Forholdet af hypoxi-inducerbare faktor 1α og p21
WAF1 /CIP1 udtryk for celle apoptose og klinisk resultat hos patienter med mavekræft
Abstrakt
Baggrund
Hypoxi-inducerbare faktor-1α (HIF-1α) spiller en væsentlig rolle i ilt homøostase. Ekspressionen af HIF-1α-inducerbare gener er associeret med tumorudvikling. p21 medierer cellecyklusstandsning og er en af de nedstrøms gener er mål for HIF-1.
Patienter og metoder
Vi undersøgte forholdet mellem HIF-1α og p21-ekspression, apoptose og tumorprogression hjælp vævsprøver opnået kirurgisk fra 126 patienter med mavekræft.
Resultater
immunhistokemisk analyse viste, at tab af p21-ekspression korrelerede positivt med patientens alder og tumorstørrelse. Lymfeknudemetastase var signifikant hyppigere hos tumorer med tab af p21-ekspression (P = 0,022). HIF-1α-positive /p21-negative tumorer havde en lavere apoptotisk indeks end andre tumorprøver, og patienter med HIF-1α-positive /p21-negative tumorer havde også en signifikant ringere prognose end de andre patientpopulationer.
Konklusion
Disse resultater antyder, at tab af HIF-1α-afhængige p21 ekspression resulterer i nedsat apoptose, forøget celleoverlevelse og mere aggressive tumorer.
Baggrund
ureguleret vækst af cancerceller resulterer ofte i hypoxiske betingelser i tumorcelle masser. Tumor hypoxi resultater fra en ubalance mellem forhøjet forbrug af ilt i de hastigt cykle tumorceller og utilstrækkelig iltforsyning på grund af manglen på en fysiologisk vaskulære netværk. Flercellede organismer har udviklet cellulære mekanismer, der medierer en kaskade af adaptive molekylære reaktioner på hypoksi. HIF-1α er en transkriptionsfaktor, der aktiverer genekspression ved binding til hypoxi responsive element (HRE), en cis-virkende DNA sekvens til stede opstrøms for adskillige gener afgørende for cellulære respons på hypoxi [1]. HIF-1a-responsive gener også fungere i glycolyse pathway og i hæmatopoiese og angiogenese, gennem alle celler erhverver en hypoxi-tilpasset metabolisme og øget iltforsyning [2]. For nylig er HIF-1α opstået som en central regulator i væksten af gastrisk cancer [3].
Apoptose er en evolutionært bevaret celledød mekanisme, der også forekommer i den adaptive cellulære respons på hypoxisk stress. Apoptose, også er en vigtig sikkerhedsforanstaltning mod tumor udvikling. Tumorer, der udviser tab af p53 tumor-suppressor-gen udviser reducerede niveauer af hypoxi-induceret celledød og en tilhørende stigning i tumorudvikling [4]. P21-genet (WAF1) blev klonet i en genetisk screening for nedstrømseffektorer af p53 og separat i en screening for opstrøms regulatorer af cyclinafhængige kinaser (CDK'er) som CDK-interagerende protein (CIP1) [5]. P21-promotoren kan transaktiveres ved HIF-1 i en human prostatacancer-cellelinie, hvilket indikerer, at p21 er et HIF-1 målgen [6]. Endvidere blev hypoxi-induceret p21-ekspression ophævet i celler, der mangler HIF-1α, men ikke i parentale celler [7].
HIF-1α kan derfor fremme både celleoverlevelse og vækststandsning ved induktion af hypoxia-responsive gener. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi rollen af HIF-1α i hypoxisk kontrol for tumorprogression, ved at undersøge forholdet mellem HIF-1α ekspression, p21 ekspression og apoptose i vævsprøver fra patienter med gastrisk cancer. Salg Materialer og metoder
Kliniske materialer
emner blev 126 patienter med mavekræft (85 mænd, 41 kvinder; aldersgruppe, 27 til 88 år, betyder alder, 65.2 år), som gennemgik gastrektomi på vores institution i 1994. Helbredende resektion blev udført i 77 patienter og ikke-helbredende resektion i 49. resektion vævsprøver blev fikseret i en 10% formaldehydopløsning og indlejret i paraffin. Sektioner (4 um tykkelse) blev monteret på objektglas. Alle prøver blev undersøgt makroskopisk og histologisk, ud fra kriterier, som de generelle regler, der foreslås for Gastric Cancer Study [8]. Histologisk undersøgelse blev udført på vævspræparater farvet med hematoxylin og eosin (H &E). I den aktuelle undersøgelse blev tumorer inddelt i to histologiske typer: differentieret type, der omfatter papillær adenocarcinom og tubulær adenocarcinom, og udifferentieret type, der omfatter dårligt differentieret adenocarcinom, signetring cellecarcinom, og mucinøs adenocarcinom. To paraffinblokke blev fremstillet til alle patienter "one indeholdende både tumorvæv og tilstødende normalt væv, og det andet indeholder tumorvæv invaderende til den dybeste niveau af mavevæggen.
Immunohistokemisk farvning
Alle prøver blev immunfarvet med et monoklonalt antistof mod p21 WAF1 /CIP1 (SX118, fortyndet 1:50, DAKO, Glostrup, Danmark), p53 (Gør-7, fortyndet 1:50, DAKO, Glostrup, Danmark), og HIF-1α (NB 100- 105, fortyndet 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) [9] efter afparaffinering og rehydrering, dias for p21 og p53 immunfarvning blev autoklaveret i citratpuffer (0,01 M, pH 6,0) ved 120 ° C i 10 minutter,.. 0,001 M EDTA (pH 8,0) blev anvendt til HIF-1αimmunostaining at lette reaktiviteten af den faste indlejret væv antigen med antistoffet Endogen peroxidase blev blokeret ved at inkubere prøverne i methanol indeholdende 0,3% hydrogenperoxid i 10 minutter prøverne blev derefter skyllet i phosphatpufret saltvand (PBS) og inkuberet med normalt kaninserum i 30 minutter. Snit blev inkuberet med de førnævnte primære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur, derefter skyllet tre gange i PBS. For detektion, brugte vi en Histofine SAB-PO (M) kit (Nichirei Corp., Tokyo, Japan). Snittene blev derefter inkuberet med biotinyleret kanin-anti-muse immunogloblin (Ig, IgG, IgA og IgM, Nicchirei Corp) i 10 minutter, vasket tre gange i PBS og behandlet med peroxidasekonjugeret streptavidin i 10 minutter. Efter en afsluttende vask i PBS blev peroxidase mærket detekteret ved inkubering af sektionerne i diamino-benzidin tetrahydro-chlorid (DAB) i 3 minutter. Nuklear counter-farvning blev udført under anvendelse Mayers hematoxylin-opløsning. For negative kontroller blev primære antistoffer erstattet med ikke-immunt, normalt serum. Automatiseret immunohistokemi blev også udført for at understøtte immunfarvning ovenfor beskrevne, ved anvendelse af en Ventana Discovery ™ System (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA).
Evaluering af immunofarvning
p21-protein var til stede i kerner af tumorceller (figur 1A). I nogle tilfælde, normal gastrisk mucosa udtrykt p21-protein, og nuklear farvning kunne påvises i de overfladiske når i tumoren, men ikke i de dybere områder. Vi tælles antallet af p21-positive celler i hele tumoren sektionen, og evaluerede antallet af p21-postive celler ifølge Lagene. Mønsteret af HIF-1α immunofarvning i tumoren var nukleare og /eller cytoplasmatisk (figur 1B). Nuklear farvning af HIF-1α var fraværende i normalt væv eksklusive cytoplasmatisk farvning. I alle prøver, p53-protein kunne ikke påvises i normale væv, og til stede i kernerne i tumorceller (fig 1C). En celle med nukleare immunfarvning for p21, p53 eller HIF-1α (svag eller stærk) blev scoret som positive. Baseret på disse kriterier, blev områder af fokal farvning med den højeste procentdel af p53 og p21-positive nuklear farvning inden dyb tumorvæv estimeret. En tumor blev scoret som p21 eller p53-positiv, når mere end 10% af tumorcellerne havde kernefarvning, i overensstemmelse med tidligere rapporter [10]. HIF-1α-ekspression var ofte tydeligt i regionerne omkring de invaderende kanter af tumoren, og nekrotiske områder som dem tæt på en dyb ulcus. Vi scorede tumorer som positive for HIF-1α overekspression hvis nuklear farvning blev detekteret i mere end 10% af tumorcellerne, uanset cytoplasmatisk reaktivitet på ethvert niveau [9, 11]. Figur 1 A) p21-ekspression i tilstødende tumorvæv. Nuklear immunfarvning er tydelig (oprindelig forstørrelse, 100 ×). B) HIF-1α ekspression i invaderende regioner af tumoren. Variation i intensitet af nuklear immunfarvning er indlysende, ledsaget af cytoplasmatisk farvning (original forstørrelse, 100 ×). C) Nuklear immunfarvning af p53 i tumorvæv (original forstørrelse, 100 ×). D) Tumor væv farvet med H &E (original forstørrelse, 200 ×). Tumorvæv indeholder celler (pil) med karakteristiske træk ved apoptose
Vurdering for apoptose
Vi scorede apoptotiske celler som dem, der viser de typiske kendetegn for apoptose, når vævsprøver blev farvet med H &. E (Figur 1D). Apoptotiske celler blev identificeret på grundlag af de karakteristiske træk ved apoptose: komprimering og migration af nukleare og celle skitserer, nuklear fragmentering og forhøjning, og tilstedeværelsen af apoptotiske organer [12]. Apoptotiske celler blev talt i vævsprøver fra alle patienter. Fem high-power felter (× 400) med den mest udbredte fordeling af tumorceller blev selekteret for tællinger og mellem 1000 og 1500-tumorceller blev talt. Den apoptotiske indeks blev derefter beregnet som procentdelen af apoptotiske celler. Områder med omfattende nekrose blev undgået. En enkelt patolog på hver institution revideret dias og tælles apoptotiske celler i henhold til kriterierne beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
BMDP statistiske Package-programmet (BMDP, Los Angeles, Californien) til IBM (Armonk, NY) 3090 mainframe computere blev anvendt til alle statistiske analyser [13]. Datasæt blev sammenlignet ved chi-square og Students t-test ved hjælp af BMDP 4F og 3S programmer. Den BMDP 1L-programmet blev anvendt til at analysere overlevelsestid under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Statistisk signifikans blev sat til P < 0,05 niveau.
Resultater
p21-ekspression og klinisk-patologisk faktorer
Tabel 1 viser korrelationen af udtrykket eller tab af ekspressionen af p21 med flere klinisk-patologiske faktorer. Samlet, 71 (56,3%) af de 126 tumorprøver var negative for p21-ekspression. I tumorer fra patienter under 65 år, tab af p21-ekspression var signifikant hyppigere end hos tumorer fra patienter over 65 år (P = 0,026). Tab af p21-ekspression var signifikant hyppigere hos tumorer med stor størrelse (P = 0,03), sammenlignet med mindre tumorer. Med hensyn til metastaser, tumorer med tab af p21-ekspression en tendens til at vise forøget frekvens af lymfatisk invasion (P = 0,089, tabel 1) og en signifikant højere frekvens af lymfeknudemetastase (P = 0,022, tabel 2) end p21-udtrykkende tumorer. Tabel 3 viser forholdet mellem p21-ekspression, og ekspressionen af p53 og HIF-1α. Overekspression af p53 blev påvist i 57 (45,2%) tumorer, og HIF-1α overekspression blev påvist i 49 (38,9%) tumorer. Immunhistokemisk analyse afslørede ikke en sammenhæng mellem p21-ekspression og p53 udtryk, eller p21 og HIF-1α overekspression (P = 0,444 og 0,609 henholdsvis) .table 1 Forholdet mellem p21-ekspression og klinisk-patologisk faktorer
Faktorer
p21 (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
P-værdi
Alder (år)
< 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Køn
Mand
38
47
0,731
Female
17
24
dybde invasion
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
histologi
Differentieret
35
39
0,325
Udifferentieret
20
32
Tumor størrelse
< 3 cm
23
22
0.03
3 cm ≦
22
49
lymfatisk invasion
Negativ
26
23
0,089
Positiv
29
48
Venøs invasion
Negativ
42
57
0,595
Positiv
13
14
tabel 2 Forholdet mellem p21-ekspression og metastase
p21-negativ tumor (%)
P-værdi
lymfeknudemetastase
negativ
36/75 (48,0)
0,022
Positiv
35/51 (68,6)
levermetastaser
Negativ
68/122 (55,7)
0,447
Positiv
3/4 (75,0)
Peritoneal formidling
Negative
62/112 (55,4)
0,525
Positiv
9/14 (64,3)
Table 3 Forholdet mellem p21 og p53, og HIF-1α udtryk
|
|
p21
|
|
|
Positiv (n = 55)
Negativ (n = 71)
P-værdi
p53
Positiv (n = 57)
27
30
0,444
Negativ (n = 69)
28
41
HIF-1α
Positiv (n = 49)
20
29
0,608
Negativ (n = 77)
35
42
Apoptose forbundet med HIF-1α og p21 udtryk
betyde apoptotiske indeks over alle 126 tumorer var 8,95 ± 6,24 (interval 0-37). Tumorer blev inddelt i fire forskellige populationer baseret på HIF-1α og p21-ekspression, og den gennemsnitlige apoptotiske indeks for hver gruppe blev beregnet (tabel 4). Tumorer, der var HIF-1α-positive /p21-negative havde den laveste apoptotiske indeks. Der var en signifikant forskel mellem tumorer, der var HIF-1α-positive /p21-negative, og de, der var HIF-1α-negativ /p21-negative (P = 0,037) .table 4 Apoptose er forbundet med HIF-1α og p21-ekspression
Factor
Apoptotisk indeks
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9,6 ± 7,33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (gennemsnit ± SD)
Klinisk resultat i forbindelse med HIF-1α og p21 udtryk
gennemsnitlige opfølgningstid for patienterne var 55 ± 28 (± 1 SD) måneder (interval, 1-82 måneder). 5-års overlevelsesraten for patienter med p21-negative tumorer var lavere end den for p21-positive tumorer, men forskellen var ikke statistisk signifikant (data ikke vist). De 126 patienter blev igen opdelt i fire bestande baseret på HIF-1α udtryk og p21 udtryk, og vi undersøgte sammenhængen mellem HIF-1α udtryk og prognose i p21-positiv eller ekskluderet tumorprøver. Tabel 5 viser 1-, 3- og 5-årige overlevelsesrater for patienter og sammenhængen med HIF-1α og p21 udtryk. Patienter med HIF-1α-positive /p21-negative tumorer havde en signifikant dårligere prognose end de andre undersøgelse befolkninger. Især hos patienter med HIF-1a-positive tumorer, dem, der havde mistet udtryk for p21 havde en signifikant dårligere prognose end dem med p21-ekspression (P = 0,042) .table 5 års overlevelse i forbindelse med HIF-1α og p21 udtryk
Factor
1-års overlevelse
3-års overlevelse
5-års overlevelse
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0,003 *** P = 0,003 (%)
diskussion
Vores resultater viser, at tab af p21-ekspression korrelerede positivt med yngre patientens alder, og større tumor. Desuden har mange patienter med p21-negative tumorer havde lymfeknudemetastaser sammenlignet med dem med p21-positive tumorer, til en betydeligt højere frekvens. Disse resultater antyder, at tabet af ekspression af p21 er involveret i de processer af tumorvækst og metastase, i overensstemmelse med tidligere rapporter [14, 15].
HIF-1α overekspression er blevet forbundet med en dårlig klinisk resultat i nogle typer af humane cancere [16-18]. Imidlertid har nogle rapporter foreslået, at tumor udtryk for HIF-1α ikke giver en overlevelse fordel [18, 19]. Selv om de fleste af de HIF-1 målgener kan fremme tumorvækst via deres forbedrede udtryk, HIF-1-aktiverede gener, herunder p21, har også potentiale til at hæmme væksten under hypoxiske betingelser [20, 21]. Ektopisk ekspression af HIF-1α i endotelceller resulterede i opregulering af p21, reduktion af CDK-aktiviteter, cellecyklusstop på G 0 /G 1 check point, og efterfølgende apoptose [22]. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi, at apoptotiske celler var underrepræsenterede i HIF-1α-positive /p21-negative tumorer. Under hypoxiske betingelser, kan HIF-1α hæmme tumor proliferation gennem p21-medieret cellecykluskontrol, som fører til udvælgelse af celler, der er resistente over for apoptose og anti-cancer behandlinger. De fleste tumorceller bevarer evnen til at undergå apoptose som reaktion på hypoxisk stress [23]. Når den apoptotiske respons på hypoxi ryger, kan nye tumorceller være mere resistente over for behandling og kan derfor bidrage til efterfølgende tumortilbagefald [24]. De mekanismer, som hypoxi udvælger for celler er resistente over for apoptose er uklar, men er blevet undersøgt inddragelse af p53 mutation [25]. Rapporter har vist, at hypoxi inhiberer cellevækst, og kan forårsage apoptose gennem en p53-afhængige vej [26]. HIF-1α har også vist sig at fremme p53-afhængig apoptose [27], men andre undersøgelser har vist, at vækststandsning som respons på hypoxi er p53-uafhængig [26]. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi ingen tegn på en sammenhæng mellem p53 og p21 udtryk. Vi evaluerede også forholdet mellem HIF-1α og p53-ekspression til celle apoptose, men fandt ingen statistisk signifikans mellem HIF-1α og p53-ekspression (data ikke vist). Vores tidligere undersøgelse viste, at kombinationen af HIF-1α overekspression med ikke-funktionelt p53 havde tendens til at indikere en trist prognose [28].
Hos patienter med HIF-1a-positive tumorer, vises sammenhængen mellem tab af p21-ekspression og dårligt klinisk kan udfald afspejle en fysiologisk forskel i evnen af p21-positive versus p21-negative tumorer at overleve under hypoxiske betingelser. Selvom HIF-1α-afhængig transkriptionel aktivering er blevet forbundet med tumorvækst, vores resultater tyder på, at samtidig ekspression af p21 og HIF-1α kan forsinke tumorvækst i nogen grad.
Den molekylære mekanisme bag HIF-1α ekspression i warrants cancer særlige opmærksomhed [29]. Den udbredte forekomst af opreguleret HIF-1α i almindelige kræftformer og inddragelse af hypoxi veje i tumor angiogenese sikkert argumentere for sin betydning og bred anvendelighed. Kemoterapi og stråling, der målretter HIF-1α kan være effektivt og realistisk, og faktisk er blevet rapporteret denne fremgangsmåde [30]. Imidlertid er de kvalitative og kvantitative forskelle i den hypoxiske respons forskellige celletyper ikke kendt [31]. Yderligere forskning er derfor nødvendig for at vurdere virkningerne af HIF-1-medierede veje på celledeling og apoptose i humane kræftformer under hypoxiske mikromiljøer.
I den foreliggende undersøgelse, viste vi, at HIF-1α overekspression og tab af p21expression i gastrisk kræft korreleret med dårlig patient prognose sammenlignet med tumorer, der tilbageholdt p21 udtryk, eller havde mistet HIF-1α udtryk. En potentiel mekanisme til dette blev foreslået af den konstatering, at apoptotiske celler blev underrepræsenterede i HIF-1α-positive /p21-negative tumorer. Aggressive tumorer, der undlader at fremkalde p21 i en HIF-1α - afhængig måde kan have øget celle overlevelse uden apoptose, og bidrage til en dårlig prognose for patienter
Funding støtte
Institut for Kirurgi og videnskab, Graduate School of Medical. Videnskab, Kyushu University, Fukuoka, Japan.
erklæringer
tak
forfatterne takker K. Miyamoto for teknisk assistance.
forfatternes oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatterne 'original indsendt filer til billeder. 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 4 Interessekonflikter
forfatter (e ) erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
| 
Flåter bærer nu flere sygdomme,
Stærkt mikrobiom i det tidlige liv forbundet med færre luftvejsinfektioner
Det vaginale mikrobiom kan påvirke effekten af HIV -forebyggende behandling
Syre-pH forbedrer SARS-CoV-2-infektionen ved at opregulere ACE2-receptoren
Plast findes nu almindeligt i afføring hos mennesker
IBD langt mere almindeligt end forventet,
Probiotika kan hjælpe med at bremse underernæring i løbet af de næste to årtier,
siger Bill Gates Probiotika eller gode bakterier har vist løfte om potentialet for at opretholde en sund tarm. Mange undersøgelser har givet bevis på sundhedsmæssige fordele ved probiotika. Nu, den po
Pankreatitis
Bugspytkirtlen er lang, flad kirtel, der er bag maven i den øvre del af maven. Dets hovedopgave er at producere enzymer, der hjælper i en persons fordøjelse og hormoner, der hjælper med regelmæssigt b
Metformin kan hjælpe utæt tarm
Et team af forskere fra University of California, San Diego, har med succes brugt tarmorganoider i deres laboratorium til at vise virkningerne af medicin til behandling af tilstande som utæt tarm. Und