Relatie van hypoxie-induceerbare factor 1α en p21
WAF1 /CIP1 expressie apoptose en klinische uitkomst bij patiënten met maagkanker cel
Abstracte achtergrond
hypoxia-induceerbare factor-1α (HIF-1α) speelt een essentiële rol in zuurstof homeostase. De expressie van HIF-1α-induceerbare genen gerelateerd tumorprogressie. p21 bemiddelt celcyclus en is een van de stroomafwaartse genen doelwit van HIF-1.
PATIËNTEN EN METHODEN
We onderzochten de relatie tussen HIF-1α en p21 expressie, apoptose en tumorprogressie gebruik weefselmonsters chirurgisch verkregen uit 126 patiënten met maagkanker.
Resultaten
Immunohistochemische analyse gaf aan dat het verlies van p21-expressie positief gecorreleerd met de leeftijd van de patiënt en de grootte van de tumor. Lymfeklier metastase was significant vaker voor in tumoren met verlies van p21 expressie (P = 0,022). HIF-1α-positieve /p21-negatieve tumoren een lagere apoptose-index dan andere tumormonsters, en patiënten met HIF-1α-positieve /p21-negatieve tumoren hadden ook een significant slechtere prognose dan de andere patiëntengroepen.
Conclusie
Deze resultaten suggereren dat het verlies van HIF-1α afhankelijke p21 expressie leidt tot verminderde apoptose verhoogde celoverleving en meer agressieve tumoren. achtergrond
De ongereguleerde groei van kankercellen resulteert vaak in hypoxische omstandigheden tumorcel massa. Tumorhypoxia gevolg van een onevenwicht tussen verhoogde zuurstofverbruik in de snel delende tumorcellen en onvoldoende zuurstof door het ontbreken van een fysiologische vasculaire netwerk. Meercellige organismen cellulaire mechanismen die een cascade van moleculaire adaptieve responsen op hypoxie mediëren geëvolueerd. HIF-1α is een transcriptiefactor die genexpressie activeert door binding aan de hypoxia responsief element (HRE), een cis- werkende DNA sequentie die aanwezig stroomopwaarts van verscheidene genen essentieel voor de cellulaire respons op hypoxia [1]. HIF-1α-responsieve genen functioneren ook in de glycolyse route en hematopoiese en angiogenese, door al die cellen verwerven hypoxia aangepaste metabolisme en verhoogde zuurstoftoevoer [2]. Onlangs is HIF-1α voren gekomen als een belangrijke regulator van de groei van maagkanker [3].
Apoptose is een evolutionair geconserveerd mechanisme celdood die ook optreedt bij de adaptieve respons op hypoxische cellulaire stress. Apoptose, ook dat is een belangrijke waarborg tegen de ontwikkeling van tumoren. Tumoren die verlies van het p53 tumor-suppressor gen vertonen verlaagde hypoxia-geïnduceerde celdood en een bijbehorende verhoging van tumorprogressie vertonen [4]. De p21 gen (WAF 1) werd gekloneerd in een genetische screen voor effectoren van p53 en afzonderlijk in een scherm stroomopwaartse regulatoren van cycline-afhankelijke kinasen (CDK's) als CDK-interagerende proteïne (CIP1) [5]. De p21-promotor kan worden transactivated door HIF-1 in humane prostaatkanker cellijn, wat aangeeft dat p21 een HIF-1 doelwitgen [6]. Verder werd door hypoxie geïnduceerde p21 expressie ingetrokken in cellen ontbreekt HIF-1α, maar niet in oudercellen [7].
HIF-1α kan derhalve bijdragen aan zowel celoverleving en groeistop door de inductie van hypoxia-responsieve genen. In het onderhavige onderzoek onderzochten we de rol van HIF-1α in hypoxische controle tumorprogressie, door onderzoek van de relatie tussen HIF-1α expressie, p21 expressie en apoptose in weefselmonsters van patiënten met maagkanker.
Materialen en werkwijzen
Clinical materialen
onderwerpen waren 126 patiënten met maagkanker (85 mannen, 41 vrouwen, leeftijd 27 tot 88 jaar, gemiddelde leeftijd 65,2 jaar) die gastrectomie ondergingen bij onze instelling in 1994. Curatieve resectie werd uitgevoerd in 77 patiënten en niet-curatieve resectie 49. weggesneden weefselmonsters werden gefixeerd in een 10% formaldehyde-oplossing en ingebed in paraffine. Secties (4 micrometer dik) werden gemonteerd op glasplaatjes. Alle monsters werden macroscopisch en histologisch onderzocht, op basis van de algemene regels voorgesteld voor de Maag Cancer Study [8] criteria. Histologisch onderzoek werd uitgevoerd op weefsel voorbereidingen gekleurd met hematoxyline en eosine (; E H &) uitgevoerd. In de huidige studie werden tumoren verdeeld in twee histologische types: gedifferentieerd soort, bestaande uit papillair adenocarcinoom en tubulaire adenocarcinoom en ongedifferentieerde type bestaande uit slecht gedifferentieerde adenocarcinoom, zegelring cell carcinoma, en mucineus adenocarcinoom. Twee paraffineblokken werden voor alle patiënten "één die zowel tumorweefsel en aangrenzend normaal weefsel, en de andere met tumor weefsel invasie het diepste van de maagwand.
Immunohistochemische kleuring Leer Alle monsters werden immunogekleurd met een monoklonaal antilichaam tegen p21 WAF1 /CIP1 (SX118, 1:50 verdund, DAKO, Glostrup, Denemarken), p53 (Do-7, 1:50 verdund, DAKO, Glostrup, Denemarken), en HIF-1α (NB 100- 105, verdund 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) [9] Na deparaffineren en rehydratatie de schuiven voor p21 en p53 immunokleuring geautoclaveerd in citraatbuffer (0,01 M, pH 6,0) bij 120 ° C gedurende 10 minuten,.. 0,001 M EDTA (pH 8,0) werd gebruikt voor HIF-1αimmunostaining tot de reactiviteit van de vaste ingebed weefsel antigen met het antilichaam te vergemakkelijken Endogene peroxidase werd geblokkeerd door incuberen van de monsters in methanol bevattende 0,3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten werden vervolgens gespoeld in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en geïncubeerd met normaal konijnenserum gedurende 30 minuten. Secties werden geïncubeerd met genoemde primaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, vervolgens driemaal gespoeld met PBS. Voor detectie gebruikten wij een Histofine SAB-PO (M) kit (Nichirei Corp., Tokyo, Japan). De coupes werden vervolgens geïncubeerd met gebiotinyleerd konijn anti-muis immunogloblin (Ig, IgG, IgA en IgM; Nicchirei Corp) gedurende 10 minuten, drie keer gewassen in PBS en behandeld met peroxidase-geconjugeerd streptavidine gedurende 10 minuten. Na een laatste wasbehandeling in PBS, werd het peroxidase label gedetecteerd door incuberen van de secties in diamino-benzidine tetrahydro-chloride (DAB) gedurende 3 minuten. Nuclear contra-kleuring werd gedaan met behulp van Mayer's hematoxyline oplossing. Voor negatieve controles werden primaire antilichamen vervangen door niet-immune, normaal serum. Geautomatiseerde immunohistochemie werd uitgevoerd om de bovenbeschreven immunokleuring ondersteunen, met een Ventana Discovery ™ System (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA).
Evaluatie van immunokleuring
p21-eiwit was aanwezig in de kernen van tumorcellen (Figuur 1A). In sommige gevallen, normale maagslijmvlies expressie gebracht p21 proteïne, nucleaire kleuring kon worden gedetecteerd in de oppervlakkige bereikt van de tumor, maar niet in de diepere regionen. We telden het aantal p21-positieve cellen in de gehele tumor sectie en geëvalueerd het aantal p21-positieve cellen volgens de dikke lagen. Het patroon van HIF-1α immunokleuring in de tumor nucleaire en /of cytoplasma (Figuur 1B). Nucleaire kleuring van HIF-1α afwezig in normaal weefsel met uitzondering van cytoplasmatische kleuring. In alle monsters, p53 proteïne niet detecteerbaar in normaal weefsel en in de kernen van tumorcellen (figuur 1C). Een cel nucleaire immunokleuring voor p21, p53 en HIF-1α (zwakke of sterke) werd als positief geteld. Op basis van deze criteria, werden gebieden van focale kleuring met het hoogste percentage van p53 en p21-positieve nucleaire kleuring binnen deep tumorweefsel geschat. Een tumor werd gescoord als p21- of p53-positieve wanneer meer dan 10% van de tumorcellen nucleaire kleuring, in overeenstemming met eerdere rapporten [10]. HIF-1α expressie is vaak zichtbaar in de gebieden rond de binnenvallende randen van de tumor, en necrotische gebieden zoals nabij een diepe zweer. We scoorden tumoren positief voor HIF-1α overexpressie als nucleaire kleuring in meer dan 10% van de tumorcellen gedetecteerd, ongeacht cytoplasmatische reactiviteit op alle niveaus [9, 11]. Figuur 1 A) p21 expressie in aangrenzende tumorweefsel. Nuclear immunokleuring is duidelijk (oorspronkelijke vergroting, 100 x). B) HIF-1α expressie in tumor invasie gebieden. Variabiliteit in de intensiteit van de nucleaire immunokleuring is duidelijk, vergezeld van cytoplasmatische kleuring (oorspronkelijke vergroting, 100 x). C) Nucleaire immunokleuring van p53 in tumorweefsel (oorspronkelijke vergroting, 100 x). D) Tumorweefsel gekleurd met H &E (oorspronkelijke vergroting 200 x). Tumorweefsel bevat cellen (pijl) met kenmerken van apoptose
Evaluatie apoptose
We scoorden apoptotische cellen zoals die met de kenmerkende kenmerken van apoptose wanneer weefselmonsters werden gekleurd met H &. E (Figuur 1D). Apoptotische cellen werden geïdentificeerd op basis van de kenmerken van apoptose: verdichting en migratie atoom en cel lijnen, nucleaire fragmentatie en uitsteeksel, en de aanwezigheid van apoptotische lichamen [12]. Apoptotische cellen werden geteld in weefselmonsters van alle patiënten. Vijf hoge krachtvelden (x 400) met de meest overvloedige verspreiding van tumorcellen geselecteerd voor graven en tussen 1000 en 1500 tumorcellen werden geteld. De apoptotische index werd vervolgens berekend als het percentage apoptotische cellen. Gebieden met uitgebreide necrose werden vermeden. Een enkele patholoog bij elke instelling beoordeeld de dia's en telde apoptotische cellen volgens de hierboven beschreven criteria.
Statistische analyse
BMDP Statistical Package-programma (BMDP, Los Angeles, CA) voor IBM (Armonk, NY) 3090 mainframe computers werden gebruikt voor statistische analyses [13]. Datasets werden vergeleken door chi-kwadraat en Student's t-testen met behulp van de BMDP 4F en 3S-programma's. Het BMDP 1L programma werd gebruikt om overlevingsduur te analyseren met behulp van de Kaplan-Meier-methode. Statistische significantie werd vastgesteld op het P < 0.05 level.
Resultaten
p21 expressie en clinico-pathologische factoren
Tabel 1 toont de correlatie van de expressie of het verlies van de expressie van p21 met diverse clinico-pathologische factoren. Overall, 71 (56,3%) van de 126 tumormonsters waren negatief voor p21 expressie. In tumoren van patiënten jonger dan 65 jaar, het verlies van p21-expressie was significant vaker dan in tumoren van patiënten ouder dan 65 (P = 0,026). Verlies van p21 expressie significant vaker voor bij tumoren met grote afmeting (P = 0,03), in vergelijking met kleinere tumoren. Wat metastasen, tumoren met verlies van p21 expressie neiging frequenter lymfatische invasie (p = 0,089, Tabel 1) en een aanzienlijk hogere frequentie van lymfeknoop metastasen (P = 0,022, Tabel 2) dan p21 expressie tumoren. Tabel 3 toont de relatie tussen p21 expressie en de expressie van p53 en HIF-1α. Overexpressie van p53 werd gedetecteerd in 57 (45,2%) tumoren en HIF-1α overexpressie werd gedetecteerd in 49 (38,9%) tumoren. Immunohistochemische analyse leverde een correlatie tussen p21 expressie en p53 expressie, of p21 en HIF-1α overexpressie (P = 0,444 en 0,609, respectievelijk) .table 1 Relatie tussen p21 expressie en clinico-pathologische factoren
Factoren
p21 (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
P-waarde
Leeftijd (jaar) Restaurant < 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Geslacht
Man
38
47
0,731
Female
17
24
Diepte van de invasie
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
histologie
Gedifferentieerde
35
39
0,325
Onzichtbare
20
32
tumorgrootte Restaurant < 3 cm
23
22
0.03
3 cm ≦
22
49
lymfatische invasie
Negatief
26
23
0,089
Positieve
29
48
veneuze invasie
Negatief
42
57
0,595
Positieve
13
14
Tabel 2 Relatie tussen p21 expressie en metastase
p21-negatieve tumor (%)
P waarde
lymfekliermetastasen
negatief
36/75 (48,0)
0.022
Positieve
35/51 (68,6)
lever metastase
Negatief
68/122 (55,7)
0,447
Positieve
04/03 (75,0)
peritoneale verspreiding
Negatief
62/112 (55,4)
0,525
Positieve
14/09 (64,3)
Table 3 Verband tussen p21 en p53 en HIF-1α expressie
|
|
p21
|
|
|
Positive (n = 55)
Negatief (n = 71)
P waarde
p53
Positief (n = 57)
27
30
0,444
Negatieve (n = 69)
28
41
HIF-1α
Positive (n = 49)
20
29
0,608
Negatieve (n = 77)
35
42
apoptose geassocieerd met HIF-1α en p21 expressie
De gemiddelde apoptotische index van alle 126 tumoren was 8,95 ± 6,24 (bereik 0-37). Tumoren werden verdeeld in vier verschillende populaties op basis van HIF-1α en p21 expressie en de gemiddelde apoptotische index voor elke groep werd berekend (Tabel 4). Tumoren die HIF-1α-positief /p21-negatieve waren had de laagste apoptotische index. Er was een significant verschil tussen tumoren die HIF-1α-positieve /p21-negatief waren, en die HIF-1α-negatieve /p21-negatieve (P = 0,037) .table 4 apoptose geassocieerd met HIF-1α en p21 expressie waren
Factor
apoptotische index
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9,6 ± 7,33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6.97 ± 4.22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (gemiddelde ± SD)
klinische uitkomst in verband met HIF-1α en p21 expressie
De gemiddelde follow-up tijd voor de patiënten was 55 ± 28 (± 1 SD) maanden (range, 1-82 maanden). De 5-jaars overleving van patiënten met p21-negatieve tumoren was lager dan dat van p21-positieve tumoren, maar het verschil was niet statistisch significant (gegevens niet getoond). De 126 patiënten werden opnieuw verdeeld in vier bevolkingsgroepen op basis van HIF-1α expressie en p21 expressie, en onderzochten we de relatie tussen HIF-1α expressie en prognose in p21-positieve of -negatieve tumor samples. Tabel 5 toont de 1-, 3- en 5-jaarsoverleving voor patiënten en de correlatie met HIF-1α en p21 expressie. Patiënten met HIF-1α-positief /p21-negatieve tumoren hadden een significant slechtere prognose dan de andere studie populaties. Vooral bij patiënten met HIF-1α-positieve tumoren, die expressie van p21 had verloren een significant slechtere prognose dan die met p21 expressie (p = 0,042) .table 5 jaar overlevingspercentage geassocieerd met HIF-1α en p21 expressie
Factor
1-jaars overleving
3-jaars overleving
5-jaars overleving
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0.003 *** P = 0,003 (%)
Discussie
Onze bevindingen tonen aan dat het verlies van p21-expressie positief gecorreleerd met jongere leeftijd van de patiënt, en grotere tumor. Bovendien zijn veel patiënten met p21-negatieve tumoren hadden lymfeklier in vergelijking met die van p21-positieve tumoren, bij een aanzienlijk hogere frequentie. Deze resultaten suggereren dat het verlies van expressie van p21 betrokken is bij het proces van tumorgroei en metastase, in overeenstemming met eerder rapporten [14, 15].
HIF-1α overexpressie is gekoppeld aan een slechte klinische uitkomst bij sommige types van menselijke kankers [16-18]. Er zijn echter enkele rapporten gesuggereerd dat de tumor expressie van HIF-1α een survival voordeel [18, 19] niet toekent. Hoewel de meeste van de HIF-1 doelgenen tumorgroei kunnen bevorderen door de versterkte expressie, HIF-1-geactiveerde genen, zoals p21, hebben ook het potentieel om groei onder hypoxische condities [20, 21] te remmen. Ectopische expressie van HIF-1α in endotheelcellen resulteerde in opwaartse regulatie van p21, vermindering van CDK activiteiten celcyclusstilstand in de G 0 /G 1 controlepost en daaropvolgende apoptose [22]. In de huidige studie, vonden we dat apoptotische cellen waren ondervertegenwoordigd in HIF-1α-positief /p21-negatieve tumoren. Onder hypoxische omstandigheden kan HIF-1α tumorproliferatie verminderen door p21 gemedieerde celcyclus, waardoor de selectie van cellen die resistent zijn tegen apoptose en anti-kankerbehandelingen. De meeste tumorcellen het vermogen behouden om apoptose te ondergaan in reactie op hypoxische spanning [23]. Wanneer de apoptotische respons op hypoxia verloren kunnen opkomende tumorcellen resistent tegen behandeling en derhalve bijdragen aan verdere tumorrecidief [24]. De mechanismen waarmee hypoxie selecteert op cellen resistent tegen apoptose is onduidelijk, maar de betrokkenheid van de p53 mutatie bestudeerd [25]. Rapporten hebben aangetoond dat hypoxie remt celgroei en apoptose kan veroorzaken door een p53-afhankelijke route [26]. HIF-1α is ook aangetoond dat p53-afhankelijke apoptose [27] te bevorderen, maar andere studies hebben aangetoond dat groeistop in reactie op hypoxie p53-onafhankelijke [26]. In de huidige studie, vonden we geen bewijs van een relatie tussen p53 en p21 expressie. We evalueerden ook de relatie tussen HIF-1α en p53 expressie apoptose, maar vond geen statistische significantie tussen HIF-1α en p53 expressie (gegevens niet getoond). Onze eerdere studie toonde aan dat de combinatie van HIF-1α overexpressie met functioneel p53 neiging om een sombere prognose [28] geven.
Bij patiënten met HIF-1α-positieve tumoren, de correlatie tussen verlies van p21 expressie en slechte klinische uitkomst kan tijdens een fysiologisch verschil in het vermogen van p21-positieve versus p21-negatieve tumoren overleven onder hypoxische omstandigheden. Hoewel HIF-1α-afhankelijke transcriptionele activering is geassocieerd met tumorgroei, onze resultaten suggereren dat gelijktijdige expressie van p21 en HIF-1α tumorgroei kan vertragen tot op zekere hoogte. Ondernemingen De moleculaire mechanisme dat HIF-1α expressie in kanker garandeert name aandacht [29]. De wijdverspreide voorkomen van opgereguleerd HIF-1α in voorkomende vormen van kanker en de betrokkenheid van hypoxie pathways in tumor angiogenese zeker pleiten voor het belang en de brede toepasbaarheid. Chemotherapie en straling die HIF-1α richten kan effectief en realistisch, en in feite is deze benadering gemeld [30]. De kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in het hypoxische respons van verschillende celtypen zijn niet bekend [31]. Verder onderzoek is dan ook om de effecten van HIF-1-gemedieerde paden op celproliferatie en apoptose in humane kankers onder zuurstofarme micro evalueren vereist.
In deze studie hebben we aangetoond dat HIF-1α overexpressie en verlies van p21expression in maagkankers gecorreleerd met een slechte prognose voor de patiënt, in vergelijking met tumoren die p21 expressie aangehouden of had HIF-1α expressie verloren. Een potentiële mechanisme voor dit werd gesuggereerd door de bevinding dat apoptotische cellen werden ondervertegenwoordigd in HIF-1α-positief /p21-negatieve tumoren. Agressieve tumoren die niet aan p21 te induceren in een HIF-1α - afhankelijke manier kan overleving van de cel zijn toegenomen zonder apoptose, en bijdragen aan een slechte prognose voor patiënten
Funding ondersteuning
afdeling Heelkunde en Wetenschappen, Graduate School of Medical. Wetenschap, Kyushu University, Fukuoka, Japan.
verklaringen
Dankwoord
de auteurs danken K. Miyamoto voor technische ondersteuning.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan de links naar de auteurs 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff Authors' 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg Auteurs originele bestand voor 'originele bestand voor figuur 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff Authors' figuur 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Auteurs originele bestand voor figuur 4 Belangenconflict
De auteur (s ) verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
| 
Mannen die twee keer per week yoghurt eten, hebben minder kans op darmkanker
Onderzoek toont aan hoe darmmicroben maaggriep beïnvloeden
De eerste bevindingen van het Human Microbiome Project leidden tot 'honderden vervolgonderzoeken'
Wetenschappers ontwikkelen peptiden die het evenwicht in darmbacteriën herstellen en atherosclerose omkeren
Studie werpt licht op de oorzaken van slopende darmpijn
Wat kan oude uitwerpselen ons vertellen over de evolutie van het menselijke darmmicrobioom?
Zure pH verhoogt SARS-CoV-2-infectie door ACE2-receptor op te reguleren
De aanhoudende pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) die wordt veroorzaakt door een nieuw coronavirus, namelijk, ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), heeft wereld
Studie suggereert verband tussen gebruik van probiotica en "hersennevel"
Een studie uitgevoerd aan het Medical College of Georgia van de Augusta University heeft aangetoond dat de inname van probiotica kan leiden tot een aanzienlijke opeenhoping van bacteriën in de dunne d
Fastfood kan een hoofdschuldige zijn bij tienerdepressie
Waarom is depressie zon groeiend probleem onder tieners in Amerika? Een antwoord is het soort voedsel dat ze eten, volgens een nieuwe studie door onderzoekers van de Universiteit van Alabama in Birmin