Связь индуцированного гипоксией фактора 1 α и р21
WAF1 /cip1 выражение апоптозом клеток и клинические исходы у больных с раком желудка
Аннотация
Справочная информация
Гипоксия-индуцируемый фактор-1alpha (HIF-1) играет существенную роль в гомеостазе кислорода. Экспрессия HIF-1α-индуцируемых генов связано с опухолевой прогрессии. р21 опосредует остановку клеточного цикла и является одним из нижестоящих генов мишенью HIF-1.
Пациенты и методы
Мы исследовали связь между HIF-1 и экспрессии p21, апоптоз и прогрессирования опухоли с использованием образцов тканей, полученных хирургическим путем из 126 больных раком желудка.
Результаты анализа показали, что иммуногистохимического потеря экспрессии p21 положительно коррелирует с возрастом пациента и размер опухоли. узел метастазы лимфа достоверно чаще при опухолях с потерей экспрессии p21 (P = 0,022). HIF-1α-позитивных /p21-негативные опухоли имели более низкий индекс апоптический, чем любые другие образцы опухолей, а также у пациентов с HIF-1α-позитивных /p21-негативных опухолей также имели значительно худший прогноз, чем у других групп пациентов.
Заключение
Эти результаты свидетельствуют о том, что потеря HIF-1α-зависимых результатов экспрессии р21 к уменьшенному апоптозу, повышение выживаемости клеток и более агрессивных опухолей.
Предпосылки
нерегулируемом рост раковых клеток часто приводит к гипоксии в опухолевой клетке массы. Результаты Опухоль гипоксия из-за дисбаланса между повышенным потреблением кислорода в быстро велосипедных опухолевых клеток и недостаточной подачи кислорода из-за отсутствия физиологической сосудистой сети. Многоклеточные организмы эволюционировали клеточные механизмы, которые обеспечивают каскад адаптивных молекулярных реакций к гипоксии. HIF-1α является фактором транскрипции, который активирует экспрессию генов путем связывания с гипоксией отзывчивым элемента (HRE), цис-действующие последовательности ДНК настоящего верхнего течения нескольких генов, необходимого для клеточного ответа на гипоксию [1]. HIF-1-отзывчивым гены функционируют также в гликолизного пути и в кроветворении и ангиогенеза, через которые все клетки приобретают гипоксией адаптированный обмен веществ и повышенное снабжение кислородом [2]. В последнее время HIF-1α возник в качестве ключевого регулятора в росте рака желудка [3].
Апоптоз является эволюционно консервативными механизм гибели клеток, что также происходит в адаптивном клеточного ответа на гипоксического стресса. Апоптоз, тоже является важной гарантией против развития опухоли. Опухоли, которые демонстрируют потерю р53 опухоли супрессор гена демонстрируют снижение уровня гипоксии-индуцированной гибели клеток и связанное с этим увеличение прогрессии опухоли [4]. Ген p21 (WAF1) был клонирован в генетическом скрининге для последующих эффекторов P53 и отдельно в экране вверх по течению регуляторов циклин-зависимых киназ (CDKS) в качестве CDK-взаимодействующий белок (cip1) [5]. Промотор р21 может быть трансактивируется путем HIF-1 в клеточной линии рака предстательной железы, что указывает, что р21 является целевой ген HIF-1 [6]. Кроме того, гипоксия-индуцированная экспрессия р21 была аннулирована в клетках, не имеющих HIF-1, но не в родительских клеток [7].
HIF-1, следовательно, могут способствовать как выживаемость клеток и остановку роста через индукцию гипоксией реагирующих генов. В настоящем исследовании мы рассмотрели роль HIF-1 в гипоксического контроля прогрессирования опухоли, путем изучения взаимосвязи между HIF-1α выражение, выражение p21 и апоптоз в образцах ткани от больных раком желудка.
Материалы и методы <бр> Клинические материалы
Испытуемым 126 пациентов с раком желудка (85 мужчин, 41 женщин; возрастной диапазон, от 27 до 88 лет, средний возраст 65,2 лет), которые подверглись гастрэктомия в нашем институте в 1994 году Вулканизующее резекция была выполнена в 77 пациентов и без целебный резекцию 49. образцов удаленной ткани фиксировали в 10% растворе формальдегида и заливали в парафин. Секции (толщиной 4 мкм) были установлены на стеклах. Все образцы были исследованы макроскопически и гистологически, на основе критериев, предложенных Общих правил для изучения желудочной [8] рака. Гистологическое исследование проводили на препаратах тканей, окрашенных гематоксилином и эозином (H &Amp; E). В текущем исследовании, опухоли были разделены на два гистологических типа: дифференцированной типа, включающий папиллярные аденокарциномы и трубчатую аденокарцинома и недифференцированный тип, включающий слабо дифференцированной аденокарциномы, карциномы перстневидно клеток и коллоидный аденокарциномы. Два готовили парафиновые блоки для всех пациентов ", одна из которых как опухолевой ткани и прилегающей нормальной ткани, а другой, содержащий опухолевую ткань вторгшуюся на самом глубоком уровне стенки желудка.
Иммуногистохимического окрашивания
Все образцы были иммуноокрашиванию с моноклональными антитело против р21 WAF1 /CIP1 (SX118, разводили 1:50, DAKO, Glostrup, Дания), p53 (Do-7, разводили 1:50, DAKO, Glostrup, Дания), и HIF-1 (NB 100- 105, разбавленный 1:. 100, Novus биологические препараты, Littleton, CO, США) [9] После депарафинизации и повторной гидратации, слайды для p21 и p53 иммунным окрашиванием автоклавируют в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0) при 120 ° с в течение 10 минут;.. 0,001 М ЭДТА (рН 8,0) использовали для HIF-1αimmunostaining для облегчения реакционной способности фиксированной внедренного антигена ткани с антителом Эндогенный пероксидазы блокировали путем инкубации образцов в метаноле, содержащем 0,3% перекиси водорода в течение 10 мин образцы были затем промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и инкубировали с нормальной кроличьей сывороткой в течение 30 минут. Срезы инкубировали с указанными первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре, затем промывали три раза в PBS. Для обнаружения, мы использовали Histofine SAB-PO (M) комплект (Nichirei Corp., Tokyo, Japan). Затем срезы инкубировали с биотинилированным кроличьим антителом против мышиного immunogloblin (Ig; IgG, IgA и IgM-антителом, Nicchirei Corp) в течение 10 мин, промывали три раза в PBS и обрабатывали конъюгированным с пероксидазой стрептавидина в течение 10 минут. После окончательной промывки в PBS, метка пероксидаза была обнаружена инкубацией секций в диамино-бензидина тетрагидро-хлоридом (DAB) в течение 3 минут. Ядерный контр-окрашивание было сделано с использованием раствора гематоксилином Майера. Для отрицательных контролей, первичные антитела были заменены неиммунного, нормальной сыворотке. Автоматизированная иммуногистохимии была также проведена для поддержки иммунным, описанной выше, с использованием системы Ventana Discovery ™ (Ventana Medical Systems, Inc., Тусон, Аризона, США).
Оценка иммунным окрашиванием белка p21
присутствовал в ядрах опухолевых клеток (Фигура 1А). В некоторых случаях, нормальная слизистая оболочка желудка выраженный p21 белка, и ядерное окрашивание можно было обнаружить в поверхностных течении опухоли, но не в более глубоких областей. Мы подсчитали число р21-позитивных клеток в разрезе всей опухоли, и оценивали количество p21-Postive клеток в зависимости от глубины слоев. Картина HIF-1 в иммунным окрашиванием опухоль ядерной и /или цитоплазматического (Фигура 1В). Ядерное окрашивание HIF-1 отсутствовал в нормальной ткани, за исключением цитоплазматического окрашивания. Во всех образцах, белок р53 не был обнаружен в нормальной ткани, а также присутствует в ядрах опухолевых клеток (рис 1C). Клетка с ядерным иммунным окрашиванием для p21, p53 или HIF-1 (слабой или сильной) расценивалось как позитивное. Исходя из этих критериев, были оценены участки фокальной окрашивания с самым высоким процентом p53- и р21-позитивных ядерного окрашивания в глубокой опухолевой ткани. Опухоль оценивали как p21- или р53-положительным, когда более чем 10% опухолевых клеток было ядерное окрашивание, в соответствии с предыдущими сообщениями [10]. выражение HIF-1α было часто проявляется в областях вокруг вторгающихся краев опухоли и некротических областях, таких, как близко к глубокому язву. Мы забили опухоли, как положительные для HIF-1 сверхэкспрессии, если ядерное окрашивание было обнаружено в более чем 10% опухолевых клеток, независимо от цитоплазмы реактивности на любом уровне [9, 11]. Рисунок 1) выражение р21 в смежной ткани опухоли. Ядерный иммунное очевидна (исходное увеличение, 100 ×). Б) выражение HIF-1α при вторжении области опухоли. Изменчивость в интенсивности ядерной иммуноокрашиванием очевидно, сопровождается цитоплазматического окрашивания (исходное увеличение, 100 ×). C) Ядерный иммунное p53 в опухолевой ткани (исходное увеличение, 100 ×). D) Опухолевая ткань окрашивали H &Amp; E (исходное увеличение, 200 ×). Опухолевая ткань содержит клетки (стрелка) с характерными особенностями апоптоза
Оценка апоптоза
Забили апоптотических клеток, как те, которые показывают типичные характеристики апоптоза, когда образцы ткани окрашивали H &Amp;. Е (рис 1D). Апоптотических клеток были определены на основании характерных признаков апоптоза: уплотнению и миграции ядерных и клеточных очертаний, ядерной фрагментации и бугорками, а также наличие апоптотических тел [12]. Апоптотических клеток подсчитывали в образцах ткани от всех пациентов. Пять высокой мощности поля (× 400) с наиболее обильной распределения опухолевых клеток были выбраны для подсчета и между 1000 и 1500 опухолевые клетки подсчитывали. Апоптическая индекс Затем вычисляли как процент апоптотических клеток. избегали районы с обширным некрозом. Один патологоанатом в каждом учреждении были рассмотрены слайды и подсчитывали апоптотических клеток в соответствии с критериями, описанными выше.
Статистический анализ
Программа BMDP статистический пакет (BMDP, Лос-Анджелес, Калифорния) для IBM (Армонк, Нью-Йорк) 3090 мэйнфреймов компьютеры использовались для всех статистических анализов [13]. Наборы данных были сопоставлены с помощью хи-квадрат и Стьюдента-тестов с использованием программы BMDP 4F и 3S. Программа BMDP 1L была использована для анализа времени выживания с использованием метода Каплана-Мейера. Статистическая значимость была установлена на P <
0,05.
Результаты экспрессии p21 и клинико-патологическая факторы
Таблица 1 показывает соотношение выражения или потери экспрессии p21 с несколькими клинико-патологическая факторов. В целом, 71 (56,3%) из 126 образцов опухоли были отрицательными для экспрессии p21. В опухолях у пациентов моложе 65 лет, потеря экспрессии p21 была значительно чаще, чем у опухолей у пациентов в возрасте старше 65 (Р = 0,026). Потеря экспрессии p21 была достоверно чаще в опухолях с большим размером (P = 0,03), по сравнению с более мелких опухолей. Что касается метастазов опухоли с потерей экспрессии p21, как правило, показывают повышенную частоту лимфатической инвазии (р = 0,089, таблица 1), а также значительно более высокой частотой метастазов в лимфатических узлах (Р = 0,022, таблица 2), чем p21-экспрессирующих опухолей. В таблице 3 показана взаимосвязь между экспрессией р21 и экспрессию р53 и HIF-1. Избыточная экспрессия р53 был обнаружен у 57 (45,2%) опухолей, и HIF-1α избыточная экспрессия была обнаружена у 49 (38,9%) опухолей. Иммуногистохимическое анализ не выявил корреляцию между экспрессией p21 и p53 экспрессии, или р21 и HIF-1α избыточной экспрессии (P = 0,444 и 0,609, соответственно) .table 1 Взаимосвязь между выражением p21 и клинико-патологическая факторов
Факторы
р21 (+) (п = 55)
p21 (-) (п = 71)
P значение
<бр> Возраст (лет)
&л; 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Гендер
Мужской
38
47
0,731
Female
17
24
Глубина вторжения
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
гистологии
Дифференцированный
35
39
0,325
Недифференцированный
20
32
размер опухоли
&л; 3 см
23
22
0,03
3 см ≦
22
49
лимфатической инвазии
Отрицательная
26
23
0,089 <бр> позитиве
29
48
венозная инвазия
Отрицательная
42
57
0,595
позитиве
13
14
Таблица 2 Связь между выражение p21 и метастазирование
<й>
p21-отрицательной опухоли (%)
P значение
лимфоузлов метастаз
Негативный
36/75 (48,0)
0,022
Положительный
35/51 (68,6)
метастазов в печени
отрицательный
68/122 (55,7)
0,447 <бр> позитиве
3/4 (75,0)
перитонеальный распространение
Негативный
62/112 (55,4)
0,525
позитиве
9/14 (64,3)
Таблица 3 Связь между р21 и р53 и HIF-1 экспрессии
<й>
<й>
р21
<й>
<й>
<й>
положительная (п = 55)
Отрицательный (п = 71)
значение P
р53
Положительный (п = 57)
27
30
0,444
Отрицательный (п = 69)
28
41
HIF-1
Положительный (п = 49)
20
29
0,608
Отрицательный (п = 77)
35
42
Апоптоз связан с HIF-1 и экспрессии p21
Средняя апоптическая индекс всех 126 опухолей был 8,95 ± 6,24 (диапазон 0-37). Опухоли были разделены на четыре различных популяций на основе HIF-1 и экспрессии p21 и среднего апоптотических индекса для каждой группы вычисл ли (таблица 4). Опухоли, которые были HIF-1α-позитивных /p21-отрицательных был самый низкий индекс апоптический. Был значительная разница между опухолями, которые были HIF-1α-позитивных /p21-негативные, и те, которые были HIF-1α-негативный /p21-отрицательной (P = 0,037) .table 4 Апоптоз связан с HIF-1 и экспрессии p21
фактор
Апоптотическая индекс
HIF-1α (-), p21 (+) п = 35 ± 9,6
7,33 ***
HIF -1α (-), P21 (-) п = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), P21 (+), N = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1 (+), p21 (-) п = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (среднее ± стандартное отклонение)
Клинический результат связан с HIF-1 и экспрессии p21
среднее время наблюдения за пациентами составил 55 ± 28 (± 1 SD) месяцев (диапазон, 1-82 месяцы). 5-летней выживаемости пациентов с р21-негативных опухолей был ниже, чем у р21-позитивных опухолей, однако разница не была статистически значимой (данные не показаны). 126 пациентов были вновь разделены на четыре популяции, основанные на экспрессии HIF-1 и экспрессии p21, и мы исследовали взаимосвязь между HIF-1α экспрессии и прогноз в р21-позитивных или -отрицательное опухолевых образцов. В таблице 5 приведены цены на 1-, 3- и 5-летняя выживаемость для пациентов и корреляции с HIF-1 и экспрессии p21. У пациентов с HIF-1α-позитивных /p21-негативных опухолей имели значительно худший прогноз, чем у других исследованных группах населения. В частности, у больных с HIF-1-позитивных опухолей, те, кто потерял экспрессию р21 имели значительно худший прогноз, чем те, с выражением p21 (P = 0,042) .table выживаемости 5 года, связанные с HIF-1 и экспрессии p21
Фактор
1-летняя выживаемость
3-летней выживаемости
5-летней выживаемости
<бр> HIF-1αg (-), P21 (+), N = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), P21 (-) п = 42
92,7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), P21 (+), N = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1 (+), p21 (-) п = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0,003 *** P = 0,003 (%)
Обсуждение
Наши результаты показывают, что потеря экспрессии p21 положительно коррелирует с более молодым возрастом пациента, а также увеличения опухоли. Кроме того, многие пациенты с р21-негативных опухолей имели узловой метастаз лимфы по сравнению с теми, с р21-позитивных опухолей, при значительно более высокой частоте. Эти результаты свидетельствуют о том, что потеря экспрессии p21 участвует в процессах роста опухоли и метастаз, в согласии с ранее сообщает [14, 15].
HIF-1α избыточная экспрессия была связана с плохим клиническим исходом в некоторых типах человеческих раковых заболеваний [16-18]. Тем не менее, некоторые сообщения предполагают, что экспрессия опухоль HIF-1 не дает преимущество выживания [18, 19]. Хотя большая часть генов-мишеней HIF-1 может способствовать росту опухоли через усиленную экспрессию, HIF-1-активированных генов, включая р21, также имеют потенциал для ингибирования роста в условиях гипоксии [20, 21]. Эктопическая экспрессия HIF-1 в эндотелиальных клетках приводит к повышающей регуляции р21, снижение CDK деятельности, клеточного цикла в G <суб> 0 /G <суб> 1 контрольный пункт, и последующий апоптоз [22]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что апоптотических клеток были недостаточно представлены в HIF-1α-позитивных /p21-негативных опухолей. В условиях гипоксии, HIF-1α может ингибировать пролиферацию опухолевых через контроль клеточного цикла р21-опосредованное, что приводит к селекции клеток, которые резистентны к апоптозу и противораковых лечения. Большинство опухолевых клеток сохраняют способность к апоптозу в ответ на гипоксию [23]. Когда апоптическая ответ на гипоксию теряется, возникающие опухолевые клетки могут быть более устойчивыми к лечению и, следовательно, могут способствовать последующему рецидиву опухоли [24]. Механизмы, с помощью которых гипоксия отбирает для клеток, устойчивых к апоптозу, неясна, но вовлечение мутации p53 была исследована [25]. Отчеты показали, что гипоксия ингибирует рост клеток, и может вызвать апоптоз посредством р53-зависимого пути [26]. HIF-1α также было показано, чтобы способствовать p53-зависимому апоптозу [27], но другие исследования показали, что торможение роста в ответ на гипоксию является p53-независимого [26]. В настоящем исследовании мы не обнаружили никаких доказательств связи между p53 и p21 экспрессии. Мы также оценили взаимосвязь между HIF-1 и экспрессии р53 апоптоза клеток, но не обнаружили статистической значимости между HIF-1 и экспрессии р53 (данные не показаны). Наше предыдущее исследование показало, что сочетание HIF-1α оверэкспрессии с нефункциональной p53, как правило, указывают на мрачное прогноз [28].
У пациентов с HIF-1-позитивных опухолей, корреляция между потерей экспрессии p21 и плохим клиническим исходом может отражают физиологическое различие в способности р21-позитивных по сравнению с р21-негативных опухолей, чтобы выжить в условиях гипоксии. Несмотря на то, HIF-1α-зависимой активации транскрипции было связано с ростом опухоли, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что сопутствующая экспрессия р21 и HIF-1, могут замедлить рост опухоли до некоторой степени.
Молекулярный механизм, лежащий в основе HIF-1α экспрессию в раковых варрантов частности внимание [29]. Широкое появление активируемых HIF-1 в наиболее распространенных видов рака и вовлечение гипоксия путей в опухолевый ангиогенез, безусловно, выступают за его важности и широкой применимости. Химиотерапия и радиация, что цель HIF-1 может быть эффективным и реалистичным, а на самом деле, было сообщено этот подход [30]. Тем не менее, качественные и количественные различия в гипоксической реакции различных типов клеток не очень хорошо известны [31]. Дальнейшие исследования Таким образом, требуется для того, чтобы оценить эффекты HIF-1-опосредованных путей на пролиферацию клеток и апоптоз в злокачественных опухолях человека при гипоксических микросреды.
В настоящем исследовании мы показали, что HIF-1α избыточная экспрессия и потеря p21expression в рака желудка коррелирует с плохим прогнозом пациентов, по сравнению с опухолями, нераспределенной экспрессию р21 или утративших HIF-1α выражение. Потенциальный механизм для этого был предложен находкой, что апоптотических клеток были недостаточно представлены в HIF-1α-позитивных /p21-негативных опухолей. Агрессивные опухоли, которые не вызывают p21 в HIF-1 - зависимым способом могут увеличить выживаемость клеток без апоптоза, а также способствовать плохим прогнозом для пациентов
финансовой поддержки
кафедры хирургии и науки, Высшая школа врачей. Наука, университет Кюсю, Фукуока, Япония.
декларациях
Благодарности
Авторы благодарят К. Миямото за техническую помощь.
Авторы 'оригинальные файлы представлены для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов 'оригинальные файлы представлены для изображений. 'Исходный файл для Рисунок 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff Авторского 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg авторов исходного файла для "исходного файла для фигурного 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff Авторского Рисунок 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Авторского исходного файла для фигуры 4 конфликта интересов
автора (ов ) заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Пептид паучьего яда может помочь снять боль при синдроме раздраженного кишечника
Исследования связывают распространенность SARS-CoV-2,
Если вам больше 50,
Рыбная слизь может быть потенциальным источником антибиотиков, результаты исследования
Кормить домашних животных сырой пищей безопасно,
Будут ли диеты на основе ДНК и персонализированные лечебные продукты - будущее для похудения?
Ультрафиолетовый свет B полезен для кишечного микробиома
Небольшое исследование, опубликованное в журнале Границы иммунологии 24 октября, 2019, показывает, что воздействие ультрафиолетового света B (UVB), что обычно достигается за счет воздействия солнечн
Исследования показывают, что пробиотики помогают бороться с тревогой и депрессией.
Предыдущие исследования связали проблемы психического здоровья и нарушения развития со здоровьем кишечника. Теперь, группа британских ученых показала, что продукты, расширяющие профиль полезных бактер
Стратегия готовности педиатрической медицинской помощи ко второй волне пандемии COVID-19
Хотя пандемия COVID-19 до сих пор оказала относительно небольшое влияние на педиатрическое население, есть опасения, что вторая волна, который уже осуществляется во многих частях мира, может сказаться