Metallotionein 2A hämmar NF-kB vägen aktivering och förutsäger kliniskt utfall segregerade med TNM stadium i mag cancerpatienter efter radikal resektion

Metallotionein 2A hämmar NF-kB vägen aktivering och förutsäger kliniskt utfall segregerade med TNM stadium i mag cancerpatienter efter radikal resektion Bild Sammanfattning
Bakgrund
metallotionein 2A (MT2A) som ett stressprotein, spelar en skyddande roll i gastric slemhinnebarriären. Dess roll i utvecklingen av gastrisk cancer (GC) är oklart. Mekanismen för MT2A utreds i gastric tumörbildning.
Metoder
MT2A uttryck detekterades i 973 gastric prover. Den biologiska funktionen bestämdes genom ektopisk uttryck MT2A in vitro Mössor och in vivo
. De möjliga nedströms effektorer av MT2A undersöktes i NF-kB-signalering. Proteinnivåer MT2A, IkB-α och p-iKB-α (ser32 /36) uttryck analyserades i en delmängd av 258 patienter med IHC färgning. De prognostiska effekterna av MT2A ades status för iKB-α och TNM stadium utvärderades genom att använda Kaplan-Meier-metoden och jämfördes med användning av log-rank test.
Resultat
Minskat MT2A uttryck detekterades i cellinjer och primära tumörer i GC. I kliniska data, förlust av MT2A (MT2A + i Normal (n = 171, 76,0%), Intestinal metaplasi (n = 118, 50,8%), GC (n = 684. 22,4%, P Hotel < 0,001)) associerades med dålig prognos (P Hotel < 0,001), avancerad TNM stadium (P
= 0,05), och nedreglering av iKB-α uttryck (P Hotel < 0,001). Dessutom MT2A var den oberoende prognostiska signaturen åtskilda från status iKB-α och patologiska funktioner. Dessutom inhiberade MT2A celltillväxt genom apoptos och G2 /M stillestånd, vilket regleras negativt NF-kB-vägen genom Slutsatser
uppreglering av iKB-α och nedreglering av p-iKB-α och cyklin D1 uttryck.
MT2A kan spela en tumör undertryckande aktivitet genom att hämma NF-kB signalering och kan vara en prognostisk biomarkör och potentiellt mål för individuell terapi av GC patienter.
Nyckelord
Metallotionein 2A NF-kB signalering Gastric cancer Prognos TNM stadium bakgrund
Nyheter
Överflöd av Metallotionein 2A (MT2A) utställningar i gastrointestinala barriären, men dess roll i utvecklingen av magcancer (GC) är fortfarande oklart. I denna analys av 171 normala mag vävnader, 118 intestinal metaplasi och 684 primära gastric cancer minskade MT2A var signifikant korrelerad med dålig prognos. Det hämmade proliferation av GC-celler genom NF-kB signalering inaktivering. Dessa resultat tyder på att MT2A kan vara en viktig prognostisk markör och terapeutiskt mål för GC.
Magcancer (GC) är den vanligaste diagnosen malignitet och förblir en betydande börda av cancer i Asien, särskilt i Kina [1, 2]. De flesta GC patienter som genomgår kirurgi är redan långt framskridna och 5-årsöverlevnaden är varierad. Flera histologiska faktorer har rapporterats vara prognostiska faktorer för GC, inklusive tumörstorlek, WHO klassificering, tumör nod-metastas (TNM) scensystemet, och differentiering grad [3, 4]. Men det är fortfarande inkonsekvent prognosen för GC patienter i samma skede [5]. Därför skulle identifiering av specifika diagnostiska markörer och terapeutiskt mål tillåta tillförlitlig förutsägelse, effektiv förlängning av postoperativ överlevnad och livskvaliteten av patienterna [6].
Cellulär stress har visat sig spela en roll i den molekylära regleringen av karcinogenes [7, 8]. Metallotioneiner (MTS) som stressproteiner med låg molekylvikt och rik-cystein har förmågan av en hög affinitet för metalljoner och ROS scavengers. MT2A som den huvudsakliga isoformen av MTs spelar en viktig roll vid gastrisk mukosal barriär hos patienter med gastrit och gnagarmodeller [9, 10]. Pre-administrering av exogent MT2A eller pre-induktion av endogen MT2A kan skydda magen och levern mot stressinducerad skada och inhibera bildningen av stressinducerad lipid-peroxid, vilket tyder på en skyddande effekt av MT2A på stressinducerad patogenes och ett potentiellt terapeutiskt mål ansökt om tidigt förebyggande [11] - [13]. Nyligen MT2A spelar en viktig roll vid tumorigenes och progression av flera karcinom inklusive GC [14]. Mössen förlorade MT2A gen predisponerade för diethylnitrosamine-inducerad hepatocarcinogenesis genom att aktivera NF-kB målgener, vilket visar att MT2A skyddar möss från hepatocarcinogen-inducerad leverskada och cancer, understryker dess potentiella terapeutiska tillämpning mot hepatocellulär cancer [15]. Vissa studier fokuserat på rollen av MT2A i skyddet mot H. pylori
inducerad gastrisk skada med hjälp av MT-null möss. Himeno upptäckte S. att aktivering av NF-kB och uttrycket av NF-kB-förmedlade kemokiner i gastric celler var markant högre i MT2A-null möss än i bred typ möss [9]. Dessa data antyder att MT2A inser negativ kontroll av transkriptionsfaktorn NF-kB aktivitet, men dess roll i gastric cancer är fortfarande oklar [16] - [18].
Avvikande aktivering av NF-kB är förknippad med cellinflammation, malignitet , och tumörprogression [7, 19]. Den funktionella aktiviteten av NF-kB hämmas genom bindning till dess inhibitor, IkB-α. Aktivering av NF-kB är en följd av proteasom-förmedlad nedbrytning av iKB-α genom fosforylering av inhibitorn (p-iKB-α), vilket antyder att NF-kB-vägen är ett potentiellt mål för individuell terapi [20] - [23] .
Vissa tecken tydde på att ökat MT2A uttryck är viktigt för cancer progression, och MT2A är ursprungligen föreslogs som en proto-onkogen i bröst, matstrupen, prostata, och äggstockscancer, i samband med malignitet och dålig prognos [24] - [27 ]. I motsats härtill är det nedregleras i gastrointestinala tumörer och hepatocellulära karcinom, där MT2A antingen omvänt korrelerade eller orelaterade till dödlighet [28, 29]. Förblir emellertid variationen av MT2A och dess klinisk utvärdering motsägelse i GC [28, 30, 31]. Dessa resultat tyder på att dysreglering av MT2A är involverad i tumör patogenes, även om den exakta roll är fortfarande oklart i GC.
Därför fokuserade vi att avslöja samexpression av MT2A och iKB-α-genen korrelerats med kliniska patologiska funktioner och resultat i stor skala av gastric tumörer med långtidsuppföljningsdata. Dessutom systematiskt analyserade vi roll MT2A som ett stressprotein och negativ regulator i NF-KB-aktivering att karakterisera dess biologiska roll och molekylära mekanism och in vivo
vitro
.
Metoder
Patient egenskaper
Gastric tumörprover från 684 GC patienter som behandlades med Peking Cancer Hospital 1997-2007 bedömdes. De patienter som ingick 513 män (75,0%) och 171 kvinnor (25,0%) med en genomsnittsålder vid diagnos av 54 år (intervall, 19 till 81 år). Uppföljningsperioden varierade från ett till 127,2 månader (median, 34,2 månader). Samtliga patienter genomgick radikal resektion med kurativt syfte. Ingen av patienterna hade fått neoadjuvant kemoterapi eller strålbehandling före operation. Kriterierna för alla patienter inkludering är: (a) en distinkt GC diagnos baserad på den sjätte upplagan av tumör nod-metastas (TNM) klassificering av den internationella unionen mot GC, (b) en radikal resektion, (c) lämplig formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader. Summan av 684 GC hade kliniskt patologiska data (betecknas som "kohort"). Dessutom har en uppsättning av 258 berättigade prover från kohorten med 10-åriga uppföljningsdata (betecknas som "delmängd"). Det kliniska resultatet av patienterna registrerades från och med dagen för operation för att tidpunkten för dödsfallet. Dessutom har 118 tarm metaplasi (IM) och 171 normala mag vävnader som samlats in från dessa GC patienter. Histologisk utvärdering utfördes av tre ledande patologer. Den demografiska fördelningen av kohorten och delmängd listas i Kompletterande tabell 1. Dessutom var 36 parade gastric tumörer med intilliggande normal vävnad maldes till ett pulver under flytande kväve för RT-PCR och realtids-PCR av MT isoformer (Ytterligare fil1). tabell 1 Logistisk regressionsanalys av kliniskt patologiska funktioner och prognos i GC
variabler
Nej av fallen (n = 258)
Överlevnadstiden (månad)
P
-värde
Sex
Man
186
66,4 ± 4,6
Kvinna
72
54,1 ± 4,8
0,604
Ålder vid diagnos Hotel < 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM stadium
jag
34
105,5 ± 7,7
jag vs. IV Hotel < 0,001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs. IV Hotel < 0,001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs IV
0,010
IV
52
35,8 ± 4,1
Tumör djup
PT1
13
87,2 ± 9,9
PT1 vs. pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 vs. pT4 Hotel < 0,001
pT3
157
49,1 ± 2,9
pT3 vs. pT4
0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
Lymfkörtel status
PN0
78
89,8 ± 6,2
PN0 vs. PN3
0,001
PN1
115
50,5 ± 3,4
PN1 vs. PN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
pN2 vs. PN3
0,326
PN3
16
47,5 ± 12,6
fjärrmetastaser
PM0
232
67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8 Hotel < 0,001
Grad differentiering
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A uttryck Hotel < 0,001
låg
202
53,9 ± 3,4
hög
56
86,9 ± 9,2
iKB-α uttryck
låg
164
61,6 ± 4,9
hög
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-iKB-α uttryck
låg
126
74,1 ± 5,3
hög
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: ingen fjärrmetastaser; M1: fjärrmetastaser;
D1: väl /måttligt differentierade GC; D0: dåligt differentierade GC
Immunhistokemisk analys
IHC färgning i vävnadsuppsättning utfördes med MT2A antikropp. (1: 100 spädning; 18-0133, Invitrogen, CA, USA), p-iKB-α-antikropp (en : 200 utspädning; ab47752, Abcam, Cambridge, UK), ikB-α-antikropp (1: 300 utspädning; sc-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). För varje biomarkör, var bilderna gjorde visuellt med tre patologer som var blinda för kliniskt utfall. Avvikelser löstes med konsensus. Poäng tilldelades som en procentandel av positiv färgning inom varje cylinder. Den genomsnittliga procentuella värdet av de två kärnorna har beräknats utgöra en tumör (Ytterligare fil1).
Cellinjer
magcancer cellinjer BGC823, MGC803, SGC7901 och PAMC82 etablerades i Kina och köpts från vävnadsbanken i Shanghai (Shanghai, Kina). Speciellt, BGC823 celler uppvisade hög tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 och SNU-16 cellinjer inhandlades från ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA). GES-1, en immortaliserad human gastrisk epitelcellinje, genererades genom SV40 viral transfektion på Beijing Cancer Hospital och odlades i DMEM-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Gibco, Life technologies, Grand Island, NY, USA) vid 37 ° C i en fuktig atmosfär innehållande 5% CO 2 [32] MTT och mjuk agar assay
cellerna såddes i 96-brunnars odlingsplattor, och MTT tillsattes till cellerna vid 1-5.
dagar. MTT (5

• Uttryck av COX-2 och VEGF-C i magcancer: korrelationer med lymfangiogenes och prognostiska konsekvenser
• Nedreglering av SPARC uttryck minskar cancer gastric cellulär invasion och survival