gástrica de 1α factor de inducible por hipoxia y p21
expresión WAF1 /CIP1 a la apoptosis de células y el resultado clínico en pacientes con cáncer gástrico Resumen Antecedentes
factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α) desempeña un papel esencial en la homeostasis de oxígeno. La expresión de genes HIF-1α-inducible se asocia con la progresión del tumor. p21 media la detención del ciclo celular y es uno de los genes abajo dirigidos por HIF-1.
Pacientes y métodos
hemos examinado la relación entre HIF-1α y la expresión de p21, la apoptosis y la progresión tumoral usando muestras de tejido obtenidas quirúrgicamente de 126 Los pacientes con cáncer gástrico.
resultados El análisis inmunohistoquímico
indicaron que la pérdida de expresión de p21 correlacionó positivamente con la edad del paciente y el tamaño del tumor. Metástasis de ganglios linfáticos fue significativamente más frecuente en los tumores con pérdida de expresión de p21 (p = 0,022). tumores HIF-1α-positive /p21-negativos tenían un índice de apoptosis más bajo que otros tipos de muestras tumorales, y los pacientes con tumores de HIF-1α-positive /p21-negativos también tenían un pronóstico significativamente peor que las otras poblaciones de pacientes. Conclusión
Estos resultados sugieren que la pérdida de HIF-1α-dependientes de expresión p21 resultados en disminución de la apoptosis, el aumento de la supervivencia celular y tumores más agresivos.
Antecedentes Francia El crecimiento no regulado de las células cancerosas a menudo resulta en condiciones de hipoxia en las células tumorales masas. Los resultados del tumor hipoxia de un desequilibrio entre el consumo elevado de oxígeno en las células tumorales de ciclo corto y el suministro insuficiente de oxígeno debido a la falta de una red vascular fisiológico. Los organismos multicelulares han desarrollado mecanismos celulares que median en una cascada de respuestas moleculares de adaptación a la hipoxia. HIF-1α es un factor de transcripción que activa la expresión de genes mediante la unión al elemento de respuesta hipoxia (HRE), una secuencia de ADN aguas arriba que actúa en cis presente de varios genes esenciales para la respuesta celular a la hipoxia [1]. genes HIF-1a-sensible también funcionan en la ruta de la glucólisis y en la hematopoyesis y la angiogénesis, a través de los cuales las células adquieren un metabolismo hipoxia adaptado y el aumento de suministro de oxígeno [2]. Recientemente, HIF-1α ha surgido como un regulador clave en el crecimiento de cáncer gástrico [3].
La apoptosis es un mecanismo de la muerte celular conservado evolutivamente que también se produce en la respuesta celular adaptativa al estrés hipóxico. La apoptosis, también, es una importante salvaguarda contra el desarrollo de tumores. Los tumores que exhiben pérdida de los niveles de p53 supresor de tumores gen exhiben reducidos de muerte celular inducida por hipoxia y un aumento asociado en la progresión tumoral [4]. El gen p21 (WAF1) fue clonado en una pantalla genética para efectores aguas abajo de p53 y por separado en una pantalla para los reguladores de aguas arriba de quinasas dependientes de ciclina (CDKs) como CDK-proteína de interacción (CIP1) [5]. El promotor p21 puede transactivated por HIF-1 en una línea celular de cáncer de próstata humano, lo que indica que p21 es un gen diana HIF-1 [6]. Además, la expresión de p21 inducida por hipoxia fue abrogada en células que carecen de HIF-1α, pero no en células parentales [7].
HIF-1α, por tanto, pueden promover la supervivencia celular y la detención del crecimiento a través de la inducción de genes sensible a la hipoxia. En el presente estudio, hemos examinado el papel de HIF-1α en el control de la progresión tumoral hipóxico, mediante el examen de la relación entre la expresión de HIF-1α, expresión de p21 y la apoptosis en las muestras de tejido de pacientes con cáncer gástrico.
Materiales y métodos
materiales clínico
Los sujetos fueron 126 pacientes con cáncer gástrico (85 hombres, 41 mujeres; rango de edad, 27 a 88 años, edad media, 65,2 años) que se sometieron a gastrectomía en nuestra institución en 1994. resección curativa se realizó en 77 los pacientes y la resección curativa no en 49. Las muestras de tejido resecado se fijaron en una solución de formaldehído al 10% y embebidos en parafina. Secciones (4 m de espesor) se montaron en portaobjetos de vidrio. Todas las muestras se examinaron macroscópicamente e histológicamente, sobre la base de criterios propuestos por el Reglamento General para el Estudio del Cáncer Gástrico [8]. El examen histológico se llevó a cabo en preparaciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina (H & E). En el estudio actual, los tumores se dividen en dos tipos histológicos: tipo diferenciado, que comprende adenocarcinoma papilar y adenocarcinoma tubular, y el tipo indiferenciado, que comprende adenocarcinoma pobremente diferenciado, carcinoma de células en anillo de sello, y el adenocarcinoma mucinoso. Dos bloques de parafina se preparan para todos los pacientes "uno que contienen tanto tejido tumoral y tejido normal adyacente, y el otro que contiene el tejido del tumor que invade al nivel más profundo de la pared del estómago.
La tinción inmunohistoquímica
Todos los especímenes fueron immunostained con un anticuerpo monoclonal anticuerpo contra p21 WAF1 /CIP1 (SX118, se diluyó 1:50, DAKO, Glostrup, Dinamarca), p53 (Do-7, se diluyó 1:50, DAKO, Glostrup, Dinamarca), y HIF-1α (NB 100- 105, diluido 1:. 100, Novus Productos Biológicos, Littleton, CO, EE.UU.) [9] Después de desparafinación y rehidratación, las diapositivas de p21 y p53 inmunotinción se autoclave en tampón citrato (0,01 M, pH 6,0) a 120 ° C durante 10 minutos;.. 0,001 M de EDTA (pH 8,0) se utilizó para HIF-1αimmunostaining para facilitar la reactividad del antígeno de tejido fijado embebido con el anticuerpo peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de las muestras en metanol que contiene 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 10 minutos las muestras fueron luego se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron con suero normal de conejo durante 30 minutos. Las secciones se incubaron con los anticuerpos primarios antes mencionados durante 2 horas a temperatura ambiente, después se enjuaga tres veces en PBS. Para la detección, se utilizó un kit de Histofine SAB-PO (M) (Nichirei Corporation, Tokio, Japón). Las secciones fueron incubadas con biotina conejo immunogloblin anti-ratón (Ig; IgG, IgA, y IgM; Nicchirei Corp) durante 10 minutos, se lavaron tres veces en PBS y se trataron con estreptavidina conjugada con peroxidasa durante 10 minutos. Después de un lavado final en PBS, la etiqueta peroxidasa se detectó por incubación de las secciones en tetrahidro-cloruro de diamino-bencidina (DAB) durante 3 minutos. contra-tinción nuclear se llevó a cabo usando una solución de hematoxilina de Mayer. Para los controles negativos, los anticuerpos primarios fueron sustituidos por suero no inmune, normal. inmunohistoquímica automatizada también se llevó a cabo para apoyar la inmunotinción se ha descrito anteriormente, utilizando un Sistema de Ventana Discovery ™ (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, EE.UU.).
Evaluación de inmunotinción proteína p21
estaba presente en los núcleos de las células tumorales (Figura 1A). En algunos casos, mucosa gástrica normal expresa la proteína p21, y la tinción nuclear se pudo detectar en las partes superficiales de la tumor, pero no en las regiones más profundas. Se contó el número de células p21 positivas en la sección de tumor conjunto, y se evaluó el número de células p21-postive de acuerdo con la profundidad de las capas. El patrón de inmunotinción HIF-1α en el tumor era nuclear y /o citoplásmica (Figura 1B). tinción nuclear de HIF-1α estaba ausente en el tejido normal con exclusión de tinción citoplasmática. En todas las muestras, la proteína p53 era indetectable en los tejidos normales, y presente en los núcleos de células tumorales (Figura 1C). Una célula con inmunotinción nuclear para p21, p53 o HIF-1α (fuerte o débil) se calificó como positivo. Sobre la base de estos criterios, se calcularon las áreas de tinción focal con el mayor porcentaje de tinción nuclear p53 y p21-positivas en el tejido tumoral de profundidad. Un tumor se puntuó como p21- o p53-positiva cuando más de 10% de las células tumorales tenía tinción nuclear, de acuerdo con los informes anteriores [10]. la expresión de HIF-1α era frecuentemente evidente en las regiones alrededor de los bordes invasores del tumor, y las áreas necróticas tales como los que cerca de una úlcera profunda. Anotamos tumores positivos para la sobreexpresión de HIF-1α si se detectó tinción nuclear en más de 10% de las células tumorales, independientemente de la reactividad citoplasmática en cualquier nivel [9, 11]. Figura 1 A) expresión de p21 en el tejido tumoral adyacente. inmunotinción nuclear es evidente (aumento original, 100 ×). B) la expresión de HIF-1α en la invasión de las regiones del tumor. La variabilidad en la intensidad de la inmunotinción nuclear es evidente, acompañado por tinción citoplasmática (aumento original, 100 ×). C) inmunotinción nuclear de p53 en el tejido tumoral (ampliación original, 100 ×). tejido D) del tumor teñidas con H & E (aumento original, 200 ×). El tejido tumoral contiene células (flecha) con rasgos característicos de la apoptosis
Evaluación de la apoptosis
Anotamos células apoptóticas como los que muestran las características típicas de la apoptosis cuando las muestras de tejido se tiñeron con H &. E (Figura 1D). La detección de células apoptóticas en base a los rasgos característicos de la apoptosis: compactación y migración de los contornos nucleares y celulares, la fragmentación nuclear y la protuberancia, y la presencia de cuerpos apoptóticos [12]. Las células apoptóticas fueron contados en muestras de tejido de todos los pacientes. Se seleccionaron cinco campos de gran aumento (× 400) con la más abundante distribución de las células tumorales para el recuento y se contaron entre 1000 y 1500 células tumorales. A continuación, el índice apoptótico se calculó como el porcentaje de células apoptóticas. Se evitaron las zonas con necrosis extensa. Un único patólogo en cada institución revisó las diapositivas y se contaron las células apoptóticas de acuerdo con los criterios descritos anteriormente.
El análisis estadístico
en el paquete estadístico BMDP (BMDP, Los Ángeles, CA) para IBM (Armonk, Nueva York) 3090 de mainframe las computadoras se utilizaron para todos los análisis estadísticos [13]. Los conjuntos de datos se compararon mediante chi-cuadrado y el estudiante de t-tests que utilizan los programas de 4 F y 3S BMDP. Se utilizó el programa BMDP 1L para analizar el tiempo de supervivencia mediante el método de Kaplan-Meier. La significación estadística se estableció en el P < 0.05.
Resultados
expresión de p21 y los factores clínico-patológicos
La Tabla 1 muestra la correlación de la expresión o la pérdida de expresión de p21 con varios factores clínico-patológicos. En general, 71 (56,3%) de las muestras de tumor 126 fueron negativos para la expresión de p21. En los tumores de pacientes menores de 65 años de edad, la pérdida de expresión de p21 fue significativamente más frecuente que en los tumores de pacientes mayores de 65 años (p = 0,026). La pérdida de expresión de p21 fue significativamente más frecuente en los tumores con gran tamaño (P = 0,03), en comparación con los tumores más pequeños. Con respecto a la metástasis, los tumores con pérdida de expresión de p21 tendían a mostrar una mayor frecuencia de invasión linfática (P = 0,089, Tabla 1) y una frecuencia significativamente mayor de metástasis de ganglios linfáticos (P = 0,022, Tabla 2) que los tumores p21 que expresan. Tabla 3 muestra la relación entre la expresión de p21, y la expresión de p53 y HIF-1α. La sobreexpresión de p53 se detectó en 57 tumores (45,2%), y se detectó la sobreexpresión HIF-1α en 49 tumores (38,9%). El análisis inmunohistoquímico no reveló una correlación entre la expresión de p21 y la expresión de p53 o p21 y HIF-1α sobreexpresión (P = 0,444 y 0,609, respectivamente) .Tabla 1 Relación entre la expresión de p21 y los factores clínico-patológicos
Factores
p21 (+) (n = 55) guía empresas p21 (-) (n = 71)
P valor
Edad (años) Hotel < 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Sexo Masculino
38
47
0.731
Mujer
17
24
profundidad de la invasión
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
Histología
diferenciada
35
39
0,325
indiferenciado
20
32
El tamaño del tumor Hotel < 3 cm
23
22
0,03 página 3 cm ≦ 22
invasión
49
linfático negativo
26
23
0,089
positivo
29
48
invasión venosa
negativo
42
57
0,595
positiva página 13 página 14 sobre Table 2 Relación entre expresión de p21 y la metástasis
tumoral p21-negativos (%)
P valor
metástasis de ganglios linfáticos
negativo
36/75 (48,0) 0,022
positiva 35/51 (68,6)
metástasis de hígado
negativo
68/122 (55,7) 0,447
positivo
3/4 (75.0)
diseminación peritoneal
negativo
62/112 (55,4) 0.525
positiva
9/14 (64,3) sobre Table 3 Relación entre p21 y p53, y la expresión
HIF-1α |
|
p21
|
|
|
positiva (n = 55) guía empresas negativa (n = 71)
valor de p
p53
positiva (n = 57)
27
30
0,444
negativa (n = 69)
28
41
HIF-1α
positivo (n = 49)
20
29
0,608
negativa (n = 77)
35
42
apoptosis asociada con HIF-1α y la expresión de p21 Francia El significa apoptótica índice de los 126 tumores fue 8,95 ± 6,24 (rango 0-37). Los tumores se dividieron en cuatro poblaciones diferentes en función de HIF-1α y expresión de p21 y el índice apoptótico media para cada grupo se calculó (Tabla 4). Los tumores que se HIF-1α-positive /p21-negativos tenían el índice más bajo de apoptosis. Hubo una diferencia significativa entre los tumores que se HIF-1α-positive /p21-negativos, y los que estaban HIF-1α-negativa /p21-negativos (P = 0,037) .Tabla 4 apoptosis asociada con HIF-1α y expresión p21
Factor
apoptótica índice
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9,6 ± 7,33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* p = 0,129 ** P = 0,037 * ** p = 0,078 (media ± dE)
El resultado clínico asociado con HIF-1α y la expresión de p21 Francia El tiempo medio de seguimiento de los pacientes fue de 55 ± 28 (± 1 SD) meses (rango, 1-82 meses). La tasa de supervivencia a los 5 años de los pacientes con tumores p21 negativo fue menor que la de los tumores p21-positivos, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (datos no mostrados). Los 126 pacientes se dividieron de nuevo en cuatro poblaciones basadas en la expresión de HIF-1α y la expresión de p21, y hemos examinado la relación entre la expresión y el pronóstico HIF-1α en muestras de p21-positivo o tumorales -negativa. La Tabla 5 muestra las tasas de supervivencia de 1, 3 y 5 años para los pacientes y la correlación con HIF-1α y la expresión de p21. Los pacientes con tumores de HIF-1α-positive /p21-negativos tenían un pronóstico significativamente peor que las otras poblaciones de estudio. En particular, en pacientes con tumores de HIF-1a-positivos, los que habían perdido la expresión de p21 tenían un pronóstico significativamente peor que aquellos con expresión de p21 (p = 0,042) .Tabla de 5 años la tasa de supervivencia asociada con HIF-1α y la expresión de p21
Factor
supervivencia a 1 año
supervivencia a 3 años
supervivencia a 5 años
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0 82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7 80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0 85,0
70.0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1 57,4
45.9 *, **, ***
* p = 0,042 ** P = 0,003 *** p = 0,003 (%)
Discusión
Nuestros resultados muestran que la pérdida de expresión de p21 se correlacionó positivamente con la edad del paciente más joven, y el tumor más grande. Por otra parte, muchos pacientes con tumores p21-negativos tenían metástasis en los ganglios linfáticos, en comparación con aquellos con tumores p21-positivos, con una frecuencia significativamente mayor. Estos resultados sugieren que la pérdida de expresión de p21 está implicado en los procesos de crecimiento tumoral y la metástasis, de acuerdo con informes anteriormente [14, 15].
Sobreexpresión HIF-1α se ha relacionado con un pobre resultado clínico en algunos tipos de los cánceres humanos [16 a 18]. Sin embargo, algunos informes han sugerido que la expresión tumoral de HIF-1α no confiere una ventaja de supervivencia [18, 19]. Aunque la mayoría de los genes diana HIF-1 puede promover el crecimiento del tumor a través de su mayor expresión, los genes activados por HIF-1, incluyendo p21, también tienen el potencial para inhibir el crecimiento bajo condiciones de hipoxia [20, 21]. La expresión ectópica de HIF-1α en las células endoteliales dio lugar a la sobre regulación de p21, la reducción de las actividades de CDK, la detención del ciclo celular en el G 0 /G 1 punto de control, y la posterior apoptosis [22]. En el presente estudio, encontramos que las células apoptóticas están insuficientemente representadas en los tumores de HIF-1α-positive /p21-negativos. Bajo condiciones de hipoxia, HIF-1α puede inhibir la proliferación del tumor a través de control del ciclo celular p21 mediada, resultando en la selección de células que son resistentes a los tratamientos de la apoptosis y anti-cáncer. La mayoría de las células tumorales conservan la capacidad de someterse a la apoptosis en respuesta al estrés hipóxico [23]. Cuando se pierde la respuesta apoptótica a la hipoxia, las células tumorales emergentes pueden ser más resistentes al tratamiento y por lo tanto pueden contribuir a la posterior recaída del tumor [24]. Los mecanismos por los que la hipoxia selecciona para células resistentes a la apoptosis no está claro, pero la participación de la mutación p53 ha sido examinado [25]. Los informes han demostrado que la hipoxia inhibe el crecimiento celular, y puede causar la apoptosis a través de una vía dependiente de p53 [26]. HIF-1α también se ha demostrado que la promoción de la apoptosis dependiente de p53 [27], pero otros estudios han demostrado que la detención del crecimiento en respuesta a la hipoxia es independiente de p53 [26]. En el presente estudio, no se encontraron pruebas de una relación entre p53 y p21 expresión. También se evaluó la relación entre HIF-1α y la expresión de p53 a la apoptosis celular, pero no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre HIF-1α y la expresión de p53 (datos no mostrados). Nuestro estudio anterior mostró que la combinación de la sobreexpresión de HIF-1α con p53 no funcional tiende a indicar un mal pronóstico [28]. Hoteles en pacientes con tumores de HIF-1a-positivo, la correlación entre la pérdida de expresión de p21 y los pobres resultados clínicos pueden reflejar una diferencia fisiológica en la capacidad de p21-positivas frente a tumores p21-negativos para sobrevivir en condiciones de hipoxia. Aunque la activación de la transcripción HIF-1α dependiente se ha asociado con el crecimiento del tumor, nuestros resultados sugieren que la expresión concomitante de p21 y HIF-1α puede retardar el crecimiento tumoral en cierto grado.
El mecanismo molecular que subyace a la expresión de HIF-1α en órdenes de cáncer en particular atención [29]. La práctica generalizada de la upregulated HIF-1α en los cánceres comunes y la implicación de las vías de la hipoxia en la angiogénesis tumoral sin duda abogan por su importancia y amplia aplicabilidad. La quimioterapia y la radiación que se dirigen a HIF-1α pueden ser eficaces y realista, y de hecho, este enfoque ha informado [30]. Sin embargo, las diferencias cualitativas y cuantitativas en la respuesta hipóxica de diferentes tipos de células no son bien conocidos [31]. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para evaluar los efectos de las vías mediadas por HIF-1 sobre la proliferación celular y la apoptosis en los cánceres humanos bajo hipóxico microambientes.
En el presente estudio, hemos demostrado que la sobreexpresión de HIF-1α y la pérdida de p21expression en cánceres gástricos correlaciona con mal pronóstico de los pacientes, en comparación con los tumores que conservan la expresión de p21, o habían perdido la expresión de HIF-1α. Un mecanismo potencial para esto fue sugerido por el hallazgo de que las células apoptóticas están insuficientemente representadas en los tumores de HIF-1α-positive /p21-negativos. tumores agresivos que no logran inducir p21 en un HIF-1α - forma dependiente pueden haber aumentado la supervivencia celular sin la apoptosis, y contribuir a un mal pronóstico para los pacientes apoyo financiero
Departamento de Cirugía y Ciencia, Facultad de Medicina. ciencia, Universidad de Kyushu, Fukuoka, Japón.
Declaraciones
Agradecimientos los autores agradecen
K. Miyamoto para la asistencia técnica.
los autores originales presentados archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los autores "original expediente sometido a las imágenes. 'archivo original para la figura 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff autores 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg Autores archivo original de' archivo original de la figura 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff autores figura 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Autores archivo original de la figura 4 de conflictos de interés en el autor (s ) declaran que no tienen intereses en competencia.
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