Relation du facteur 1α et p21 hypoxia-inducible
WAF1 /CIP1 expression à l'apoptose des cellules et les résultats cliniques chez les patients atteints de cancer gastrique Contexte
Résumé
facteur-1α hypoxia-inducible (HIF-1α) joue un rôle essentiel dans l'homéostasie de l'oxygène. L'expression des gènes de HIF-1α inductible est associée à la progression tumorale. p21 médiatise arrêt du cycle cellulaire et est l'un des gènes en aval visés par HIF-1.
Patients et méthodes
Nous avons examiné la relation entre de HIF-1α et l'expression de p21, l'apoptose et la progression de la tumeur en utilisant des échantillons de tissus obtenus chirurgicalement à partir de 126 Résultats des patients atteints de cancer gastrique.
L'analyse immunohistochimique a indiqué que la perte d'expression de p21 corrélée positivement avec l'âge du patient et la taille de la tumeur. Métastases ganglionnaires était significativement plus fréquents dans les tumeurs avec une perte d'expression de p21 (P = 0,022). tumeurs HIF-1α positif /p21-négatives avaient un indice apoptotique inférieur à celui d'autres échantillons de tumeurs, et les patients atteints de tumeurs HIF-1α positif /p21 négatif a également eu un pronostic nettement plus pauvres que les autres populations de patients.
Conclusion
Ces résultats suggèrent que la perte de résultats d'expression de p21 HIF-1α-dépendants dans une diminution de l'apoptose, augmentation de la survie des cellules et des tumeurs plus agressives.
Contexte The croissance incontrôlée des cellules cancéreuses aboutit souvent à des conditions hypoxiques dans les cellules tumorales masses. Résultats tumeur hypoxie d'un déséquilibre entre la consommation élevée d'oxygène dans les cellules tumorales cycle rapide et l'alimentation en oxygène insuffisante en raison de l'absence d'un réseau vasculaire physiologique. Les organismes multicellulaires ont développé des mécanismes cellulaires qui interviennent dans une cascade de réactions moléculaires adaptatifs à l'hypoxie. HIF-1α est un facteur de transcription qui active l'expression des gènes en se liant à l'élément sensible à l'hypoxie (HRE), une séquence d'ADN présent en amont agissant en cis de plusieurs gènes essentiels à la réponse cellulaire à l'hypoxie [1]. HIF-1alpha gènes réagissant fonctionnent également dans la voie de la glycolyse et de l'hématopoïèse et de l'angiogenèse, à travers toutes les cellules qui acquièrent un métabolisme adapté hypoxie et une augmentation de l'alimentation en oxygène [2]. Récemment, HIF-1α a émergé comme un régulateur clé dans la croissance du cancer gastrique [3].
L'apoptose est un mécanisme de mort cellulaire évolutivement conservée qui se produit aussi dans la réponse cellulaire adaptative au stress hypoxique. Apoptose, aussi, est une garantie importante contre le développement de tumeurs. Les tumeurs qui présentent une perte des niveaux de p53 suppresseur de tumeur gène présentent une réduction de la mort cellulaire induite par l'hypoxie et une augmentation correspondante dans la progression tumorale [4]. Le gène p21 (WAF1) a été clone dans un criblage génétique pour les effecteurs en aval de p53 et séparément dans un écran pour les régulateurs en amont de kinases cycline-dépendantes (CDK), en tant que protéine CDK interaction (CIP1) [5]. Le promoteur de la p21 peut être transactivée par HIF-1 dans la lignée cellulaire de cancer de la prostate de l'humain, ce qui indique que la protéine p21 est un gène cible de HIF-1 [6]. En outre, p21 expression induite par l'hypoxie a été abrogée dans des cellules dépourvues de HIF-1α, mais pas dans les cellules parentales [7].
HIF-1α peut donc favoriser à la fois la survie cellulaire et arrêt de la croissance par l'induction de gènes sensibles à l'hypoxie. Dans la présente étude, nous avons examiné le rôle de HIF-1α dans le contrôle hypoxique de la progression tumorale, en examinant la relation entre l'expression de HIF-1α, l'expression de p21 et l'apoptose dans des échantillons de tissus provenant de patients atteints de cancer gastrique. Matériaux et méthodes
Les matériaux cliniques
sujets étaient 126 patients atteints de cancer gastrique (85 hommes, 41 femmes, tranche d'âge, 27 à 88 ans, âge moyen, 65,2 ans) ayant subi une gastrectomie à notre institution en 1994. la résection curative a été réalisée dans 77 patients et non résection curative en 49. les échantillons de tissu réséqué ont été fixées dans une solution de formaldéhyde à 10% et inclus dans de la paraffine. Sections (4 um d'épaisseur) ont été montées sur des lames de verre. Tous les échantillons ont été examinés macroscopiquement et histologiquement, sur la base de critères proposés par les Règles générales pour l'étude du cancer gastrique [8]. L'examen histologique a été réalisé sur des préparations de tissus colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E). Dans l'étude actuelle, les tumeurs ont été divisés en deux types histologiques: le type différencié, comprenant papillaire adénocarcinome et adénocarcinome tubulaire, et le type indifférencié, comprenant un adénocarcinome peu différencié, le carcinome à cellules de chevalière, et adénocarcinome mucineux. Deux blocs de paraffine ont été préparés pour tous les patients "une contenant à la fois de tissu tumoral et de tissu normal adjacent, et l'autre tissu tumoral contenant envahissant au niveau le plus profond de la paroi de l'estomac.
Coloration immunohistochimique
Tous les échantillons ont été immunocolorées avec un anticorps monoclonal anticorps contre p21 WAF1 /CIP1 (SX118, dilué 1:50, DAKO, Glostrup, Danemark), p53 (Do-7, dilué 1:50, DAKO, Glostrup, Danemark), et HIF-1α (NB 100- 105, dilué 1:. 100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) [9] Après déparaffinage et réhydratation, les diapositives de p21 et p53 immunocoloration ont été autoclaves dans un tampon citrate (0,01 M, pH 6,0) à 120 ° C pendant 10 minutes;.. 0.001 M EDTA (pH 8,0) a été utilisé pour HIF-1αimmunostaining pour faciliter la réactivité de l'antigène incorporé fixe de tissu avec l'anticorps de la peroxydase endogène a été bloquée par incubation des échantillons dans du methanol contenant 0,3% de peroxyde d'hydrogène pendant 10 minutes, les échantillons ont été ensuite rincé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et mises en incubation avec du sérum normal de lapin pendant 30 minutes. Les sections ont été incubées avec les anticorps primaires mentionnés ci-dessus pendant 2 heures à la température ambiante, puis rincée trois fois dans du PBS. Pour la détection, nous avons utilisé un Histofine SAB-PO (M) kit (Nichirei Corp., Tokyo, Japon). Les sections ont ensuite été incubées avec le lapin biotinylé immunogloblin anti-souris (Ig, IgG, IgA et IgM Nicchirei Corp.) pendant 10 minutes, lavées trois fois dans du PBS et traitées avec de la streptavidine conjuguée à la peroxydase pendant 10 minutes. Après un lavage final dans du PBS, l'étiquette de la peroxydase a été détectée par incubation des coupes dans diamino-benzidine tétrahydro-chlorure (DAB) pendant 3 minutes. contre-coloration nucléaire a été effectué en utilisant la solution de l'hématoxyline de Mayer. Pour les contrôles négatifs, les anticorps primaires ont été remplacés par des non-immune, le sérum normal. Évaluation de l'immunohistochimie automatisé a également été effectuée pour appuyer la immunocoloration décrite ci-dessus, en utilisant un système de Ventana Discovery ™ (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA). Immunocoloration de la protéine
p21 était présent dans les noyaux des cellules tumorales (figure 1A). Dans certains cas, la muqueuse gastrique normale a exprimé la protéine p21 et la coloration nucléaire a pu être détectée dans la partie superficielle de la tumeur, mais non dans les régions plus profondes. On a compté le nombre de cellules positives p21 dans la section de la tumeur entière et évalué le nombre de cellules p21-postive selon l'épaisseur des couches. Le motif de HIF-1α immunocoloration dans la tumeur était nucléaire et /ou cytoplasmique (figure 1B). coloration nucléaire de HIF-1α était absent dans les tissus normaux excluant une coloration cytoplasmique. Dans tous les échantillons, la protéine p53 est indétectable dans les tissus normaux, et présents dans les noyaux des cellules tumorales (figure 1c). Une cellule avec immunomarquage nucléaire pour p21, p53 ou HIF-1α (faible ou forte) a été marqué comme positif. Sur la base de ces critères, les zones de coloration focale avec le plus haut pourcentage de coloration nucléaire p53 et p21-positive dans le tissu tumoral en profondeur ont été estimées. Une tumeur a été notée comme p21- ou p53 positive lorsque plus de 10% des cellules tumorales a eu une coloration nucléaire, conformément aux rapports antérieurs [10]. expression de HIF-1α est souvent évidente dans les régions autour des bords d'invasion de la tumeur, et des zones nécrotiques tels que ceux à proximité d'un ulcère profond. Nous avons marqué des tumeurs positives pour HIF-1α surexpression si une coloration nucléaire a été détectée dans plus de 10% des cellules tumorales, sans tenir compte de la réactivité cytoplasmique à tous les niveaux [9, 11]. La figure 1 A) l'expression de la p21 dans le tissu tumoral adjacent. immunocoloration nucléaire est évident (grossissement original, 100 ×). B) l'expression de HIF-1α dans les régions de la tumeur envahissant. Variabilité de l'intensité de l'immunomarquage nucléaire est évidente, accompagnée d'une coloration cytoplasmique (grossissement original, 100 ×). C) immunocoloration nucléaire de p53 dans le tissu tumoral (grossissement 100 fois). tissu D) des tumeurs colorées avec H &E (agrandissement original 200 x). Le tissu tumoral contient des cellules (flèche) avec caractéristiques de l'apoptose
évaluation pour l'apoptose
Nous avons marqué des cellules apoptotiques comme celles montrant les caractéristiques typiques de l'apoptose lorsque des échantillons de tissus ont été colorées avec H &. E (figure 1D). Les cellules apoptotiques ont été identifiés sur la base des caractéristiques de l'apoptose: compactage et de migration des contours nucléaires et cellulaires, la fragmentation nucléaire et la protubérance, et la présence de corps apoptotiques [12]. Les cellules apoptotiques ont été comptées dans des échantillons de tissus de tous les patients. Cinq champs haute puissance (x 400) avec la répartition la plus abondante de cellules tumorales ont été sélectionnées pour la numération des cellules et entre 1000 et 1500 tumorales ont été comptées. L'indice apoptotique a ensuite été calculé comme le pourcentage de cellules apoptotiques. Les zones avec une nécrose ont été évités. Un pathologiste unique à chaque institution a examiné les diapositives et compté les cellules apoptotiques selon les critères décrits ci-dessus.
Analyse statistique
Le programme BMDP Statistical Package (BMDP, Los Angeles, CA) pour IBM (Armonk, NY) 3090 mainframe les ordinateurs ont été utilisés pour toutes les analyses statistiques [13]. Les ensembles de données ont été comparées par des tests t de chi carré et Étudiant est en utilisant les programmes 4F et 3S BMDP. Le programme BMDP 1L a été utilisé pour analyser le temps de survie en utilisant la méthode de Kaplan-Meier. La signification statistique a été fixé à la P < L'expression de p21: Résultats de 0,05 et les facteurs. clinico-pathologique
Le tableau 1 montre la corrélation de l'expression ou de la perte d'expression de p21 avec plusieurs facteurs clinico-pathologique. Dans l'ensemble, 71 (56,3%) des échantillons de tumeur 126 ont été négatifs pour l'expression de p21. Dans les tumeurs de patients de moins de 65 ans, la perte d'expression de p21 était significativement plus fréquente que dans les tumeurs de patients âgés de plus de 65 (P = 0,026). La perte de l'expression de p21 était significativement plus fréquente dans les tumeurs avec une grande taille (p = 0,03) par comparaison à des tumeurs plus petites. En ce qui concerne les métastases, les tumeurs présentant une perte de l'expression de p21 ont tendance à montrer une fréquence accrue d'invasion lymphatique (p = 0,089, Tableau 1) et une fréquence significativement plus élevée de métastases des ganglions lymphatiques (p = 0,022, tableau 2) que les tumeurs p21 exprimant. Le tableau 3 montre la relation entre l'expression de p21 et l'expression de p53 et de HIF-1α. La surexpression de p53 a été détectée chez 57 (45,2%) des tumeurs et HIF-1α-expression a été détectée dans 49 (38,9%) des tumeurs. L'analyse immunohistochimique n'a pas révélé une corrélation entre l'expression de p21 et l'expression de p53 ou p21 et HIF-1α surexpression (P = 0,444 et 0,609, respectivement) .Table 1 Relation entre l'expression de p21 et les facteurs clinico-pathologique
p21
Facteurs (+) (n = 55)
p21 (-) (n = 71)
valeur P
Âge (années)
< 65
20
40
0,026
65 ≦
35
31
Sexe Homme
38
47
0,731
17
24
Profondeur de Femme de l'invasion de t1
33
35
0,231
t2,3,4
22
36
histologie
Differentiated
35
39
0,325
indifférencié
20
32
taille de la tumeur
< 3 cm
23
22
0,03
3 cm ≦
22 invasion
49
lymphatique
négatif
26
23
0,089
29
48
invasion Venous positif
négatif
42
57
0,595
positif de 13
14
Tableau 2 relation entre expression de p21 et la métastase
p21 négatif tumeur (%)
valeur de P
métastases ganglionnaires
Negative
36/75 (48,0)
0,022
positive 35/51 (68,6)
métastases hépatiques
négatif 68/122 (55,7)
0,447
3/4 (75,0)
diffusion péritonéale positif
négatif 62/112 (55,4)
0,525
9/14 (64,3)
Table positive 3 relation entre p21 et p53, et HIF-1α expression
|
|
p21
|
|
|
positif (n = 55)
négatif (n = 71)
P valeur
p53
positif (n = 57)
27
30
0,444
négatif (n = 69)
28
41
HIF-1α
positif (n = 49)
20
29
0,608
négatif (n = 77)
35
42
apoptose associé à HIF-1α et d'expression de p21 The signifie apoptotique index de toutes les 126 tumeurs était 8,95 ± 6,24 (intervalle 0-37). Les tumeurs ont été divisés en quatre populations différentes en fonction de HIF-1α et l'expression de p21 et l'indice apoptotique moyenne pour chaque groupe a été calculé (tableau 4). Tumeurs qui étaient HIF-1α positif /p21 négatif avaient l'indice apoptotique plus bas. Il y avait une différence significative entre les tumeurs qui étaient HIF-1α positif /p21-négatives, et ceux qui étaient HIF, 1α-négatif /p21 négatif (P = 0,037) .Table 4 Apoptose associé à HIF-1α et l'expression de p21
Factor
apoptotique index
HIF-1α (-), p21 (+) n = 35
9,6 ± 7,33 ***
HIF -1α (-), p21 (-) n = 42
9,83 ± 6,96 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
8,85 ± 4,04 *, **, ***
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
6,97 ± 4,22 *, **, ***
* P = 0,129 ** P = 0,037 * ** P = 0,078 (moyenne ± écart-type)
résultat clinique associé à HIF-1α et d'expression de p21
Le temps de suivi moyen des patients était de 55 ± 28 (± 1 SD) mois (gamme, 1-82 mois). Le taux de survie à 5 ans des patients atteints de tumeurs p21-négatives est inférieur à celui des tumeurs p21-positives, mais la différence était statistiquement non significative (données non représentées). Les 126 patients ont été à nouveau divisés en quatre populations basées sur l'expression de HIF-1α et l'expression de p21, et nous avons examiné la relation entre l'expression et le pronostic HIF-1α dans les échantillons de p21-positifs ou tumorales séronégatifs. Le tableau 5 présente les taux de survie de 1, 3 et 5 ans pour les patients et la corrélation avec le HIF-1α et l'expression de p21. Patients atteints de tumeurs HIF-1α positif /négatif p21 avaient un pronostic nettement plus pauvres que les autres populations étudiées. En particulier, chez les patients atteints de tumeurs HIF-1alpha-positifs, ceux qui avaient perdu l'expression de p21 avaient un pronostic nettement plus pauvres que ceux avec l'expression de p21 (P = 0,042) .Table 5 ans le taux de survie associé à HIF-1α et l'expression de p21
survie
1 an de facteur
survie à 3 ans
survie à 5 ans
HIF-1αg (-), p21 (+) n = 35
94,1
82,0
82,0 ***
HIF-1α (-), p21 (-) n = 42
92,7
80,0
80,0 **, ***
HIF-1α (+), p21 (+) n = 20
95,0
85,0
70,0 *, **, * **
HIF-1α (+), p21 (-) n = 29
68,1
57,4
45,9 *, **, ***
* P = 0,042 ** p = 0,003 *** P = 0,003 (%)
Discussion
Nos résultats montrent que la perte d'expression de p21 corrélée positivement avec l'âge du patient plus jeune et plus grande tumeur. En outre, de nombreux patients atteints de tumeurs p21-négatives avaient métastases ganglionnaires par rapport à ceux avec des tumeurs p21-positives, à une fréquence significativement plus élevée. Ces résultats suggèrent que la perte d'expression de p21 est impliquée dans les processus de croissance tumorale et les métastases, en accord avec les rapports précédemment [14, 15].
HIF-1α surexpression a été liée à un mauvais résultat clinique dans certains types des cancers humains [16-18]. Cependant, certains rapports ont suggéré que l'expression tumorale de HIF-1α ne confère pas un avantage de survie [18, 19]. Bien que la plupart des HIF-1 des gènes cibles peut favoriser la croissance tumorale par leur expression accrue des gènes de HIF-1 activées, notamment p21, ont également le potentiel d'inhiber la croissance dans des conditions hypoxiques [20, 21]. L'expression ectopique de HIF-1α dans les cellules endothéliales a abouti à la régulation de p21, la réduction des activités de CDK, arrêt du cycle cellulaire au G 0 /G 1 point de contrôle, et l'apoptose subséquente [22]. Dans l'étude actuelle, nous avons constaté que les cellules apoptotiques étaient sous-représentées dans les tumeurs HIF-1α positif /p21 négatif. Dans des conditions hypoxiques, HIF-1α peut inhiber la prolifération de la tumeur grâce à un contrôle du cycle cellulaire à médiation par p21, ce qui entraîne la sélection de cellules qui sont résistantes aux traitements de l'apoptose et anti-cancéreux. plupart des cellules tumorales conservent l'aptitude à subir une apoptose en réponse au stress hypoxique [23]. Lorsque la réponse apoptotique à l'hypoxie est perdue, les cellules tumorales émergentes peuvent être plus résistantes au traitement et peuvent donc contribuer à la rechute tumorale ultérieure [24]. Les mécanismes par lesquels l'hypoxie sélectionne pour les cellules résistantes à l'apoptose est incertaine, mais l'implication de la mutation p53 a été examinée [25]. Des rapports ont montré que l'hypoxie inhibe la croissance des cellules et peut provoquer une apoptose par une voie dépendante de p53 [26]. HIF-1α a également été montré pour favoriser l'apoptose dépendante de p53 [27], mais d'autres études ont montré que l'arrêt de croissance en réponse à l'hypoxie est indépendante de p53 [26]. Dans l'étude actuelle, nous avons trouvé aucune preuve d'une relation entre p53 et l'expression de p21. Nous avons également évalué la relation entre HIF-1α et p53 expression à l'apoptose cellulaire, mais n'a trouvé aucune signification statistique entre HIF-1α et l'expression de p53 (données non présentées). Notre étude précédente a montré que la combinaison de la surexpression de HIF-1α avec p53 non fonctionnel tendait à indiquer un mauvais pronostic [28].
Chez les patients atteints de tumeurs HIF-1alpha positif, la corrélation entre la perte d'expression de p21 et les résultats cliniques pauvres peuvent refléter une différence dans la capacité physiologique de p21 positif par rapport à des tumeurs p21-négatives pour survivre dans des conditions hypoxiques. Même si l'activation de la transcription HIF-1α-dépendante a été associée à une croissance tumorale, nos résultats suggèrent que l'expression concomitante de p21 et HIF-1α peut retarder la croissance tumorale jusqu'à un certain degré.
Le mécanisme moléculaire sous-jacent l'expression de HIF-1α en justifie notamment le cancer attention [29]. La présence généralisée de HIF-1α régulée positivement dans les cancers communs et l'implication des voies d'hypoxie dans l'angiogenèse tumorale soutiennent certainement pour son importance et une large applicabilité. La chimiothérapie et la radiothérapie qui cible HIF-1α peuvent être efficaces et réalistes, et en fait, cette approche a été rapportée [30]. Cependant, les différences qualitatives et quantitatives dans la réponse hypoxique des différents types de cellules ne sont pas bien connus [31]. D'autres recherches sont donc nécessaires afin d'évaluer les effets des voies HIF-1-médiation sur la prolifération cellulaire et l'apoptose dans les cancers humains sous microenvironnements hypoxiques.
Dans la présente étude, nous avons montré que HIF-1α surexpression et la perte de p21expression dans cancers gastriques corrélés avec un mauvais pronostic des patients, par rapport à des tumeurs qui ont retenu l'expression de p21, ou avaient perdu l'expression de HIF-1α. Un mécanisme potentiel pour cela a été suggéré par la découverte que les cellules apoptotiques ont été sous-représentés dans les tumeurs HIF-1α positif /p21 négatif. tumeurs agressives qui ne parviennent pas à induire p21 dans un HIF-1α - de façon dépendante peuvent avoir
soutien financier accru la survie des cellules sans l'apoptose, et contribuer à un mauvais pronostic pour les patients Ministère de la chirurgie et de la Science, Graduate School of Medical. science, Remerciements Déclarations de l'Université de Kyushu, Fukuoka, au Japon.
les auteurs remercient K. Miyamoto pour l'assistance technique.
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L'auteur (s ) déclarent avoir aucun conflit d'intérêts.
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