| Stomach Health > gyomor egészség >  > Stomach Knowledges > kutatások

Összefüggés a hipoxia-indukálható faktor 1α és p21WAF1 /Cip1 kifejeződése a sejt apoptózis és a klinikai kimenetel gyomorrákos betegeknél

Összefüggés a hipoxia-indukálható faktor 1α és p21 WAF1 /Cip1 kifejeződése a sejt apoptózis és a klinikai kimenetel gyomorrákos betegeknél katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa hipoxia-indukálható faktor-1α (HIF-1α) játszik alapvető szerepet oxigén homeosztázis. A kifejezés a HIF-1α-indukálható gének társított tumor progresszióját. p21 közvetíti sejtciklus leállítását és az egyik downstream gének által megcélzott HIF-1.
Betegek és módszerek katalógusa Megvizsgáltuk a kapcsolatát HIF-1α és p21 expresszió, az apoptózis és a tumor progresszióját a szövetmintából nyert sebészetileg 126 gyomorrákos betegeknél. katalógusa Eredmények katalógusa immunhisztokémiai analízis azt mutatta, hogy a veszteség a p21 expresszió pozitív korrelációt a beteg életkora és a daganat méretét. Nyirokcsomómetastasis szignifikánsan gyakrabban tumorokban veszteség p21 expresszió (p = 0,022). HIF-1α-pozitív /p21-negatív tumorok alacsonyabb volt apoptotikus index, mint bármely más tumor mintákban, és betegek HIF-1α-pozitív /p21-negatív tumorok is szignifikánsan rosszabb prognózist, mint a többi beteg populációk. Katalógusa Következtetés
Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a veszteség a HIF-1α-függő P21 expressziója eredményezi csökkent apoptózis, fokozott a sejtek túlélését, és még agresszív tumorok.
alapon
szabályozatlan rákos sejtek növekedését gyakran eredményez hipoxiás körülmények között a tumorsejtek tömegek. Tumor hypoxia ered közötti egyensúlyhiány emelkedett oxigénfogyasztás a gyorsan kerékpározás tumorsejtek és elégtelen oxigénellátás hiánya miatt egy fiziológiai érhálózat. Többsejtű élőlények fejlődtek celluláris mechanizmusokat, amelyek közvetítik a lépcsőzetes adaptív molekuláris válaszok hypoxia. HIF-1α egy transzkripciós faktor, amely aktiválja a génexpressziót kötődve a hypoxia reszponzív elem (HRE), egy cisz-ható DNS-szekvencia jelen upstream több gén nélkülözhetetlen a celluláris válasz hipoxia [1]. HIF-1α-reszponzív gének is működnek a glikolízis útvonal és a vérképzés, és az angiogenezis, az összes, hogy mely sejt szerez egy hipoxia-adaptált metabolizmus és a megnövekedett oxigénellátás [2]. A közelmúltban, HIF-1α vált, mint kulcsfontosságú szabályozója a növekedés a gyomorrák [3].
Apoptózis egy evolúciósan konzervált sejthalál mechanizmus, amely szintén előfordul az adaptív celluláris választ a hypoxiás stressz. Az apoptózis is fontos biztosíték ellen tumor fejlődését. Daganatok hogy mutatnak elvesztése a p53 tumor-szuppresszor gén mutatnak csökkent szinten hipoxia által indukált sejthalál és egy társított növekedését a tumor progresszióját [4]. A p21 gén (WAF1) klónoztuk egy genetikai képernyőn downstream hatások, a p53 és külön-külön egy képernyő upstream szabályozó ciklin-függő kinázok (CDK-k), mint CDK-kölcsönható fehérje (Cip1) [5]. A p21 promoter lehet transactivated HIF-1 egy humán prosztatarák-sejtvonalat, jelezve, hogy a p21 egy HIF-1 célgén [6]. Továbbá, a hipoxia-indukált p21-expresszió megszüntették sejtekben hiányzik HIF-1α, de nem a szülői sejtekben [7].
HIF-1α ezért elősegíti mind a sejtek túlélését és növekedési gátlás indukálása útján, hipoxia-reszponzív gének. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy szerepe a HIF-1α hipoxiás kontroll tumor progresszió, megvizsgálva a kapcsolatát HIF-1α expresszió p21 expresszió és az apoptózis szövetmintából származó gyomorrákos betegeknél. Katalógusa Anyagok és módszerek
Klinikai anyagok katalógusa alanyok 126 gyomorrákos betegeknél (85 férfi, 41 nő, életkor tartomány 27-88 év, átlagéletkor 65,2 év), akiknél gastrectomián intézetünkben 1994 Gyógyító reszekció végeztük 77 a betegek és a nem kuratív reszekció 49. reszekált szövetmintákban fixáltuk 10% -os formaldehid oldatot, és paraffinba ágyaztuk. Szakaszok (4 um vastagságú) adunk üveg tárgylemezekre. Minden mintát vizsgáltunk makroszkóposan és szövettanilag szempontok alapján javasolt az általános szabályok A gyomorrák tanulmány [8]. Szövettani vizsgálat végeztük szövet készítmények megfestettük hematoxilin-eozin (H &E). A jelenlegi vizsgálatban a daganatok osztották két szövettani típusok: differenciált típus, amely a papilláris adenokarcinóma és tubuláris adenokarcinóma, és nem differenciált típus, amely rosszul differenciált adenocarcinoma, pecsétgyűrű sejtes karcinóma, és mucinosus adenocarcinoma. Két parafintömböket készítettünk minden beteg "egy egyaránt tartalmazó tumorszövetet és szomszédos normál szövetben, és a többi tartalmazó tumorszövetet betörő a legmélyebb szint a gyomorfal.
Immunhisztokémiai
Minden mintákat immunfestést monoklonális elleni antitest P21 WAF1 /Cip1 (SX118, 1:50 arányban hígítva, DAKO, Glostrup, Dánia), a p53 (Do-7, 1:50 arányban hígítva, DAKO, Glostrup, Dánia), és a HIF-1α (NB 100- 105, 1: 100 hígításban, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) [9]. Miután deparaffinization és rehidratálás, a lemezeket a p21 és p53 immunfestés autoklávoztunk citrát-pufferrel (0,01 M, pH = 6,0) 120 ° C-on 10 perc; 0,001 M EDTA-t (pH = 8,0) használtunk a HIF-1αimmunostaining megkönnyítése reaktivitás a rögzített beágyazott szöveti antigén az antitesttel. az endogén peroxidáz blokkolta inkubáljuk a mintákat tartalmazó metanolban 0,3% hidrogén-peroxidot 10 perc alatt. a mintákat ezután öblítjük foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és inkubáltuk normál nyúlszérumot 30 percig. Metszeteket a fent említett primer antitestekkel 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd háromszor öblítjük PBS-ben. A kimutatáshoz, mi használt Histofine SAB-PO (M) kit (Nichirei Corp., Tokió, Japán). A metszeteket ezután inkubáljuk biotinilezett nyúl anti-egér immunogloblin (lg; IgG, IgA és IgM; Nicchirei Corp) 10 percen, háromszor mostuk PBS-ben, és az oldathoz peroxidázzal konjugált sztreptavidinnel 10 percig. Miután a végső mosás PBS-ben, a peroxidáz címke detektáltuk inkubálásával a szakaszok diamino-benzidin tetra-hidro-klorid (DAB) 3 percig. Nukleáris számláló-festés segítségével végeztem Mayer féle hematoxilinnel megoldás. A negatív kontrollok, primer antitesteket helyettesítjük a nem-immun, normál szérum. Automatizált immunhisztokémiai is elvégezték, hogy támogassa a immunfestést a fent leírt, egy Ventana Discovery ™ rendszer (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA).
Értékelése immunfestés katalógusa P21 fehérje jelen volt a magok a tumorsejtek (1a ábra). Egyes esetekben a normál gyomornyálkahártya expresszált p21 fehérje, valamint a nukleáris festődést lehetett kimutatni a felületes eléri a tumor, de nem a mélyebb régiókban. Mi megszámoltuk a p21-pozitív sejtek a teljes tumor rész, és értékelte a száma a p21-postakocsis szerinti sejtek a mélység a rétegeket. A minta a HIF-1α immunfestés a tumor volt nukleáris és /vagy citoplazmatikus (1B ábra). Nukleáris festés HIF-1α volt jelen a normál szövethez kivéve citoplazmatikus festődés. Az összes mintát, a p53-protein nem volt kimutatható a normál szövetek, és jelen van a magok a tumorsejtek (1C). A sejt nukleáris immunfestés p21, p53 vagy HIF-1α (gyenge vagy erős) volt pozitívnak. E kritériumok alapján, területek fokális festést a legnagyobb arányban a p53 és p21-pozitív magfestődés belül mély daganatos szövet becsülték. A tumor pontoztuk mint p21- vagy p53-pozitív, ha több mint 10% -a a tumorsejtek volt sejtmagi festődés, összhangban korábbi jelentések [10]. HIF-1α expresszió gyakran nyilvánvaló régióban szerte a betörő szélei a daganat, és a nekrotikus terület például közel egy mély fekély. Mi szerzett daganatok pozitív HIF-1α overexpresszió ha nukleáris festődést detektáltunk több mint 10% a tumorsejtek, függetlenül attól, citoplazma reaktivitás bármely szinten [9, 11]. 1. ábra A) p21-expresszió szomszédos tumorszövetben. Nukleáris immunfestés nyilvánvaló (eredeti nagyítás, 100 ×). B) HIF-1α expresszió betörő régióiban tumor. Variabilitás intenzitása nukleáris immunfestés nyilvánvaló kíséretében citoplazmatikus festés (eredeti nagyítás, 100 ×). C) a nukleáris immunfestésével p53 tumor szövetben (eredeti nagyítás, 100 ×). D) A tumor szövet megfestettük H &E (eredeti nagyítás, 200 ×). A daganatos szövetet tartalmaz sejtek (nyíl), jellegzetes tulajdonságait az apoptózist.
Szervíz apoptózis
szereztünk apoptotikus sejtek, mint amelyek mutató tipikus jellemzőit az apoptózis, amikor a szöveti mintákat megfestettük H &E (1D ábra). Az apoptotikus sejteket alapján azonosítottuk a jellemzője az apoptózis: a tömörítés és a migráció a nukleáris és a sejt vonalakban, a nukleáris fragmentáció és kiemelkedés, és a jelenléte apoptotikus testek [12]. Az apoptotikus sejteket megszámoltuk szövetmintából minden betegnél. Öt nagy teljesítményű mezők (× 400) a legnagyobb mennyiségben előforduló eloszlása ​​tumorsejteket kiválasztott számít, és 1000 és 1500 tumor sejteket megszámláltuk. Az apoptotikus index Ezután kiszámítottuk a százalékos apoptotikus sejteket. Területeken kiterjedt elhalása elkerültük. Egy patológus minden intézmény áttekintette a diák és számít apoptózis kritériumok szerint a fent leírt.
Statisztikai analízis katalógusa A BMDP Statisztikai Package programot (BMDP, Los Angeles, CA) IBM (Armonk, NY) 3090 mainframe számítógépeket használni minden statisztikai elemzések [13]. Adatsorokat hasonlítottuk össze chi-négyzet és Student-féle t-teszt segítségével BMDP 4F és 3S programokat. A BMDP 1L program elemzésére használt túlélési idő a Kaplan-Meier-módszerrel. Statisztikai szignifikancia a P < 0,05 szinten.
Eredménye
p21 expressziója és klinikai-patológiai tényezők
1. táblázat mutatja az összefüggést a kifejezés vagy expressziójának elvesztése a p21 számos klinikai-patológiai tényezők. Összességében, 71 (56,3%) mennyiségben a 126 tumor minta volt negatív p21 kifejezés. A tumorokban szenvedő betegek 65 év alatti életkor, elvesztése a p21 expresszió szignifikánsan gyakoribb, mint daganatos betegek több mint 65 éves kor (p = 0,026). Elvesztése P21 expressziója szignifikánsan gyakoribb tumorok nagy mérete (p = 0,03), összehasonlítva a kisebb tumorok. Ami a metasztázisok, daganatok elvesztése a p21 expressziós tendenciát mutatnak fokozott gyakorisága nyirok- invázió (P = 0,089, 1. táblázat), és egy lényegesen nagyobb gyakorisággal nyirokcsomó-metasztázis (P = 0,022, 2. táblázat), mint a p21-expresszáló daganatok. A 3. táblázat mutatja a kapcsolat a p21 kifejezés, és a kifejezés a p53 és a HIF-1α. P53 túlexpresszálását volt kimutatható 57 (45,2%) tumorok, és a HIF-1α túlexpressziót detektáltunk 49 (38,9%) daganatok. Az immunhisztokémiai analízis nem mutatott összefüggést a p21 expresszió és a p53 expresszió, illetve a p21 és a HIF-1α túltermelése (P = 0,444 és 0,609-kal) .table 1 közötti kapcsolat p21 expresszió és klinikai-patológiai tényezők katalógusa tényezők Matton p21 (+) (n = 55) Matton p21 (-) (n = 71) Matton P érték katalógusa
Életkor (év) hotelben < 65 katalógusa 20 katalógusa 40 katalógusa 0.026 katalógusa 65 ≦ katalógusa 35 katalógusa 31 katalógusa Gender katalógusa Férfi katalógusa 38
47 katalógusa 0.731 fiatal női katalógusa 17 katalógusa 24 katalógusa mélysége invázió katalógusa t1 katalógusa 33 katalógusa 35 katalógusa 0,231 katalógusa t2,3,4
22 katalógusa 36 katalógusa Szövet-
differenciált katalógusa 35 katalógusa 39 katalógusa 0.325 katalógusa differenciálatlan
20 katalógusa 32 katalógusa tumor méretét katalógusa < 3 cm katalógusa 23 katalógusa 22 katalógusa 0.03 katalógusa 3 cm ≦ katalógusa 22 katalógusa 49 katalógusa nyirokér invázió katalógusa Negatív katalógusa 26 katalógusa 23 katalógusa 0,089
Pozitív katalógusa 29 katalógusa 48 katalógusa vénás invázió katalógusa Negatív katalógusa 42 katalógusa 57 katalógusa 0.595 katalógusa Pozitív katalógusa 13 katalógusa 14 katalógusa 2. táblázat közötti kapcsolat p21 expresszió és metasztázis katalógusa katalógusa p21-negatív tumor (%) Matton P érték Matton nyirokcsomó áttétek katalógusa negatív
36/75 (48,0) hotelben 0.022 katalógusa Pozitív katalógusa 35/51 (68,6) hotelben májmetasztázisos katalógusa Negatív katalógusa 68/122 (55,7) hotelben 0,447
Pozitív katalógusa 04/03 (75,0) hotelben peritoneális terjesztése katalógusa Negatív katalógusa 62/112 (55,4) hotelben 0.525 katalógusa Pozitív katalógusa 9/14 (64,3) hotelben táblázat 3 közötti kapcsolat a p21 és p53, HIF-1α kifejezés katalógusa katalógusa katalógusa p21 Matton katalógusa katalógusa katalógusa pozitív (n = 55) Matton Negative (n = 71) Matton P érték Matton p53
pozitív (n = 57) hotelben 27 katalógusa 30 katalógusa 0,444 katalógusa Negative (n = 69) hotelben 28 katalógusa 41 katalógusa HIF-1α katalógusa pozitív (n = 49) hotelben 20 katalógusa 29 katalógusa 0.608 katalógusa Negative (n = 77) hotelben 35 katalógusa 42 katalógusa apoptózis kapcsolódó HIF-1α és p21 expresszió
jelent apoptotikus vezet a 126 tumor 8,95 ± 6,24 (tartomány 0-37). A tumorokat osztva négy különböző populációk alapuló HIF-1α és p21 expresszióját, és az átlagos apoptotikus index minden egyes csoportra kiszámítottuk (4. táblázat). Daganatok voltak HIF-1α-pozitív /p21-negatív volt a legalacsonyabb az apoptotikus index. Szignifikáns különbség tumorok voltak HIF-1α-pozitív /p21-negatív, és azokat is, amelyeket a HIF-1α-negatív /P21-negatív (P = 0,037), .table 4 Apoptózis társított HIF-1α és p21 expressziós
Factor Matton apoptotikus index Matton HIF-1α (-), p21 (+) n = 35 katalógusa 9,6 ± 7,33 *** katalógusa HIF -1α (-), P21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 ** ***
HIF-1α (+), a p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), a p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (átlag ± SD) hotelben Klinikai eredmény társult HIF-1α és p21 expresszió katalógusa Az átlagos követési idő a betegek 55 ± 28 (± 1 SD) hónap (1-82 hónap). Az 5 éves túlélési arány betegek p21-negatív tumorok alacsonyabb volt, mint a p21-pozitív daganatok, de a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (az adatokat nem mutatjuk be). A 126 beteget ismét négy populáció alapján HIF-1α expresszió és a p21 expresszió, és megvizsgáltuk a kapcsolatát HIF-1α expresszió és a prognózis p21-pozitív vagy -negatív tumor mintákban. Az 5. táblázat azt mutatja, az 1-, 3- és 5 éves túlélési arány a betegek számára, és a korreláció a HIF-1α és p21 expresszióját. Betegek HIF-1α-pozitív /p21-negatív tumorok szignifikánsan rosszabb prognózist, mint a többi vizsgálati csoportokban. Különösen betegeknél a HIF-1α-pozitív daganatok, azok, akik elvesztették expressziója a p21 volt szignifikánsan rosszabb a prognózisa, mint azok a p21 expressziós (P = 0,042) .table 5 éves túlélési ráta társul HIF-1α és p21 expressziós
Factor Matton 1 éves túlélési Matton 3 éves túlélése Matton 5 éves túlélés katalógusa
HIF-1αg (-), a p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), P21 (-) n = 42 katalógusa 92,7 katalógusa 80,0 katalógusa 80,0 **, *** katalógusa HIF-1α (+), p21 (+) n = 20 katalógusa 95,0 katalógusa 85,0 katalógusa 70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), a p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0,003 *** P = 0,003 (%) hotelben Vita
Eredményeink azt mutatják, hogy a veszteség a p21 expresszió pozitív korrelációt fiatalabb beteg életkora, és a nagyobb tumor. Sőt, sok beteg p21-negatív tumorok volt nyirokcsomó-metasztázis, amikor képest a p21-pozitív daganatok, jelentősen magasabb frekvencia. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a veszteséget a kifejezés a p21 részt vesz a folyamatok a tumor növekedés és metasztázis, egyetértésben korábban jelentések [14, 15].
HIF-1α overexpresszió összefüggésbe hozták a rossz klinikai eredmény egyes típusaiban a humán rákok [16-18]. Vannak azonban olyan jelentések azt sugallják, hogy a tumor kifejezése HIF-1α nem biztosít túlélési előnyt [18, 19]. Bár a legtöbb HIF-1 célgének elősegítheti a tumor növekedése révén fokozott expressziója, HIF-1-aktivált gének, beleértve a p21, szintén képesek arra, hogy gátolják a növekedési hipoxiás körülmények között [20, 21]. Méhen kívüli expressziója HIF-1α endotélsejtekben eredményezett up-regulációját P21, csökken a CDK tevékenységek, sejtciklus a G 0 /G 1 ellenőrző pont, és az ezt követő apoptózist [22]. A jelenlegi vizsgálat során azt találtuk, hogy az apoptotikus sejtek alulreprezentáltak a HIF-1α-pozitív /p21-negatív tumorok. Hipoxiás körülmények között, a HIF-1α gátolhatja a tumor proliferációját keresztül p21-közvetített sejtciklus-szabályozás, így az olyan sejtek szelekcióját, amelyek ellenállnak a apoptózist és rákellenes kezelések. A legtöbb tumor-sejtek megtartják azt a képességüket, hogy apoptózist válaszul hipoxiás stressz [23]. Amikor az apoptotikus választ hypoxia elvész, a felemelkedő tumor sejtek lehetnek jobban ellenáll a kezelés, és ezért hozzájárulnak a későbbi tumor kiújulásának [24]. A mechanizmusok, amelyekkel hipoxia szelektál sejtek apoptózissal szemben rezisztens nem tisztázott, de a részvétel a p53 mutáció megvizsgálták [25]. Jelentések azt mutatták, hogy a hipoxia gátolja a sejtnövekedést, és okozhat apoptózis révén p53-függő útvonal [26]. HIF-1α azt is kimutatták, hogy támogassák a p53-függő apoptózis [27], de más tanulmányok kimutatták, hogy növekedést leállító hipoxia van p53-független [26]. A jelenlegi vizsgálat során nem találtunk bizonyítékot a kapcsolata a p53 és p21 expresszió. Mi is értékeltük a HIF-1α és p53-expressziós sejt apoptózis, de nem talált közötti statisztikai szignifikanciát a HIF-1α és a p53 expressziós (az adatokat nem mutatjuk). A korábbi tanulmány kimutatta, hogy a kombinációs HIF-1α túltermelése és nem funkcionális p53 inkább jelzi a rossz prognózisú [28].
Betegeknél a HIF-1α-pozitív daganatok, a korreláció elvesztése p21 expresszió és rossz klinikai kimenetele tükrözik a fiziológiai különbséget a képességét, a p21-pozitív versus p21-negatív tumorok, hogy túlélje hipoxiás körülmények között. Bár a HIF-1α-függő transzkripciós aktivációs összefüggésbe hozták a tumor növekedését, eredményeink arra utalnak, hogy együttes kifejeződése a p21 és a HIF-1α is gátolhatják a tumor növekedését bizonyos mértékben.
A molekuláris mechanizmusa HIF-1α expresszió rák szavatolja különösen figyelmet [29]. A széles körben elterjedt előfordulása fokozódik HIF-1α közös rákok és bevonása hipoxia útjainak tumorangiogenezist biztosan érvelni annak fontosságát és széles körben alkalmazott. A kemoterápia és sugárzás, hogy a cél a HIF-1α hatékonyak lehetnek, és reális, és valójában, ez a megközelítés nem számoltak be [30]. Azonban a minőségi és mennyiségi különbségek a hipoxiás válasz különböző sejttípus nem ismert [31]. Ezért további kutatásra van szükség annak érdekében, hogy értékelje, milyen hatással HIF-1-mediált útvonalakon a sejtek szaporodását és apoptózis humán daganatok hipoxiás mikrokörnyezet.
A jelen tanulmányban azt mutatták, hogy a HIF-1α túltermelése és a veszteség p21expression a gyomorrák korrelál rossz beteg prognózisa, míg a daganatok, hogy a megtartott p21 expresszió, vagy elvesztette a HIF-1α kifejezést. A lehetséges mechanizmusa ezt javasolta a megállapítás, hogy az apoptotikus sejteket alulreprezentáltak a HIF-1α-pozitív /p21-negatív tumorok. Agresszív daganat, amely nem vált ki p21 egy HIF-1α - függő módon megnőhet a sejtek túlélését nélkül apoptózist, és hozzájárulnak a rossz prognózisú betegek számára. Katalógusa finanszírozás támogatására katalógusa Sebészeti Osztály és a tudomány, Graduate School of Medical tudomány, Kyushu University, Fukuoka, Japán. katalógusa nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás katalógusa a szerzők köszönetet mondanak K. Miyamoto a technikai segítségnyújtás. katalógusa Szerzők eredeti beküldötteknek képeket
alábbiakban a linkeket a szerzők "eredeti beküldötteknek képeket. 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg A szerzők eredeti fájlt az 1. ábra szerinti 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 2. ábrán 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 3. ábra 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 4. ábra Összeférhetetlenség katalógusa A szerző (k ) kijelentik, hogy nincsenek ellentétes érdekek. katalógusa
  • gyomor cikk
    •   
  • A gyomor szerkezet
    •   
  • Gondoskodás a gyomor
    •   
  • kutatások

    • kutatások

    kutatások

    Other Languages

    gyomor egészség © https://www.stomachillness.com/hu