forholdet mellom hypoksi-induserbar faktor 1α og p21
WAF1 /CIP1 uttrykk til celle apoptose og klinisk utfall hos pasienter med magekreft
Abstract
Bakgrunn
Hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) spiller en viktig rolle i oksygen homeostase. Ekspresjonen av HIF-1α-induserbare gener som er assosiert med tumorprogresjon. p21 formidler cellesyklus arrest og er en av de nedstrøms gener målrettet av HIF-1.
Pasienter og metoder
Vi undersøkte sammenhengen mellom HIF-1α og p21 uttrykk, apoptose og tumor progresjon ved hjelp av vevsprøver hentet kirurgisk fra 126 pasienter med magekreft. Search Results
Immunhistokjemisk analyse indikerte at tap av p21 uttrykk positivt korrelert med pasientens alder og tumorstørrelse. Lymfeknutemetastaser var signifikant hyppigere i svulster med tap av p21 uttrykk (P = 0,022). HIF-1α-positive /p21-negative tumorer hadde en lavere apoptotisk indeks enn noen andre tumorprøver, og pasienter med HIF-1α-positive /p21-negative tumorer hadde også en betydelig dårligere prognose enn de andre pasientpopulasjoner.
Konklusjon
Disse resultatene tyder på at tapet av HIF-1α-avhengige p21 ekspresjon resulterer i redusert apoptose, økt celleoverlevelse og mer aggressive tumorer.
Bakgrunn
uregulert vekst av kreftceller resulterer ofte i hypoksiske betingelser i tumorcelle massene. Tumor hypoksi resultat av en ubalanse mellom forhøyet forbruk av oksygen i den raskt sykling tumorceller og utilstrekkelig oksygentilførsel på grunn av mangel på et fysiologisk vaskulære nettverk. Flercellede organismer har utviklet seg cellulære mekanismer som medierer en kaskade av adaptive molekylær respons på hypoksi. HIF-1α er en transkripsjonsfaktor som aktiverer genekspresjon ved å binde seg til den hypoksi følsomme element (HRE), et cis-virkende DNA-sekvensen til stede oppstrøms for flere gener viktig for cellulær respons overfor hypoksi [1]. HIF-1a-responsive gener også fungere i glykolysen reaksjonsveien og i hematopoese og angiogenese, gjennom alle celler skaffe en hypoksi-tilpasset metabolisme og økt oksygentilførsel [2]. Nylig har HIF-1α dukket opp som et viktig regulator i veksten av magekreft [3].
Apoptose er en evolusjonært konservert celledød mekanisme som også forekommer i den adaptive cellulær respons overfor hypoksisk stress. Apoptose, også er en viktig beskyttelse mot tumorutvikling. Svulster som viser tap av p53 tumor-suppressor-gen oppviser reduserte nivåer av hypoksi-indusert celledød og en tilhørende økning i tumorprogresjon [4]. Den p21-genet (WAF1) ble klonet i en genetisk skjerm for nedstrøms effektorer av p53 og separat i en skjerm for oppstrøms regulatorer av cyclin-avhengige kinaser (CDK) som CDK-samspill protein (CIP1) [5]. Det p21-promoteren kan transactivated av HIF-1 i en human prostatakreft-cellelinje, noe som indikerer at p21 er et HIF-1 target-genet [6]. Videre ble hypoksi-indusert p21 ekspresjon opphevet i celler som mangler HIF-1α, men ikke i parentale celler [7].
HIF-1α kan derfor fremme både celleoverlevelse og vekst arrest gjennom induksjon av hypoksi-responsive gener. I denne studien undersøkte vi rollen som HIF-1α i hypoksisk kontroll av tumorprogresjon, ved å undersøke forholdet mellom HIF-1α uttrykk, p21 uttrykk og apoptose i vevsprøver fra pasienter med magekreft.
Materialer og metoder
Kliniske materialer
fagene ble 126 pasienter med magekreft (85 menn, 41 kvinner, aldersgruppe, 27 til 88 år, med en gjennomsnittlig alder 65,2 år) som gjennomgikk gastrektomi ved vår institusjon i 1994. Kurativ reseksjon ble utført i 77 pasienter og ikke-kurativ reseksjon i 49. resekterte vevsprøver ble fiksert i en 10% formaldehydoppløsning og innstøpt i parafin. Seksjoner (4 mikrometer tykkelse) ble montert på glassplater. Alle prøvene ble undersøkt makroskopisk og histologisk, basert på kriterier som foreslås av de generelle reglene for ventrikkelkreftstudien [8]. Histologisk undersøkelse ble utført på vevspreparater farget med hematoksylin og eosin (H & E). I denne studien ble svulster delt inn i to histologiske typer: differensiert type, bestående papillær adenokarsinom og rørformet adenokarsinom, og udifferensiert type bestående dårlig differensiert adenokarsinom, signetring cellekreft, og mucinous adenokarsinom. To parafinblokker ble fremstilt for alle pasienter "som inneholder både en tumorvev og tilstøtende normalt vev, og den andre inneholdende tumorvev invaderende til det dypeste nivå av magesekken.
Immunohistokjemisk farging
Alle prøver ble immunfarget med et monoklonalt antistoff mot p21 WAF1 /CIP1 (SX118, fortynnet 1:50, DAKO, Glostrup, Danmark), p53 (Do-7, fortynnet 1:50, DAKO, Glostrup, Danmark), og HIF-1α (NB 100- 105, fortynnet 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) [9] etter deparaffinization og rehydratisering, lysbilder for p21 og p53 immunfarging ble autoklavert i citrat-buffer (0,01 M, pH 6,0) ved 120 ° C i 10 minutt;.. 0,001 M EDTA (pH 8,0) ble anvendt for HIF-1αimmunostaining å lette reaktiviteten av den faste innleiret vev antigen sammen med antistoffet Endogen peroksidase ble blokkert ved å inkubere prøvene i metanol inneholdende 0,3% hydrogenperoksid i 10 minutter prøvene ble deretter skyllet i fosfat-bufret saltvann (PBS) og inkubert med normalt kaninserum i 30 minutter. Seksjoner ble inkubert med de nevnte primære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur, deretter skylt tre ganger i PBS. For deteksjon, brukte vi en Histofine SAB-PO (M) kit (Nichirei Corp., Tokyo, Japan). Snittene ble deretter inkubert med biotinylert kanin-anti-mus immunogloblin (lg, IgG, IgA og IgM, Nicchirei Corp.) i 10 minutter, vasket tre ganger i PBS og ble behandlet med peroksydase-konjugert streptavidin i 10 minutter. Etter en endelig vasking i PBS ble det peroksydase markør påvist ved inkubering av delene i diamino-benzidin tetrahydro-klorid (DAB) i 3 minutter. Nuclear mot farging ble gjort ved hjelp av Mayers hematoksylin løsning. For negative kontroller ble det primære antistoff erstattet med ikke-immune, normalt serum. Automatisert immunhistokjemi ble også utført for å støtte farging beskrevet ovenfor, ved hjelp av en Ventana Discovery ™ System (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA).
Evaluering av farging
p21 protein var til stede i kjernen av tumorceller (figur 1A). I noen tilfeller, normal gastrisk mucosa uttrykte p21-protein, og nukleær farging kunne påvises i overfladiske delene av tumoren, men ikke i de dypere regioner. Vi telles antallet p21-positive celler i hele tumoren delen, og evaluert antall p21-postive celler i henhold til dybden av lagene. Mønsteret av HIF-1α immunofarging i svulsten var nukleær og /eller cytoplasmiske (figur 1B). Nuclear farging av HIF-1α var fraværende i normalt vev unntatt cytoplasma farging. I alle prøvene, p53-protein var udetekterbar i normalt vev, og til stede i kjernen av tumorceller (figur 1C). En celle med kjernefysiske farging for p21, p53 eller HIF-1α (svak eller sterk) ble scoret som positive. Basert på disse kriteriene, ble deler av samlings flekker med den høyeste andelen av p53- og p21-positive nukleær farging innen dyp svulstvev anslått. En tumor ble scoret som p21- eller p53-positiv når mer enn 10% av tumorcellene hadde nukleær farging, i samsvar med tidligere rapporter [10]. HIF-1α uttrykk var ofte tydelig i regionene rundt de invaderende kantene av svulsten, og nekrotiske områder som de nær en dyp sår. Vi scoret tumorer som positive for HIF-1α overekspresjon hvis nukleær farging ble påvist i mer enn 10% av tumorcellene, uavhengig av cytoplasmatisk reaktivitet på ethvert nivå [9, 11]. Figur 1 A) p21 ekspresjon i tilstøtende tumorvev. Nuclear farging er tydelig (original forstørrelse, 100 ×). B) uttrykk HIF-1α i invaderer områder av svulsten. Variasjon i intensitet av kjernefysiske farging er tydelig, ledsaget av cytoplasma farging (original forstørrelse, 100 ×). C) Kjerne farging av p53 i tumorvev (opprinnelig forstørrelse 100 x). D) svulstvev farget med H & E (original forstørrelse, 200 ×). Svulstvev inneholder celler (pil) med karakteristiske trekk ved apoptose
Taksering av apoptose
Vi scoret apoptotiske celler som de som viser de typiske karakteristikkene av apoptose når vevsprøver ble farget med H &. E (figur 1D). Apoptotiske celler ble identifisert på grunnlag av de karakteristiske trekk ved apoptose: komprimering og migrasjon av kjernefysiske og celle skisserer, kjernekraft fragmentering og fremspring, og tilstedeværelse av apoptotiske legemer [12]. Apoptotiske celler ble tellet i vevsprøver fra alle pasienter. Fem høy effekt felt (× 400) med den mest tallrike fordeling av tumorceller ble valgt for teller og mellom 1000 og 1500 kreftceller ble telt. Den apoptotiske indeksen ble deretter beregnet som prosentandelen av apoptotiske celler. Områder med omfattende nekrose ble unngått. En enkelt patolog ved hver institusjon anmeldt lysbildene og telles apoptotiske celler i henhold til kriteriene som er beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
BMDP Statistiske Package program (BMDP, Los Angeles, California) for IBM (Armonk, New York) 3090 stormaskin datamaskiner ble brukt for alle statistisk analyse [13]. Datasett ble sammenlignet med chi-square og Student t-tester ved hjelp av BMDP 4F og 3S-programmer. Den BMDP 1L programmet ble brukt til å analysere overlevelse ved bruk av Kaplan-Meier metoden. Statistisk signifikans ble satt til P < 0,05 nivå.
Resultater
p21 uttrykk og klinisk-patologisk faktorer
Tabell 1 viser korrelasjonen av uttrykket eller tap av uttrykk av p21 med flere klinisk-patologiske faktorer. Overall, 71 (56,3%) av de 126 vevsprøver var negative for p21 uttrykk. I svulster fra pasienter under 65 år, tap av p21 uttrykk var betydelig hyppigere enn i svulster fra pasienter over 65 år (p = 0,026). Tap av p21-ekspresjon ble betydelig hyppigere i tumorer med stor størrelse (P = 0,03), sammenlignet med mindre svulster. Med hensyn til metastaser, tumorer med tap av p21 ekspresjonen en tendens til å vise økt hyppighet av lymfatisk invasjon (p = 0,089, tabell 1) og en betydelig høyere frekvens av lymfeknutemetastaser (p = 0,022, tabell 2) enn p21-uttrykkende tumorer. Tabell 3 viser forholdet mellom p21 ekspresjonen, og ekspresjon av p53 og HIF-1α. Overekspresjon av p53 ble påvist i 57 (45,2%) svulster, og HIF-1α overekspresjon ble påvist hos 49 (38,9%) svulster. Immunhistokjemisk analyse viste ingen sammenheng mellom p21 uttrykk og p53 uttrykk, eller p21 og HIF-1α overekspresjon (P = 0,444 og 0,609, henholdsvis) .table 1 Forholdet mellom p21 uttrykk og klinisk-patologisk faktorer
Faktorer
p21 (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
P-verdi
Alder (år)
< 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Kjønn
Mann fra 38
47
0,731
Kvinne
17
24
Dybde invasjon
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
Histologi
Differensiert
35
39
0,325
Undifferentiated
20
32
Tumor størrelse
< 3 cm
23
22
0,03
3 cm ≦
22
49
lymfatisk invasjon
Negativ
26
23
0,089
Positiv
29
48
venøs invasjon
Negativ
42
57
0,595
Positive
13
14
Tabell 2 Forholdet mellom p21 uttrykk og metastase
p21-negative tumor (%)
P-verdi
lymfeknutemetastaser
negativ
36/75 (48,0)
0,022
Positive
35/51 (68,6)
levermetastaser
Negativ
68/122 (55,7)
0,447
Positiv
3/4 (75,0)
Peritoneal formidling
Negativ
62/112 (55,4)
0,525
Positive
9/14 (64,3)
Table 3 Forholdet mellom p21 og p53, og HIF-1α uttrykk
|
|
p21
|
|
|
Positiv (n = 55)
Negative (n = 71)
P-verdi
p53
Positiv (n = 57)
27
30
0,444
Negative (n = 69)
28
41
HIF-1α
Positive (n = 49)
20
29
0,608
Negative (n = 77)
35
42
apoptose forbundet med HIF-1α og p21 uttrykk
bety apoptotiske indeks over alle 126 svulster var 8,95 ± 6,24 (range 0-37). Tumorer ble delt inn i fire forskjellige populasjoner basert på HIF-1α og p21 ekspresjon og middelverdien apoptotiske indeks for hver gruppe ble beregnet (tabell 4). Svulster som var HIF-1α-positive /p21-negative hadde lavest apoptotiske indeksen. Det var en signifikant forskjell mellom svulster som var HIF-1α-positive /p21-negative, og de som var HIF-1α-negativ /p21-negative (P = 0,037) .table 4 Apoptose forbundet med HIF-1α og p21 uttrykk
Factor
apoptotiske indeksen
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9.6 ± 7.33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, *** product: * P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (gjennomsnitt ± SD)
klinisk utfall assosiert med HIF-1α og p21 uttrykk
gjennomsnittlig oppfølgingstid tid til pasientene var 55 ± 28 (± 1 SD) måneder (range, 1-82 måneder). Den 5 års overlevelse av pasienter med p21-negative tumorer var lavere enn den til p21-positive tumorer, men forskjellen var ikke statistisk signifikant (data ikke vist). De 126 pasientene ble igjen delt inn i fire populasjoner basert på HIF-1α uttrykk og p21 uttrykk, og vi undersøkt forholdet mellom HIF-1α uttrykk og prognose i p21-positive eller -negative tumorprøver. Tabell 5 viser 1-, 3- og 5-års overlevelse for pasienter og sammenhengen med HIF-1α og p21 uttrykk. Pasienter med HIF-1α-positive /p21-negative svulster hadde signifikant dårligere prognose enn de andre studiepopulasjoner. Spesielt pasienter med HIF-1a-positive tumorer, de som hadde mistet ekspresjon av p21 hadde en vesentlig dårligere prognose enn p21 ekspresjon (P = 0,042) .table 5 års overlevelse forbundet med HIF-1α og p21 ekspresjon
Factor
1-års overlevelse
3-års overlevelse
5-års overlevelse
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, *** product: * P = 0,042 ** P = 0.003 *** P = 0,003 (%)
diskusjon
Våre funn viser at tap av p21 uttrykk positivt korrelert med yngre pasientens alder, og større svulst. Videre har mange pasienter med p21-negative tumorer hadde lymfeknutemetastaser i forhold til de med p21-positive tumorer, ved en vesentlig høyere frekvens. Disse resultatene tyder på at tapet av uttrykket av p21 er involvert i prosesser av tumorvekst og metastasering, i samråd med tidligere rapporter [14, 15].
HIF-1α overekspresjon har vært knyttet til en dårlig klinisk utfall i enkelte typer av kreft hos mennesker [16-18]. Imidlertid har enkelte rapporter antydet at svulsten uttrykk for HIF-1α ikke gir en overlevelse fordel [18, 19]. Selv om de fleste av HIF-1 målgener kan fremme tumorvekst gjennom økt uttrykk, HIF-1-aktiverte gener, inkludert p21, har også potensial til å hemme vekst under hypoksiske forhold [20, 21]. Ektopisk ekspresjon av HIF-1α i endotelceller resulterte i opp-regulering av p21, reduksjon av CDK aktivitet, cellesyklus-stans i G 0 /G en sjekkpunktet, og påfølgende apoptose [22]. I denne studien fant vi at apoptotiske celler var underrepresentert i HIF-1α-positive /p21-negative svulster. Under hypoksiske forhold kan HIF-1α hemme tumor proliferasjon gjennom p21-mediert cellesykluskontroll, noe som resulterer i valg av celler som er resistente mot apoptose og anti-kreftbehandling. De fleste tumorceller beholder evnen til å gjennomgå apoptose i respons til hypoksisk spenning [23]. Når den apoptotiske respons på hypoksi er tapt, kan nye tumorceller være mer motstandsdyktig mot behandling, og kan derfor bidra til påfølgende tumor tilbakefall [24]. Mekanismer som hypoksi selekterer for celler som er resistente mot apoptose er uklart, men involvering av p53 mutasjon har blitt undersøkt [25]. Rapporter har vist at hypoksi inhiberer cellevekst, og kan forårsake apoptose via en p53-avhengig reaksjonsvei [26]. HIF-1α er også blitt vist å fremme p53-avhengig apoptose [27], men andre studier har vist at vekststans som følge av hypoksi er p53-uavhengig [26]. I denne studien fant vi ingen bevis for en sammenheng mellom p53 og p21 uttrykk. Vi vurderte også forholdet mellom HIF-1α og p53 uttrykk til celle apoptose, men fant ingen statistisk signifikant sammenheng mellom HIF-1α og p53 uttrykk (data ikke vist). Vår tidligere studie viste at kombinasjonen av HIF-1α overekspresjon med ikke-funksjonelt p53 hadde tendens til å indikere en sturen prognose [28].
Hos pasienter med HIF-1a-positive tumorer, korrelasjonen mellom tap av p21-ekspresjon og dårlig klinisk kan utfallet reflektere en fysiologisk forskjell i evnen til p21-positiv i forhold til p21-negative tumorer for å overleve under hypoksiske betingelser. Selv om HIF-1α avhengig transkripsjonen aktivering har vært forbundet med tumorvekst, tyder våre resultater at samtidig ekspresjon av p21 og HIF-1α kan hemme tumorvekst i en viss grad.
Molekylære mekanismen som ligger til grunn HIF-1α ekspresjon i krefttegnings bestemte oppmerksomhet [29]. Den utbredte forekomsten av oppregulert HIF-1α i vanlige krefttyper og involvering av hypoksi trasé i tumor angiogenese sikkert argumentere for sin betydning og stort bruksområde. Kjemoterapi og stråling som er rettet mot HIF-1α kan være effektive og realistiske, og faktisk, har denne tilnærmingen blitt rapportert [30]. Imidlertid er de kvalitative og kvantitative forskjeller i hypoksisk responsen av forskjellige celletyper som ikke er godt kjent [31]. Videre forskning er derfor nødvendig for å evaluere effekten av HIF-1-mediert trasé på celleproliferasjon og apoptose i humane kreftformer i henhold hypoksiske mikromiljøer.
I denne studien, viste vi at HIF-1α overekspresjon og tap av p21expression i mage kreft korrelert med dårlig pasient prognose, sammenlignet med svulster som beholdt p21 uttrykk, eller hadde mistet HIF-1α uttrykk. En mulig mekanisme for dette ble foreslått av funn at apoptotiske celler ble underrepresentert i HIF-1α-positive /p21-negative svulster. Aggressive kreftsvulster som ikke klarer å indusere p21 i en HIF-1α - avhengig måte kan ha økt celleoverlevelse uten apoptose, og bidra til en dårlig prognose for pasienter
Funding støtte
Kirurgisk avdeling og Science, Graduate School of Medical. Science, Kyushu-universitetet, Fukuoka, Japan.
Erklæringer
takk
forfatterne takker K. Miyamoto for teknisk assistanse.
Forfatter opprinnelige legges filer for Images Nedenfor er linker til forfatterne 'opprinnelige innsendt filer for bilder. 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 4 Interessekonflikt
forfatteren (e ) erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
| 
Forskere utvikler 3D -trykt pille som prøver bakterier som finnes i tarmen
Menneskelige koronavirus trenger organiske materialer for å overføre effektivt mellom overflater
Rotavirus spiller en rolle i utviklingen av type 1 diabetes
Plast som nå ofte finnes i avføring fra mennesker
Lite bevis for mRNA COVID-19 vaksineassosiert trombocytopeni,
Pasienter med IBS kan dra fordel av vitamin D -tilskudd,
At Pepto sannsynligvis ikke vil hjelpe såret ditt
Et magesår er et sår eller en lesjon som utvikler seg i slimhinnen i spiserøret, mage, eller tolvfingertarmen. Ikke lenge siden, det ble antatt at sår ble forårsaket av at en person var stresset eller
Hvis du er over 50,
Det er på tide med en koloskopi Folk utsetter å gjøre visse ting - rydder ut i garasjen, male om stua, vaske vinduer ... og få en koloskopi. Men en koloskopi er sannsynligvis det beste enkeltalternat
Tarmmikrober i veps hjelper til med å overvinne plantevernmidler
En spennende studie publisert i tidsskriftet februar 2020 Cellvert og mikrobe rapporterer at når veps blir utsatt for atrazin, et vanlig brukt plantevernmiddel, tarmmikrobiomet gjennomgår endringer