rapporto di ipossia-inducibile fattore 1α e p21
espressione WAF1 /CIP1 per apoptosi delle cellule e l'outcome clinico nei pazienti con carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
ipossia-inducibile fattore-1α (HIF-1α) svolge un ruolo essenziale nella omeostasi dell'ossigeno. L'espressione dei geni HIF-1α-inducibile è associata a progressione del tumore. p21 media arresto del ciclo cellulare ed è uno dei geni a valle di mira da HIF-1.
Pazienti e metodi
abbiamo esaminato la relazione tra HIF-1α e di espressione di p21, l'apoptosi e la progressione del tumore utilizzando campioni di tessuto ottenuti chirurgicamente da 126 pazienti con cancro gastrico.
Risultati
L'analisi immunoistochimica hanno indicato che la perdita di espressione di p21 positivamente correlata con l'età del paziente e le dimensioni del tumore. Metastasi linfonodali è risultata significativamente più frequente nei tumori con perdita di espressione di p21 (P = 0.022). tumori HIF-1α-positivo /p21-negativi avuto un indice apoptotico più basso rispetto a qualsiasi altri campioni di tumore, e pazienti con tumori HIF-1α-positivo /p21-negativo ha avuto anche una prognosi significativamente peggiore rispetto alle altre popolazioni di pazienti.
Conclusione
Questi risultati suggeriscono che la perdita di HIF-1α-dipendenti risultati di espressione di p21 in diminuzione apoptosi, ha aumentato la sopravvivenza cellulare e tumori più aggressivi.
Sfondo
La crescita non regolamentata delle cellule tumorali si traduce spesso in condizioni di ipossia in cellule tumorali masse. Risultati tumore ipossia da uno squilibrio tra elevato consumo di ossigeno nelle cellule tumorali ciclo rapido e insufficiente apporto di ossigeno a causa della mancanza di una rete vascolare fisiologico. organismi multicellulari sono evoluti meccanismi cellulari che mediano una cascata di reazioni molecolari di adattamento all'ipossia. HIF-1α è un fattore di trascrizione che attiva l'espressione genica legandosi con l'elemento sensibile ipossia (HRE), un cis-acting sequenza di DNA presente a monte di diversi geni essenziali per la risposta cellulare all'ipossia [1]. geni HIF-1α-responsive funzionano anche nella via glicolisi e in ematopoiesi e angiogenesi, attraverso i quali le cellule acquisiscono un metabolismo ipossia adattati e maggiore apporto di ossigeno [2]. Recentemente, HIF-1α è emerso come un regolatore chiave nella crescita del cancro gastrico [3].
L'apoptosi è un meccanismo di morte cellulare evolutivamente conservato che si verifica anche nella risposta cellulare adattativa allo stress ipossico. L'apoptosi, anche, è un'importante garanzia contro lo sviluppo del tumore. I tumori che presentano perdita della p53 tumore suppressor gene presentano livelli ridotti di morte cellulare indotta da ipossia e un aumento associato nella progressione tumorale [4]. Il gene p21 (WAF1) è stato clonato in uno screening genetico per effettori a valle di p53 e separatamente in uno schermo per i regolatori a monte della chinasi ciclina-dipendenti (CDK) come proteina CDK interagenti (CIP1) [5]. Il promotore p21 può essere transactivated da HIF-1 in una linea di cellule di cancro alla prostata umano, che indica che p21 è un gene bersaglio di HIF-1 [6]. Inoltre, l'espressione di p21 indotta da ipossia è stata abrogata in cellule prive di HIF-1α, ma non nelle cellule parentali [7].
HIF-1α possono quindi promuovere sia la sopravvivenza delle cellule e arresto della crescita attraverso l'induzione di geni ipossia-reattiva. Nel presente studio, abbiamo esaminato il ruolo di HIF-1α nel controllo ipossica della progressione del tumore, esaminando il rapporto tra l'espressione di HIF-1α, espressione di p21 e apoptosi in campioni di tessuto da pazienti con cancro gastrico.
Materiali e metodi
I materiali clinici
soggetti erano 126 pazienti con cancro gastrico (85 uomini, 41 donne, di età compresa, 27 e 88 anni, età media, 65.2 anni), sottoposti a gastrectomia presso il nostro istituto nel 1994. resezione curativa è stata eseguita in 77 i pazienti e la resezione non curativa a 49. campioni di tessuto asportato sono state fissate in una soluzione di formaldeide al 10% e inclusi in paraffina. Sezioni (4 micron di spessore) sono stati montati su vetrini. Tutti i campioni sono stati esaminati a livello macroscopico e istologico, in base a criteri proposti dal Regolamento Generale per il cancro gastrico studio [8]. L'esame istologico è stato effettuato su preparazioni di tessuto colorate con ematossilina ed eosina (H & E). Nel corso di studio, i tumori sono stati divisi in due tipi istologici: tipo differenziato, che comprende papillare adenocarcinoma e adenocarcinoma tubolare, e il tipo di indifferenziata, che comprende adenocarcinoma scarsamente differenziato, carcinoma a cellule anello con sigillo, e adenocarcinoma mucinoso. Due blocchi di paraffina sono stati preparati per tutti i pazienti "uno che contengono sia tessuto tumorale e tessuto normale adiacente, e l'altra contenente tessuto tumorale che invade al livello più profondo della parete dello stomaco.
Colorazione immunoistochimica
Tutti i campioni sono stati immunostained con un anticorpo monoclonale anticorpo contro p21 WAF1 /CIP1 (SX118, diluito 1:50 DAKO, Glostrup, Danimarca), p53 (Do-7, diluita 1:50 DAKO, Glostrup, Danimarca), e HIF-1α (NB 100- 105, diluito 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) [9] Dopo deparaffinizzazione e reidratazione, le diapositive di p21 e p53 immunostaining stati autoclavato a tampone citrato (0,01 M, pH 6,0) a 120 ° C per 10 minuti,.. 0,001 M EDTA (pH 8,0) è stato utilizzato per HIF-1αimmunostaining per facilitare reattività dell'antigene tessuto incluso fissa con l'anticorpo perossidasi endogena è stata bloccata incubando i campioni in metanolo contenente perossido di idrogeno allo 0,3% per 10 minuti i campioni sono stati poi risciacquato in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed incubate con siero di coniglio normale per 30 minuti. Le sezioni sono state incubate con i suddetti anticorpi primari per 2 ore a temperatura ambiente, quindi risciacquati tre volte in PBS. Per il rilevamento, abbiamo usato un Histofine SAB-PO (M) Kit (Nichirei Corp., Tokyo, Giappone). Le sezioni sono state poi incubate con biotinilato di coniglio anti-topo di Immunoglobuline (Ig, IgG, IgA, e IgM; Nicchirei Corp) per 10 minuti, lavate tre volte in PBS e trattati con streptavidina perossidasi-coniugato per 10 minuti. Dopo un lavaggio finale in PBS, l'etichetta perossidasi è stato rilevato incubando le sezioni diamino-benzidina tetraidro-cloruro (DAB) per 3 minuti. Nucleare contro-colorazione è stata effettuata utilizzando la soluzione ematossilina di Mayer. Per i controlli negativi, gli anticorpi primari sono stati sostituiti con i non-immuni, siero normale. immunoistochimica automatizzata è stata effettuata anche per sostenere l'immunocolorazione sopra descritto, utilizzando un sistema di Ventana Discovery ™ (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA).
Valutazione della immunocolorazione proteine
p21 era presente nei nuclei di cellule tumorali (Figura 1A). In alcuni casi, mucosa gastrica espresso proteine p21 e colorazione nucleare potrebbe essere rilevato nelle estensioni superficiali del tumore, ma non nelle regioni profonde. Abbiamo contato il numero di cellule p21-positive nella sezione tutta tumorale e valutato il numero di cellule p21-postive secondo la profondità degli strati. Il modello di HIF-1α immunostaining nel tumore era nucleare e /o citoplasmatica (Figura 1B). colorazione nucleare di HIF-1α era assente nel tessuto normale escluso colorazione citoplasmatica. In tutti i campioni, proteina p53 era rilevabile nei tessuti normali, e presente nei nuclei delle cellule tumorali (Figura 1C). Una cella con immunocolorazione nucleare per p21, p53 o HIF-1α (debole o forte) è stato segnato come positivo. Sulla base di questi criteri, sono stati stimati aree di colorazione focale con la più alta percentuale di colorazione nucleare p53- e p21-positivi all'interno del tessuto tumorale profondo. Un tumore è stato segnato come p21- o p53-positivo quando più del 10% delle cellule tumorali aveva colorazione nucleare, in linea con precedenti relazioni [10]. espressione di HIF-1α era spesso evidente nelle regioni intorno ai bordi invasione del tumore, e aree necrotiche, come quelli vicino a un'ulcera profonda. Abbiamo segnato come tumori positivi per HIF-1α sovraespressione se la colorazione nucleare è stata rilevata in più del 10% delle cellule tumorali, indipendentemente reattività citoplasmatica a qualsiasi livello [9, 11]. Figura 1 A) espressione di p21 nel tessuto tumorale adiacente. immunocolorazione nucleare è evidente (ingrandimento originale, 100 ×). B) l'espressione di HIF-1α a invadere le regioni del tumore. La variabilità nell'intensità di immunocolorazione nucleare è evidente, accompagnato da colorazione citoplasmatica (ingrandimento originale, 100 ×). C) immunocolorazione nucleare di p53 nel tessuto tumorale (ingrandimento originale, 100 ×). tessuto D) tumorali colorate con H & E (ingrandimento originale, 200 ×). tessuto tumorale contiene cellule (freccia) con caratteristiche di apoptosi
valutazione per apoptosi
Abbiamo segnato apoptosi delle cellule, come quelli che mostrano le caratteristiche tipiche di apoptosi quando campioni di tessuto sono state colorate con H &. E (Figura 1D). apoptosi delle cellule sono stati individuati in base alle caratteristiche di apoptosi: compattazione e migrazione dei contorni nucleari e cellulari, la frammentazione nucleare e la protuberanza, e la presenza di corpi apoptotici [12]. apoptosi delle cellule sono state contate in campioni di tessuto provenienti da tutti i pazienti. Cinque campi ad alta potenza (× 400) con il più abbondante distribuzione delle cellule tumorali sono stati selezionati per i conteggi e tra 1000 e 1500 cellule tumorali sono state contate. L'indice apoptotico è stato quindi calcolato come la percentuale di cellule apoptotiche. Le aree con necrosi estesa sono state evitate. Un singolo patologo presso ogni istituzione recensione diapositive e contò apoptosi delle cellule in base ai criteri sopra descritti.
Analisi statistica
Il programma BMDP pacchetto di statistica (BMDP, Los Angeles, CA) per IBM (Armonk, NY) 3090 mainframe i computer sono stati utilizzati per tutte le analisi statistiche [13]. I set di dati sono stati confrontati con t-test chi-quadrato e Student sta usando i programmi 4F e 3S BMDP. Il programma BMDP 1L è stato utilizzato per analizzare il tempo di sopravvivenza con il metodo Kaplan-Meier. La significatività statistica è stato fissato a P < 0.05 livello
. Risultati
espressione di p21 e fattori clinico-patologici
La tabella 1 mostra la correlazione tra l'espressione o la perdita di espressione di p21 con diversi fattori clinico-patologici. Nel complesso, 71 (56,3%) dei 126 campioni tumorali sono stati negativi per l'espressione p21. Nei tumori da pazienti sotto i 65 anni di età, la perdita di espressione di p21 era significativamente più frequente che nei tumori da pazienti di età superiore ai 65 (P = 0,026). Perdita di espressione p21 era significativamente più frequente nei tumori con grandi dimensioni (p = 0,03), rispetto ai tumori più piccoli. Per quanto riguarda le metastasi, tumori con perdita di espressione p21 tendevano a mostrare maggiore frequenza di invasione linfatica (P = 0,089, Tabella 1) e una significativamente maggiore frequenza di metastasi linfonodali (P = 0.022, tabella 2) rispetto ai tumori p21-esprimono. La tabella 3 mostra la relazione tra l'espressione di p21, e l'espressione di p53 e di HIF-1α. Sovraespressione di p53 è stata rilevata in 57 (45,2%) dei tumori, e HIF-1α sovraespressione è stata rilevata in 49 (38,9%) dei tumori. L'analisi immunoistochimica non ha evidenziato una correlazione tra l'espressione di p21 e l'espressione di p53, p21 o e HIF-1α sovraespressione (P = 0,444 e 0,609, rispettivamente) .table 1 Relazione tra l'espressione di p21 e fattori clinico-patologici
Fattori
p21 (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
valore P
Età (anni)
< 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
genere
Maschio
38
47
0.731
femminile
17
24
profondità dell'invasione
t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
Istologia
differenziata
35
39
0,325
indifferenziato
20
32
Le dimensioni del tumore
< 3 cm
23
22
0.03 Pagina 3 cm ≦
22
49
linfatico invasione
negativo
26
23
0.089
positivo
29
48
invasione venosa
negativo
42
57
0,595
positivo
13
14
Tabella 2 relazione tra espressione di p21 e metastasi
tumore p21-negativi (%)
valore P
metastasi linfonodali
negative
36/75 (48.0)
0.022
positivo 35/51 (68,6)
fegato metastasi
negativo 68/122 (55,7)
0,447
positivo
3/4 (75,0)
peritoneale diffusione
negativo 62/112 (55,4)
0.525
positivo
9/14 (64,3)
Table 3 relazione tra p21 e p53, e HIF-1α espressione
|
|
p21
|
|
|
positiva (n = 55)
negativo (n = 71)
valore P
p53
positiva (n = 57)
27
30
0.444
negativo (n = 69)
28
41
HIF-1α
positivo (n = 49)
20
29
0,608
negativo (n = 77)
35
42
apoptosi associata con HIF-1α e di espressione di p21
La media apoptotica Indice di tutti i 126 tumori era 8.95 ± 6.24 (range 0-37). I tumori sono stati divisi in quattro differenti popolazioni basato su HIF-1α e l'espressione p21 e l'indice apoptotico medio per ciascun gruppo è stata calcolata (Tabella 4). I tumori che erano HIF-1α-positivo /p21-negativi hanno avuto l'indice apoptotico più basso. C'è stata una differenza significativa tra i tumori che erano HIF-1α-positivo /p21-negativi, e quelli che erano HIF-1α-negativo /p21-negativi (P = 0.037) .table 4 apoptosi associata con HIF-1α e l'espressione di p21
Factor
apoptotica indice
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9.6 ± 7.33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9.83 ± 6.96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8.85 ± 4.04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6.97 ± 4.22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0.037 * ** P = 0,078 (media ± DS)
esiti clinici associati con HIF-1α e di espressione di p21
Il tempo medio di follow-up per i pazienti era di 55 ± 28 (± 1 SD) mesi (range, 1-82 mesi). Il tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti con tumori p21-negativo è inferiore a quello dei tumori p21-positivi, ma la differenza non era statisticamente significativa (dati non mostrati). I 126 pazienti sono stati ancora una volta divisi in quattro popolazioni sulla base di espressione di HIF-1α e di espressione di p21, e abbiamo esaminato la relazione tra l'espressione di HIF-1α e la prognosi nei campioni di p21-positivi o tumore -negativa. La tabella 5 mostra i tassi di sopravvivenza a 1, 3 e 5 anni per i pazienti e la correlazione con HIF-1α e di espressione p21. I pazienti con tumori HIF-1α-positivo /p21-negativi hanno avuto una prognosi significativamente peggiore rispetto alle altre popolazioni di studio. In particolare, in pazienti con tumori HIF-1α-positivo, coloro che avevano perso espressione di p21 ha avuto una prognosi significativamente peggiore rispetto a quelli con espressione p21 (p = 0,042) .table tasso di sopravvivenza a 5 anni associata con HIF-1α e l'espressione di p21
Fattore
1 anno di sopravvivenza
sopravvivenza a 3 anni
sopravvivenza a 5 anni
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7 80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** P = 0.003 *** P = 0,003 (%)
Discussione
I nostri risultati mostrano che la perdita di espressione di p21 positivamente correlata con l'età del paziente più giovane, e tumori più grandi. Inoltre, molti pazienti con tumori p21-negativi avevano metastasi linfonodali rispetto a quelli con tumori p21-positivi, ad una frequenza significativamente maggiore. Questi risultati suggeriscono che la perdita di espressione di p21 è coinvolto nei processi di crescita tumorale e le metastasi, in accordo con quanto riportato in precedenza [14, 15].
Iperespressione di HIF-1α è stato collegato a un povero esito clinico in alcuni tipi dei tumori umani [16-18]. Tuttavia, alcuni rapporti hanno suggerito che l'espressione del tumore di HIF-1α non conferisce un vantaggio di sopravvivenza [18, 19]. Anche se la maggior parte dei HIF-1 geni bersaglio possono promuovere la crescita tumorale attraverso la loro espressione migliore, geni HIF-1-attivate, tra cui p21, hanno anche la possibilità di inibire la crescita in condizioni di ipossia [20, 21]. espressione ectopica di HIF-1α nelle cellule endoteliali provocato up-regolazione di p21, la riduzione delle attività di CDK, arresto del ciclo cellulare al G 0 /G 1 punto di controllo, e la successiva apoptosi [22]. In questo studio, abbiamo scoperto che le cellule apoptosi erano sottorappresentati nei tumori HIF-1α-positivo /p21-negativi. In condizioni di ipossia, HIF-1α può inibire la proliferazione del tumore attraverso il controllo del ciclo cellulare p21-mediata, determinando la selezione di cellule che sono resistenti ai trattamenti apoptosi e anti-cancro. La maggior parte delle cellule tumorali mantengono la capacità di apoptosi in risposta allo stress ipossico [23]. Quando la risposta apoptotica all'ipossia è persa, cellule tumorali emergenti può essere più resistenti al trattamento e possono quindi contribuire alla successiva ricaduta del tumore [24]. I meccanismi attraverso i quali l'ipossia seleziona per le cellule resistenti all'apoptosi è chiaro, ma il coinvolgimento della mutazione di p53 è stata esaminata [25]. I rapporti hanno dimostrato che l'ipossia inibisce la crescita cellulare, e può causare apoptosi attraverso un pathway p53-dipendente [26]. HIF-1α è stato dimostrato anche per promuovere l'apoptosi p53-dipendente [27], ma altri studi hanno dimostrato che l'arresto della crescita in risposta all'ipossia è p53-indipendente [26]. In questo studio, abbiamo trovato alcuna prova di una relazione tra p53 e p21 espressione. Abbiamo anche valutato la relazione tra HIF-1α e di espressione di p53 per apoptosi delle cellule, ma non ha trovato una significatività statistica tra HIF-1α e l'espressione di p53 (dati non riportati). Il nostro studio precedente ha mostrato che la combinazione di sovraespressione HIF-1α con p53 non funzionale tendeva ad indicare una prognosi infausta [28].
In pazienti con tumori HIF-1α-positivo, la correlazione tra la perdita di espressione di p21 e poveri risultato clinico può riflettere una differenza fisiologica nella capacità di p21-positive contro tumori p21-negativi di sopravvivere in condizioni di ipossia. Anche se trascrizionale HIF-1α-dipendente è stato associato con la crescita del tumore, i nostri risultati suggeriscono che l'espressione contemporanea di p21 e di HIF-1α può ritardare la crescita tumorale in una certa misura.
Il meccanismo molecolare alla base dell'espressione di HIF-1α in warrant cancro particolari attenzione [29]. La presenza diffusa di upregulated HIF-1α nei tumori comuni e il coinvolgimento delle vie ipossia nell'angiogenesi tumorale certamente sostengono per la sua importanza e ampia applicabilità. La chemioterapia e le radiazioni che colpiscono HIF-1α possono essere efficaci e realistici, e in effetti, questo approccio è stato riportato [30]. Tuttavia, le differenze qualitative e quantitative nella risposta ipossica di diversi tipi di cellule non sono ben noti [31]. Ulteriori ricerche sono quindi necessaria al fine di valutare gli effetti di percorsi di HIF-1-mediata sulla proliferazione cellulare e l'apoptosi nei tumori umani sotto microambienti ipossia.
Nel presente studio, abbiamo dimostrato che l'iperespressione di HIF-1α e la perdita di p21expression in tumori gastrici correlati con cattiva prognosi del paziente, rispetto ai tumori che conservavano espressione p21, o avevano perso l'espressione di HIF-1α. Un meccanismo potenziale per questo è stato suggerito dalla scoperta che le cellule apoptotiche sono state sotto-rappresentate nei tumori HIF-1α-positivo /p21-negativi. tumori aggressivi che non riescono a indurre p21 in un HIF-1α - modo dipendente può avere un aumento della sopravvivenza cellulare senza l'apoptosi, e contribuire ad una cattiva prognosi per i pazienti
sostegno Finanziamento
Dipartimento di Chirurgia e Scienze, Graduate School of Medical. Scienza, Università di Kyushu, Fukuoka, Giappone.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
gli autori ringraziano K. Miyamoto per l'assistenza tecnica.
degli autori originali presentate file per le immagini
di seguito sono riportati i link agli autori 'originale presentato file per le immagini. 'file originale per la figura 1 12957_2006_249_MOESM2_ESM.tiff Autori 12957_2006_249_MOESM1_ESM.jpeg autori file originale di' file originale per la figura 3 12957_2006_249_MOESM4_ESM.tiff Autori figura 2 12957_2006_249_MOESM3_ESM.tiff Autori file originale per la figura 4 Conflitto di interessi
L'autore (s ) dichiarano di non avere interessi in gioco.
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