1 ciljni gen, [6]. Poleg tega je bila, hipoksija povzročena p21 izraz odpravljeno v celicah, ki nimajo HIF-1 a, vendar ne v starševskih celic [7].
HIF-1 a lahko zato spodbuja tako celično preživetje in rast aretacijo z indukcijo hipoksijo odziven genov. V tej študiji smo preučili vlogo HIF-1 a v hipoksično nadzor napredovanja tumorja, ki jih preučuje odnos med HIF-1α izražanja, p21 izražanja in apoptozo v vzorcih tkiv pri pacientih z rakom želodca.
Materiali in metode
Klinični materiali
bili predmeti 126 bolnikov z rakom želodca (85 moških, 41 žensk, starostni razpon, od 27 do 88 let, povprečna starost 65,2 let), ki so šli skozi želodca v naši ustanovi leta 1994. zdravilni resekcijo je bila izvedena v 77 pacienti in ne kurativno resekcijo v 49. odstranjenimi vzorcev tkiva so bile določene v 10% raztopine formaldehida in vdelali v parafin. Odseki (4 um debelina) so bili nameščeni na steklenih ploščicah. Vsi vzorci so bili pregledani z mikroskopom in histološko, na podlagi meril, ki jih splošna pravila predlagane za študijo Rak želodca [8]. Histološka preiskava je bila izvedena na tkivnih pripravkih obarvanih s hematoksilinom in eozinom (H &E). V trenutni študiji so tumorji razdeljen na dva histoloških tipov: diferencirano tipa, ki obsega papilarni adenokarcinom in cevasto adenokarcinom, in nediferencirani tipa, ki obsega slabo različen adenokarcinom, karcinom Pečatnjak celic in mucinozni adenokarcinom. Dve parafinske bloke so bili pripravljeni za vse bolnike, "ena, ki vsebujejo tako tumorsko tkivo in sosednje normalno tkivo, in druge, ki vsebujejo tumorske tkiva vdrla na najvišjo raven želodčne stene.
Imunohistokemijsko
so bili vsi vzorci imunoreaktivnosti z monoklonskih protitelo proti p21 WAF1 /CIP1 (SX118, razredčen 1:50, Dako, Glostrup, Danska), p53 (ne-7, razredčen 1:50, DAKO, Glostrup, Danska), in HIF-1 a (NB 100- 105, razredčili 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, ZDA) [9] po deparaffinization in rehidraciji, diapozitive za p21 in p53 imunskim barvanjem smo sterilizirajo v citratnem pufru (0,01 M, pH 6,0) pri 120 ° C 10 minut,.. 0,001 M EDTA (pH 8,0), smo uporabili za HIF-1αimmunostaining olajšati reaktivnosti stalnega vgrajenega antigena tkiva s protitelesom endogeni peroksidaze smo blokirali z inkubacijo vzorcev iz metanola, ki vsebuje 0,3% vodikovega peroksida 10 minut Vzorci so bili nato splaknemo v-fosfatnim pufrom (PBS) in inkubiramo z normalnim kunčjega seruma, 30 minut. Odseki inkubiramo z omenjenimi primarnimi protitelesi za 2 uri pri sobni temperaturi, nato speremo trikrat v PBS. Za detekcijo smo uporabili Histofine SAB-PO (M) komplet (Nichirei Corp., Tokio, Japonska). Odseki smo nato inkubirali z biotiniranimi kunčjega anti-miš immunogloblin (Ig; IgG, IgA in IgM; Nicchirei Corp) za 10 minut, izperemo trikrat v PBS in obdelamo s peroksidazo konjugirano streptavidin 10 minut. Po zadnjem spiranju v PBS, je etiketa peroksidaza zazna z inkubacijo odseke diamino-benzidin tetrahidro-klorida (DAB) 3 minute. Jedrska nasprotni obarvanje je bila opravljena s pomočjo Mayer je rešitev Hematoxylin. Za negativne kontrole so bile primarne protitelesa zamenjali z ne-imunega, normalno seruma. Avtomatizirano imunohistokemija je bila izvedena tudi za podporo imunskim barvanjem opisan zgoraj, z uporabo Ventana Discovery ™ sistem (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, ZDA).
Ocena imunskim barvanjem
p21 proteina je bila prisotna v jedra tumorskih celic (slika 1A). V nekaterih primerih normalna sluznica želodca izražena p21 proteina, in jedrska obarvanje se lahko odkrijejo v površinskih toku tumorja, ne pa tudi v globljih regijah. Smo prešteli P21-pozitivnih celic v sklopu celotnega tumorja in ocenjevali število P21-postive celic glede na globino plasti. Vzorec HIF-1 a imunskim barvanjem v tumorju je jedrska in /ali citoplazemskega (slika 1B). Jedrska barvanje HIF-1 a je bil odsoten v normalnem tkivu brez citoplazemske barvanjem. V vseh vzorcih je protein p53 nezaznavno v normalnem tkivu, ki so prisotni v jedrih tumorskih celic (slika 1C). Celica z jedrsko imunskim barvanjem za p21, p53 ali HIF-1 a (šibka ali močna) je dosegel kot pozitivno. Na podlagi teh kriterijev, so bile ocenjene območja osrednje onesnaženjem z najvišjim odstotkom p53- in p21-pozitiven jedrske barvanjem v globokem tumorsko tkivo. Tumor je dosegel kot p21- ali p53-pozitiven, če je več kot 10% tumorskih celicah jedrsko obarvanje, v skladu s prejšnjimi poročili [10]. HIF-1α izraz je pogosto kaže v regijah okoli napadom robovih tumorja in nekrotskih področjih, kot so tiste blizu globoke razjede. dosegel smo tumorje kot pozitivne za HIF-1 a prekomerno, če je bila jedrska obarvanje odkrita v več kot 10% tumorskih celic, ne glede na to citoplazemske reaktivnosti na katerikoli ravni [9, 11]. Slika 1 A) p21 izražanje v sosednjem tumorsko tkivo. Jedrska imunskim barvanjem je razvidno (original povečava 100 x). B) HIF-1α izraz v preplavljajo regije tumorja. Variabilnost v intenzivnosti jedrske imunskim barvanjem je razvidno, skupaj z citoplazemske barvanjem (originalni povečavi, 100 ×). C) Jedrska imunskim barvanjem p53 v tumorsko tkivo (originalni povečavi 100 x). D) tumorsko tkivo obarvali s H &E (prvotna povečava 200 x). Tumorsko tkivo vsebuje celice (puščica) z značilnimi lastnostmi apoptoze
Vrednotenje za apoptozo
Zadel smo apoptotične celice tiste, ki prikazuje tipične značilnosti apoptoze, ko so bili vzorci tkiva, obarvanih s H &. E (Slika 1D). Apoptotske celice so bile določene na podlagi značilnih značilnosti apoptoze: stiskanje in migracije jedrskih in celic obrisov, jedrske razdrobljenosti in izrastki, in prisotnost apoptotska organov [12]. Apoptotske celice so bili prešteti v tkivnih vzorcih iz vseh bolnikih. Pet visoki električni polja (x 400) z najbolj obilne distribucijo tumorskih celic smo izbrali za štetje in preštejemo med 1000 in 1500 tumorske celice. Apoptoze indeks je bil nato izračunan kot odstotek apoptotskih celic. so se izognili območja z obsežno nekrozo. En patolog v vsaki instituciji pregledali diapozitive in prešteti apoptotične celice v skladu z merili, opisanih zgoraj.
Statistična analiza
Program BMDP Statistični paketa (BMDP, Los Angeles, CA) za IBM (Armonka, NY) 3090 mainframe računalniki so bili uporabljeni za vse statistične analize [13]. Podatkovni nizi so bili v primerjavi s chi-square and Student t-testov, ki uporabljajo 4F in 3S programov BMDP. Program BMDP 1L je bila uporabljena za analizo čas preživetja po metodi Kaplan-Meier. Statistična značilnost je bila določena na P < 0.05 ravni.
Rezultati
p21 izražanja in klinično-patološki dejavniki
Tabela 1 prikazuje korelacijo izraza ali izgubo izražanja p21 z več klinično-patološki dejavniki. Na splošno je bilo 71 (56,3%) od tumorskih vzorcev 126 negativen p21 izražanja. Pri tumorjih od bolnikov pod 65 let, je bila izguba p21 izražanja bistveno pogostejše kot pri tumorjih od bolnikov, starejših od 65 (P = 0,026). Izguba p21 izražanja je bila bistveno bolj pogosta pri tumorjih z velikosti (P ​​= 0,03), v primerjavi z manjšimi tumorjev. V zvezi z metastazami, tumorji z izgubo p21 izražanja večinoma kažejo pogostejše limfnega invazije (P = 0,089, tabela 1) in bistveno višjo frekvenco bezgavkah metastaze (P = 0,022, tabela 2) od-P21 izražanje tumorjev. Tabela 3 prikazuje razmerje med p21 izražanja in izražanje p53 in HIF-1 a. Čezmerno p53 so ugotovili pri 57 (45,2%) tumorjev in HIF-1α prekomerno so ugotovili pri 49 (38,9%) tumorjev. Imunohistokemijsko analiza ni razkrila povezavo med p21 izražanja in p53 izražanja, ali p21 in HIF-1α prekomerno (P = 0,444 in 0.609, v tem zaporedju) .table 1. Povezava med p21 izražanja in klinično-patološki dejavniki
dejavnikov,
p21 (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
P vrednost

Starost (leta)
< 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Spol
Moški
38
47
0,731
ženska
17
24
globina invazije
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
histologijo
diferencirana
35
39
0,325
Raznovrstna
20
32
velikost tumorja
< 3 cm
23
22
0,03
3 cm ≦
22
49
Limfna invazija
Negative
26.
23
0,089
Pozitivni
29
48
Venska invazija
Negative
42
57
0.595
pozitivno
13
14
Tabela 2 povezanosti p21 izražanja in metastaze

p21-negativna tumorja (%)
P vrednost
limfnega vozla metastaze
Negative
36/75 (48,0)
0,022
Positive
35/51 (68,6)
jetra metastaz
Negativne
68/122 (55,7)
0,447
Pozitivni
3/4 (75,0)
peritonealni razširjanje
Negative
62/112 (55,4)
0,525
pozitivno
9/14 (64,3)
tabeli 3. Razmerje med p21 in p53 in HIF-1 a izražanja


p21



pozitivna (n = 55)
negativna (n = 71)
P vrednost
p53
pozitivna (n = 57)
27
30
0,444
negativna (n = 69)
28
41
HIF-1 a
Positive (n = 49)
20
29
0,608
negativna (n = 77)
35
42
apoptoza povezana z HIF-1 a in p21 izražanja
pomeni apoptotske indeks vseh 126 tumorjev je 8,95 ± 6,24 (območje 0-37). Tumorji so bili razdeljeni v štiri različne populacije, ki temeljijo na HIF-1 a in p21 izražanja in srednjo apoptoze indeksa za vsako skupino je bila izračunana (tabela 4). Tumorji, ki so bili HIF-1α-pozitivni /p21-negativne imela najnižjo indeks apoptotske. Tam je bila velika razlika med tumorji, ki so HIF-1α-pozitivni /p21-negativno, in tistimi, ki so bili HIF-1α negativne /p21-negativna (P = 0,037) .table 4 apoptoza povezana z HIF-1 a in p21 izražanja
Factor
Apoptotsko indeks
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9,6 ± 7,33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 ** ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 * ** ***
HIF-1 a (+), p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (povprečje ± SD)
Klinični izid povezana z HIF-1 a in p21 izražanja
bila spremljanje povprečni čas za bolnike, 55 ± 28 (± 1 SD) mesecev (razpon 1-82 mesecev). Stopnja preživetja 5-letno bolnikov s p21-negativnih tumorjev bila nižja od P21-pozitivnih tumorjev, vendar razlika ni bila statistično signifikantna (podatki niso prikazani). Med 126 bolniki so bili spet razdeljena v štiri populacije, ki temeljijo na HIF-1 a izražanja in p21 izražanja, in smo preverjali odnos med HIF-1α izražanja in prognozo pri P21-pozitiven ali -negativno tumorskih vzorcev. Tabela 5 prikazuje stopenj preživetja 1-, 3- in 5-letno za bolnike in korelacijo z HIF-1 a in p21 izražanja. Bolniki z HIF-1α-pozitivni /P21-negativna tumorjev imela bistveno slabšo prognozo kot druge študijskih populacijah. Zlasti pri bolnikih s HIF-1 a-pozitivnih tumorjev, ki so izgubili izražanje p21 imela bistveno slabšo prognozo kot tisti s p21 izražanja (P = 0,042) .table 5 letno preživetje, povezane z HIF-1 a in p21 izražanja
Factor
1-letno preživetje
3-letno preživetje
5-letno preživetje

HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92.7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70.0 *, **, * **
HIF-1 a (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45.9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0,003 *** P = 0,003 (%)
Razprava
Naše ugotovitve kažejo, da izguba p21 izražanja povezana pozitivno z mlajšo starosti bolnika in večji tumor. Poleg tega je imel veliko bolnikov s P21-negativna tumorjev bezgavko metastaze v primerjavi s tistimi, s P21-pozitivnih tumorjev na precej višjo frekvenco. Ti rezultati kažejo, da je izguba izražanja p21 vključene v procese rasti tumorja in metastaz, v soglasju s predhodno poroča [14, 15].
Je HIF-1α prekomerno povezana s slabim klinični izid pri nekaterih vrstah človeških rakih [16-18]. Vendar pa so nekatera poročila kažejo, da tumor izraz HIF-1 a ne daje za preživetje prednost [18, 19]. Čeprav se lahko večina HIF-1 ciljnih genov spodbuja rast tumorja skozi okrepljeno izražanja, HIF-1-aktivirajo geni, vključno p21, imajo tudi možnost, da zavira rast pod hipoksičnih pogojih [20, 21]. Zunajmaternična izraz HIF-1 a v endotelijskih celicah povzročila up-regulacije p21, zmanjšanje CDK dejavnosti, ustavitev celičnega cikla v G 0 /G kontrolne točke 1, in poznejše apoptozo [22]. V sedanji raziskavi smo ugotovili, da so apoptotske celice zastopane v HIF-1α-pozitivni /P21-negativna tumorjev. Pod hipoksične pogoje, lahko HIF-1α inhibira proliferacijo tumorskih z nadzorom-p21 posredovano celičnega cikla, zaradi česar izbiri celice, ki so odporne na apoptoze in anti-zdravljenje raka. Večina tumorske celice obdržijo sposobnost poteče apoptoza odziv na hipoksične stresa [23]. Ko je apoptotske odziv na hipoksijo izgubljeno, lahko nastajajoče tumorske celice so bolj odporne na zdravljenje in lahko zato prispeva k kasnejšo tumorja ponovitve [24]. Mehanizmi, s katerimi hipoksija izbere za celice, odpornih proti apoptoze ni jasno, vendar je udeležba p53 mutacije je pregledal [25]. Poročila so pokazali, da hipoksija zavira rast celic, in lahko povzroči apoptozo s p53-odvisni poti [26]. HIF-1α je bilo tudi dokazano, da spodbujajo p53 odvisna od apoptozo [27], vendar pa druge študije so pokazale, da aretacijo rasti kot odgovor na hipoksijo je p53-neodvisni [26]. V sedanji raziskavi smo ugotovili, da ni dokazov o razmerju med p53 in p21 izražanja. Prav tako smo ovrednotili razmerje med HIF-1 a in p53 izražanja celično apoptozo, vendar ni našla statistično značilna med HIF-1 a in p53 ekspresijo (podatki niso prikazani). Naša predhodna študija je pokazala, da je kombinacija HIF-1α prekomerno z nefunkcionalna p53 večinoma kažejo mračno napoved [28].
Pri bolnikih z HIF-1 a-pozitivnih tumorjev, korelacija med izgubo p21 izražanja in lahko slabo kliničnim izidom odražajo fiziološke razlike v sposobnosti p21-pozitivne primerjavi P21 negativnih tumorjev za preživetje v razmerah hipoksičnih. Čeprav je bil HIF-1α odvisni transkripcijska aktivacijska povezano z rastjo tumorja, naši rezultati kažejo, da lahko sočasno izražanje p21 in HIF-1 a retard rast tumorja do neke mere.
Molekulsko mehanizem, ki je podlaga HIF-1α ekspresijo v rakavih nalogov zlasti pozornost [29]. Razširjeno pojav molekul HIF-1 a v skupnih raka in vključevanje hipoksijo poti v tumorsko angiogenezo zagotovo trditi za njegovega pomena in široke uporabnosti. Obsevanje in kemoterapijo, ki ciljajo HIF-1 a lahko učinkovito in realno, in v resnici, so poročali ta pristop [30]. Vendar, kvalitativne in kvantitativne razlike v hipoksično odziva različnih vrst celic niso znana [31]. Nadaljnje raziskave je torej potrebno, da bi ocenili učinke HIF-1 posredovanih poti na celično proliferacijo in apoptozo v človeških rakov pod hipoksično mikrookolje.
V tej študiji smo pokazali, da HIF-1α prekomerno in izguba p21expression v želodčni rak v korelaciji s slabo prognozo bolnikov, v primerjavi s tumorji, ki zadržani p21 izraz, ali so izgubili HIF-1α izraz. Potencialno mehanizem za to je predlagala ugotovitev, da so bile apoptotske celice premalo zastopane v HIF-1α-pozitivni /P21-negativna tumorjev. Agresivne tumorjev, ki ne povzročijo p21 v HIF-1 a - odvisen način se lahko poveča celično preživetje brez apoptoze, ter prispevati k slabo prognozo bolnikov
finančna podpora
oddelka za kirurgijo in znanost, Visoki šoli za zdravstvo. Znanost, Kyushu University, Fukuoka, Japonska.
deklaracij
Zahvala
Avtorji hvala K. Miyamoto za tehnično pomoč.
avtorjev prvotni prenosov datotek za slike
Spodaj so povezave do avtorjev "prvotna prenosov datotek za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff avtorjev 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg avtorjev prvotne datoteke za prvotno datoteke za sliko 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff avtorjev Slika 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff avtorjev prvotne datoteke za sliko 4 navzkrižje interesov
avtorja (ev ) ugotovi, da nimajo konkurenčnih interesov.
  • želodec člen
    •   
  • želodca struktura
    •   
  • Skrb za želodec
    •   
  • raziskave

    • raziskave

    raziskave

    Other Languages

    elodec Zdravje © https://www.stomachillness.com/sl