Metallothionein 2A hemmer NF-kB sti aktivering og spår klinisk utfall segregert med TNM stadium i mage kreftpasienter etter radikal reseksjon

Metallothionein 2A hemmer NF-kB sti aktivering og spår klinisk utfall segregert med TNM stadium i mage kreftpasienter etter radikal reseksjon
Abstract
Bakgrunn
metallothionein 2A (MT2A) som en stress protein, spiller en beskyttende rolle i mage slimhinnebarriere. Dens rolle i utviklingen av magekreft (GC) er uklart. Mekanismen for MT2A vil bli undersøkt i mage tumorigenesis.
Metoder
MT2A uttrykk ble oppdaget i 973 mageprøver. Den biologiske funksjonen ble fastsatt gjennom ektopisk uttrykke MT2A in vitro Hotell og in vivo
. De mulige nedstrøms effektorer av MT2A ble undersøkt i NF-kB signalering. Protein nivåer av MT2A, IkB-α og p-IkB-α (ser32 /36) ekspresjon ble analysert i en undergruppe av 258 pasienter av IHC-farging. De prognostiske effekten av MT2A, ble status for IkB-α og TNM stadium evaluert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test
Resultater
Redusert MT2A uttrykk ble påvist i cellelinjer og primære svulster. GC. I kliniske data, tap av MT2A (MT2A + i Normal (n = 171, 76,0%), intestinal metaplasi (n = 118, 50,8%), GC (n = 684. 22,4%, P
< 0,001)) var assosiert med dårlig prognose (P
< 0,001), avansert TNM trinn (P
= 0,05), og nedregulering av IkB-α uttrykket (P
< 0,001). Videre MT2A var uavhengig prognostisk signatur segregert fra status IkB-α og patologiske funksjoner. I tillegg MT2A hemmet cellevekst ved apoptose og G2 /M rest, noe som negativt regulert NF-kB vei gjennom oppregulering av IkB-α og nedregulering av p-IkB-α og cyclin D1 uttrykk.
Konklusjoner
MT2A kan spille en svulst undertrykkende aktivitet gjennom å hemme NF-kB signalering og kan være en prognostisk biomarkør og potensielt mål for individuell terapi av GC pasienter.
nøkkelord
metallothionein 2A NF-kB signaleMageKreft kreft~~POS=HEADCOMP Prognose TNM stadium Bakgrunn
Hva er nytt
Overflod av metallothionein 2A (MT2A) utstillinger i mage mucosal barriere, men dens rolle i utviklingen av magekreft (GC) er fortsatt uklart. I denne analysen av 171 normale mage vev, 118 intestinal metaplasi og 684 primær mage kreft, nedsatt MT2A var signifikant korrelert med dårlig prognose. Det hemmet spredning av GC cellene gjennom NF-kB signaleinaktivering. Disse resultatene indikerer at MT2A kan være en viktig prognostisk markør og terapeutisk mål for GC.
Magekreft (GC) er den vanligste diagnosen kreft og andre er fortsatt en betydelig byrde av kreft i Asia, spesielt i Kina [1, 2]. De fleste GC pasienter som gjennomgår kirurgi er allerede på et avansert stadium og 5-års overlevelse er variert. Flere histologiske faktorer har blitt rapportert å være prognostiske faktorer av GC, inkludert tumorstørrelse, WHO klassifisering, tumor-metastase-node (TNM) trinns system, og differensiering grad [3, 4]. Imidlertid er fremdeles inkonsekvent prognose av GC pasientene på samme scene [5]. Derfor ville identifisering av spesifikke diagnostiske markører og terapeutiske mål tillate pålitelig prediksjon, effektiv forlengelse av postoperativ overlevelse og livskvalitet hos pasienter
Cellular stress har blitt vist å spille en rolle i reguleringen av molekyl karsinogenese [7 [6]., 8]. Metallothioneiner (MTS) som stressproteiner med lav molekylvekt og rik-cystein ha evnen til en høy affinitet for metallioner og ROS scavengers. MT2A som hoved isoform av MT'er spiller en viktig rolle i gastrisk mucosal barriere hos pasienter med gastritt og gnagermodeller [9, 10]. Pre-administrering av eksogent MT2A eller pre-induksjon av endogent MT2A kan beskytte magesekken og leveren mot stress-indusert skade og hemme dannelsen av stressinduserte lipid peroksyd, noe som tyder på en beskyttende virkning av MT2A om stress-indusert patogenese og et potensielt terapeutisk mål søkt om tidlig forebygging [11] - [13]. Nylig, spiller MT2A en viktig rolle i tumorigenese og progresjon av flere karsinomer inkludert GC [14]. Musene tap av MT2A genet disponert for diethylnitrosamine-indusert hepatocarcinogenesis ved å aktivere NF-kB målgener, som viser at MT2A beskytter mus fra hepatocarcinogen-indusert leverskade og kreftutvikling, og understreker dens potensial terapeutisk anvendelse mot leverkreft [15]. Noen studier fokusert på rollen MT2A i beskyttelse mot h.pylori
indusert mageskade ved bruk av MT-null mus. Himeno, S. oppdaget at aktivering av NF-kB og uttrykk for NF-kB-mediert chemokiner i mage celler var betydelig høyere i MT2A-null mus enn i wide-type mus [9]. Disse data antyder at MT2A realiserer negative kontroll av transkripsjonsfaktor NF-kB aktivitet, men dens rolle i mage karsinogenese er fortsatt uklar [16] -. [18]
Aberrant aktivering av NF-kB er assosiert med celle inflammasjon, malignitet og tumorprogresjon [7, 19]. Den funksjonelle aktivitet av NF-kB inhiberes gjennom binding til sin inhibitor, IkB-α. Aktivering av NF-kB er et resultat av proteasom-mediert nedbrytning av IicB-α ved fosforylering av inhibitoren (p-IkB-α), noe som antyder at NF-kB veien er et potensielt mål for individuell behandling [20] - [23] .
Noen bevis indikerte at økt MT2A uttrykk er viktig for kreft progresjon, og MT2A er i utgangspunktet foreslått som et proto-onkogen i bryst, esophageal, prostata, og eggstokk-kreft, assosiert med malignitet og dårlig prognose [24] - [27 ]. I motsetning til dette er det nedregulert i gastrointestinale svulster og hepatocellulært karsinom, hvor MT2A enten omvendt korrelert eller relatert til dødelighet [28, 29]. Imidlertid variasjonen av MT2A og klinisk evaluering forblir motstrid i GC [28, 30, 31]. Disse resultatene tyder på at feilregulering av MT2A er involvert i tumor patogenesen, selv om den eksakte rolle er fortsatt uklart i GC.
Derfor fokuserte vi å avdekke co-uttrykk for MT2A og IkB-α genet korrelert med kliniske patologiske funksjoner og utfall i stor skala av mage svulster med langsiktige oppfølgingsdata. Videre har vi analysert systematisk rolle MT2A som en stress protein og negativ regulator i NF-kB aktivering å karakterisere sin biologiske rolle og molekylære mekanismen in vitro Hotell og in vivo
. Metoder
Pasient egenskaper
Gastric tumorprøver fra 684 GC pasienter behandlet ved Beijing Cancer Hospital 1997-2007 ble vurdert. Pasientene inkludert 513 menn (75,0%) og 171 kvinner (25,0%) med en gjennomsnittsalder ved diagnose av 54 år (range, 19 til 81 år). Den oppfølgingsperioden varierte fra 1 til 127,2 måneder (median, 34,2 måneder). Alle pasientene gjennomgikk radikal reseksjon med kurativ hensikt. Ingen av pasientene hadde fått neoadjuvant kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Inklusjonskriterier for alle pasientene er: (a) en særegen GC diagnose basert på den sjette utgave av tumor-node-metastase (TNM) klassifikasjon av International Union mot GC, (b) en radikal reseksjon, (c) passende formalinfikserte, parafin innebygd vev. Summen av 684 GCer hadde clinicopathological data (betegnet som "kohort"). Videre ble et sett av 258 kvalifiserte prøver samlet inn fra kohort med 10-års oppfølgingsdata (betegnet som "undergruppe"). Det kliniske resultatet av pasientene ble spilt inn fra dato for operasjonen til dødsdato. I tillegg ble 118 intestinal metaplasi (IM) og 171 normal gastrisk vev oppsamlet fra disse GC pasientene. Histologisk Evalueringen ble utført av tre senior patologer. Den demografiske fordelingen av kohorten og undergruppe er oppført i Tilleggs tabell 1. Dessuten ble 36 sammenkoblede mage svulster med tilstøtende normalt vev males til et pulver under flytende nitrogen for RT-PCR og Real-Time PCR av MT isoformer (Tilleggs fil1). Tabell 1 logistisk regresjonsanalyse av clinicopathological funksjoner og prognose i GC
variates
No. av tilfellene (n = 258)
Survival tid (måned)
P
-verdi
Sex
Mann fra 186
66,4 ± 4,6
Kvinne
72
54,1 ± 4,8
0,604
Alder ved diagnose
< 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM stadium
jeg
34
105,5 ± 7,7
jeg vs. IV
< 0.001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs. IV
< 0.001
III
115
49,1 ± 3,4
III kontra IV
0,010
IV
52
35,8 ± 4,1
Tumor dybde
PT1
13
87,2 ± 9,9
PT1 vs. pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 vs. pT4
< 0.001
pT3
157
49,1 ± 2,9
pT3 vs. pT4
0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
lymfeknutestatus
pN0
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs. pN3
0,001
PN1
115
50,5 ± 3,4
PN1 vs. pN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
pN2 vs. pN3
0,326
pN3
16
47,5 ± 12,6
Distant metastase
pM0
232
67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8
< 0.001
grad av differensiering
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A uttrykk
< 0.001
lav
202
53,9 ± 3,4
høy
56
86,9 ± 9,2
IkB-α uttrykk
lav
164
61,6 ± 4,9
høy
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-IkB-α uttrykk
lav
126
74,1 ± 5,3
høy
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: ingen fjernmetastaser; M1: fjernmetastaser,
D1: godt /moderat differensierte GCer; D0: dårlig differensierte GCer
Immunhistokjemisk analyse
IHC-farging i vevet matrise ble utført med MT2A antistoff. (1: 100 fortynning, 18-0133, Invitrogen, CA, USA), p-IkB-α antistoff (1 : 200 fortynning, ab47752, Abcam, Cambridge, UK), IkB-α-antistoff (1: 300 fortynning, sc-371, Santa Cruz Biotechnology, California). For hver biomarkør, ble bildene scoret visuelt av tre patologer som ble blindet klinisk utfall. Avvik ble løst ved konsensus. Skår ble tildelt som en prosentandel av positiv farging i hver sylinder. Gjennomsnittlig prosentverdi av de to kjernene ble beregnet til å representere en svulst (Tilleggs fil1).
Cellelinjer
magekreft cellelinjer BGC823, MGC803, SGC7901 og PAMC82 ble etablert i Kina og kjøpt fra vevet bank av Shanghai (Shanghai, Kina). Spesielt BGC823 celler utstilt høy tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 og SNU-16 cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA). GES-1, en immortalisert human gastrisk epitelial cellelinje, ble generert av SV40 viralt transfeksjon ved Beijing Cancer Hospital og dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO 2 [32].
MTT og myk-agar assay
cellene ble sådd på 96-brønners kulturplater, og MTT ble tilsatt til cellene ved 1-5 dager. MTT (5 ug /ml) ble fjernet etter 4 timers inkubering, og deretter dimetylsulfoksyd (DMSO) ble tilsatt for å oppløse det formazanprodukt. Absorbansen ved 490 nm /570 nm ble bestemt ved en mikroplateleser (Bio-rad680 ELISA). Cellene ble deretter inkubert i 4 uker, farget med vital tetrazolium fargestoff INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) for å dokumentere nærvær eller fravær av levedyktige cellekolonier. Den myke agar ble fiksert med 100 pl metanol-eddiksyre. (3: 1 vol /vol) og koloniene ble tellet
tumorgenisitet assay
BGC823-celler (5 x 10 5-celler suspendert i 0,1 ml PBS) transfektert med MT2A over-uttrykt vektor eller tom vektor ble injisert subkutant i rygg flanken av fem 4-ukers gamle Balb /C hårløse mus (MT2A-uttrykk kloner på høyre side og vektorkontroll kloner til venstre. Tumor diameter ble målt og dokumentert hver 5. dag tumor~~POS=TRUNC volumet~~POS=HEADCOMP ble beregnet i henhold til formelen ab 2/2 (a > b)... Ved slutten av 25 dager ble alle musene avlivet og tumorvolumet ble målt Tre uavhengige eksperimenter ble utføres og ga lignende resultater. dyrene ble opprettholdt i anlegg som er godkjent av foreningen for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care i samsvar med gjeldende regelverk og internasjonale standarder.
Statistisk analyse
χ
2 test statistikk og Student t
-test ble brukt for å sammenligne forbehandling karakteristikker av pasienttilfeller. Den kreft-relaterte overlevelse ble analysert ved anvendelse av Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved hjelp av log-rank-tester. Den Spearman rank test og Fishers eksakte test ble brukt for å demonstrere clinicopathological sammenhenger. En Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell ble brukt med tilhørende 95% konfidensintervall (CIS) og P
verdier. Alle statistiske tester var tosidig, og P
verdier på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av statistikkpakken SPSS (versjon 16.0, SPSS Inc, Chicago, IL).
Studer godkjenning
Alle dyrestudier ble godkjent av etikkomiteen av Peking University Cancer Hospital. Bruken av menneskelig vev og kliniske data ble i henhold til retningslinjene fra sykehuset og er godkjent av den lokale etiske komiteen.
Resultater
Redusert MT2A uttrykk er en molekylær hendelse i cellelinjer og primære svulster i GC
Expression av MT2A ble evaluert ved hjelp av RT-PCR og Western blot i et panel av GC cellelinjer og GES1, som tjente som "normal kontroll". Som vist i figur 1A, MT2A mRNA varierte betydelig med de høyeste nivåene i GES1. Mangel eller reduksjon av MT2A ekspresjon ble observert i BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 og N87-celler. Proteininnholdet av MT2A uttrykk ble videre påvist i de seks vanligste brukt GC cellelinjer (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, og MKN45) sammenlignet med GES1. Western blot analyse viste at, i de seks vanlig anvendte GC-cellelinjer, nivåene av MT2A ekspresjon var fraværende eller lav sammenlignet med GES1, i samsvar med mRNA-ekspresjon detektert ovenfor (figur 1B). Spesielt BGC823, MGC803 og SGC7901 celler med mangel på MT2A uttrykk utviser høy tumorigenecity i nakne mus. Figur 1 Fraværende eller redusert ekspresjon av MT2A påvises i cellelinjer og primære tumorer i GC. A, MT2A mRNA-nivået ble målt ved hjelp av RT-PCR i GC cellelinjer og den normale udødelig cellelinje-GES1. Og semi-kvantifisering analyser ble utført med Imagetool 3,0 gråskala skanning programvare (normalisert til p-aktin nivåer). Forsøket ble utført i tre eksemplarer. B, ble MT2A proteinnivå bestemt ved Western blot-analyse i GC-cellelinjer og den normale udødelig cellelinje-GES1. De MT2A proteinbånd ble skannet (normalisert til p-aktin nivåer). C, Differensial uttrykk for MT2A mRNA-transkript i 36 sammenkoblede GC vev og tilstøtende normalt vev. De MT2A mRNA båndene ble skannet (normalisert til p-aktin nivåer). D, MT2A protein nivåer ble påvist i 36 sammenkoblede GC vev ved Western blotting. De MT2A proteinbånd ble skannet (normalisert til p-aktin nivåer). E, Redusert MT2A ble observert under mage malign transformasjon. (A) intens farging av MT2A i normale vev, (b) moderat farging av MT2A i IM vev, (c) svak farging av MT2A i moderat differensierte primære mage cancer og (d) negativ ekspresjon av MT2A i dårlig differensiert GCer (opprinnelig forstørrelse × 400). (D) Sammenlignet med normale og forstadier til kreft-IM prøver, redusert MT2A var en vanlig molekylær hendelse i magekreftutvikling (P
< 0,001) F: Differential uttrykk for MT2A i GC, IM og normalt vev ved IHC farging. Negativt: poengsum 0; Svak: scorer 1-4; Sterk: scorer 5-12. For detaljer, se Tilleggs fil1.
36 primære svulster i GC med tilstøtende normalt vev ble også undersøkt i figur 1C og D, for å bekrefte resultatene stammer fra GC cellelinjer, redusert MT2A mRNA ble vist i GCer sammenlignet med i matchet normale kontroller (27/36, 75,0%, P
< 0.001, figur 1C). Lav uttrykk for MT2A protein ble påvist i 29 av 36 GC tilfeller (80,6%) sammenlignet med matchede normalt vev (P
< 0,001, figur 1D). MRNA nivået av MT2A ble korrelert til proteinnivået detektert ved Western blot (R = 0,510, P
= 0,009). Hos mennesker blir mts kodet av en familie av gener som består av 10 funksjonelle MT-isoformene, og de kodede proteinene blir vanligvis oppdelt i fire grupper, MT1, MT2, MT3, og MT4-proteiner. Siden de kodende regioner i MT isoformer er høyt konservert i transkripsjon og proteinnivåer, er MT2A svært homolog med MT1G, MT1E og MT1F (tilleggsfiler 1: Figur S1B). Derfor bør eksperimenter på en hvilken som helst individuell isoform omhyggelig utført for å sikre at den nøyaktige isoformen er analysert. I denne studien, differensial uttrykk for MT1 transkripsjoner ble observert i GC cellelinjer og primære svulster i GC med tilstøtende normale kontroller (n = 36) (tilleggsfiler 1: Tall S1 A og S2). Vi autentisert faktisk MT2A gen ned-regulering i GC betydelig sammenlignet med tilstøtende normale vev (27/36, 75%, figur 1C). Det var ingen forskjell på MT1E og MT1F og MT1G mRNA transkripter i normal og tumorprøver samt MT1B mRNA transkripsjon var ikke påvises i alle celler og vev (Tilleggs fil 1: Tall S1A og S2).
Å undersøke kandidatur MT2A i mage tumorigenesis, vi først preget status MT2A uttrykk i 171 normalt vev, 118 IM og 684 GC prøver av IHC farging. Antistoffet for MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) er ikke spesifikk for MT-2A bare, og kryss-reagerer med MT-en til en viss grad, selv om den er klonet ved den fulle lengden av MT2A. Siden det ikke er bestemt antistoff for å oppdage MT2A, så vi bruker den felles handels antistoff for IHC farging som ble publisert i de fleste relaterte studier, er MT2A uttrykk klassifisert som lav og høy uttrykk i normale utseende vev, IM, og primær GCer. Høyt nivå av MT2A ekspresjon ble påvist i 153 av 684 (22,4%) GC tilfeller, og 60 av 118 (50,8%) IM tilfeller, så vel som 130 171 (76,0%) normalt utseende tilfeller, henholdsvis (Tilleggs fil1: Tabell S3 P
< 0,001), det var besto med MT2A mRNA transkripter og protein uttrykk ved Western blot. Ekspresjon av MT2A ble klassifisert som negative, svake og sterke tilfeller i 13 (7,6%), 28 (16,4%) og 130 (76,0%) av 171 normale vev, henholdsvis; I IM vev, 27 (22,9%), 31 (26,3%) og 60 (50,8%) av 118 IM tilfellene ble oppdaget henholdsvis; I GC prøver, 494 (72,2%), 37 (5,4%) og 153 (22,4%) av 684 GC tilfeller ble påvist henholdsvis (figur 1F, Gjeste fil1). Det var et gradvis redusert uttrykk for MT2A protein i IM og GC (P
< 0,001, figur 1E og F). Det er klart at MT2A mRNA ble sterkt uttrykt i GES1 celler og normale vev, men ble redusert eller tapt i de fleste GC-celler og vev. Disse resultatene tyder på at redusert MT2A er en molekylær hendelse i tumorigenese og progresjon.
MT2A ekspresjon er korrelert med dårlig prognose i GC
MT2A var ofte nedregulert i GC. For å undersøke om MT2A uttrykk var en prognostisk faktor i menneskelig GC, ble MT2A protein uttrykk undersøkt i undergruppen av IHC farging. De enkelte prøver ble kategorisert som lav (MT2A-) eller høy uttrykket (MT2A +). MT2A- var assosiert med dårlig total overlevelse (figur 2A, P
< 0,001). Univariat analyse indikerte at enkelte faktorer, inkludert redusert MT2A uttrykk (P
< 0,001), TNM stadium (P
< 0,01), tumor dybde (P
< 0,05), lymfeknutestatus (P
< 0,05), fjernmetastaser (P
< 0,001) og grad av differensiering (P
= 0,011) ble korrelert med dårlig overlevelse (tabell 1). Cox multivariat analyse viste at total overlevelse var assosiert med MT2A uttrykk (MT2A + versus MT2A- hazard ratio [HR], 0,429, 95% CIS, 0,187 til 0,683; P
= 0,002, Tabell 2). Vi estimerte potensialet kliniske betydningen av MT2A ved å korrelere sitt uttrykk mønster med de kliniske parametre (Tilleggs fil1: Tabell S4). MT2A utstilt en omfattende positiv korrelasjon med tumor differensiering (P
< 0,001) og invers korrelasjon med TNM stadium (P
= 0,05). Disse resultatene indikerer at MT2A er korrelert med kliniske patologiske funksjoner og overlevelse i GC pasienter. Figur 2 Analyse av kombinert MT2A med TNM stadium å forutsi klinisk utfall i GC. Kaplan-Meier analyse av total overlevelse for MT2A uttrykk ble brukt i henhold til TNM stadium. A, prognostisk verdi av MT2A uttrykk i GC pasienter var fordel for å forutsi utfallet av pasienter, lav uttrykk for MT2A var assosiert med dårlig total overlevelse (P <
0,01); B, TNM stadium var fordel for den prognostiske prediksjon i GC pasienter. C D, prognostisk verdi av MT2A i TNM stadium I-II og stadium III-IV (P
= 0,048, P <
henholdsvis 0,001,); E F, prognostisk verdi av MT2A uttrykk i lymfeknutemetastase eller ikke (P
< 0,001, P
= 0,052, henholdsvis); G. prognostisk verdi av MT2A uttrykk på ingen fjernmetastaser gruppen (n = 232, P
< 0,001); H. prognostisk verdi av MT2A i pT3-pT4 gruppen (P
< 0,001). Alle data antyder at MT2A kunne være en effektiv prognostisk signatur.
Tabell 2 Cox regresjonsanalyse av clinicopathological funksjoner og molekylære signaturer i GC
Multivariatanalyse
kovariat ved endepunktet

Hazard ratio
95% KI
P-
verdi
Alder ≥ 60 år
1.300
0,840 til 1,934
0,254
Sex
0,823
0,499 til 1,233
0,292
Differensiering
0,753
0,509 til 1,778
0,875
Tumor invasiv dybde
1,914
1,389 til 2,638
< 0.001
lymfeknutestatus
1,291
1,034 til 1,612
0,024
Distant metastase
2,595
1,332 til 5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187 til 0,683
0.002
IkB-α
0,779
0,524 til 1,311
0,423
p-IkB-α
1,857
1,256 til 2,912
0,003
Prognostic betydningen av MT2A kombinert med TNM stadium i GC pasienter
for ytterligere å belyse MT2A uttrykk i prognostisk betydning, kombinert vi MT2A uttrykk med clinicopathological funksjoner i GC. Målet var å vurdere prognosen for GC pasienter med patologisk klassifisering, og for å undersøke om patologisk bør klassifiseres videre sub-klassifisert for mer nøyaktig prediksjon av utfallet. Som vist i Tilleggs fil1: Tabell S4, MT2A uttrykk i GC var assosiert med TNM stadium og tumor differensiering, noe som tyder på at MT2A kan være en potensiell molekylær biomarkør å forutsi patologisk klassifisering i GC. Som dikotome kovariater, både MT2A og TNM stadium var uavhengige prediktorer for overlevelse (tabell 2, figur 2A og B). Prognostisk betydning MT2A uttrykk ble videre analysert i GC pasienter i henhold til pTNM klassifiseringssystemet. Det var en signifikant forskjell i total overlevelse mellom pasienter med MT2A uttrykk i både tidlig (I og II) og avansert (III og IV) scenegrupper (P
= 0,048 og P
< 0,001, henholdsvis Figur 2C og D). Videre MT2A uttrykk status var også effektivt for prognosen i de samme stadier (P
= 0,052, figur 2E; P
< 0,001, figur 2F; P
< 0,001, figur 2G og P
< 0,001, Figur 2 H). Disse data bekrefter at MT2A er en molekylær signatur å forutsi klinisk utfall basert på TNM stadium.
Restaurering av MT2A uttrykk resultater i vekst undertrykkelse av GC-celler in vitro Hotell og in vivo
å avdekke mekanismen av MT2A i GC, vi stabilt transfektert MT2A over-uttrykt plasmid og tom vektor inn i tre GC-cellelinjer (BGC823, SGC7901 og AGS). Vi undersøkte vekst, apoptose hastigheter og cellesyklus av disse cellelinjene transfektert med plasmid MT2A. Celleviabilitet ble redusert i GC-celler gjen uttrykker MT2A hjelp MTT analysen (BGC823, P
= 0,0038, figur 3B, AGS, P
= 0,0007, Gjeste fil1: Figur S3A; SGC7901, P
= 0,0004 , Gjeste fil1: Figur S3C). For ytterligere å undersøke funksjonen av MT2A i GC-cellelinjer, analyserte vi effektene av MT2A uttrykk på celleformering og cellesyklusregulering av Annexin V-/PI farging og strømningscytometri-analyse. Mer apoptose ble påvist i disse cellene GC re-uttrykk MT2A (P
< 0,01, henholdsvis figur 3F, ytterligere fil1: Fig S3A og C). Videre ble G2 /M arrest observert i GC celler ved hjelp av ektopisk uttrykk for MT2A. Forholdene av G2 /M fase i MT2A grupper var to ganger høyere enn de i koblingsgrupper gjorde (P
< 0,01, henholdsvis figur 3E og Tilleggs fil1: Fig S3b og D). Figur 3 ektopisk ekspresjon av MT2A hemmer GC-celler vekst in vitro og in vivo. MT2A hemmet celleproliferasjon og kolonidannelse i menneske GC-celler. A, Western blot av MT2A ble påvist i BGC823 celler transfektert med ektopisk ekspresjon av MT2A plasmid og tom vektor. De MT2A proteinbånd ble skannet (normalisert til p-aktin å kontrollere for lasting). B, Celleformering ble analysert ved MTT-assayet i re-uttrykkende MT2A av BGC823 celler eller ikke. Data ble vist som gjennomsnitt ± .SD av tre uavhengige eksperimenter. C, Vekst av BGC823-celler ble analysert i en halvfast myk agar medium. De tomme vektor Koloniene dannet statistisk signifikant flere kolonier (gjennomsnitt = 426 store kolonier per plate 95% cis:. 387-472 kolonier) enn MT2A kloner (gjennomsnitt = 136 kolonier 95% cis:.. 100-164 kolonier Tallene representerer gjennomsnittet antall kolonier av tre uavhengige forsøk ± SD Den relative tall ble beregnet i kontroll- og BGC823-MT2A celler, og analysert ved hjelp av Student t
-test (P
= 0,0038). D, MT2A-hemmet tumorigenicity av BGC823 celler . i nakne mus gjennomsnittlig tumorvolum for BGC823-MT2A ved 3 uker etter injeksjon var 112 mm3 (95% cis: 93-147 mm3), sammenlignet med 352 mm3 (95% cis: 298-423 mm3) for BGC823-vektor. data representerer gjennomsnittet ± SD av tumorvolum utledet fra hver gruppe. i hver gruppe, ble svulststørrelser målt ved anvendelse av en målepunktet ved de indikerte tidspunkter. data ble vist som gjennomsnitt ± SD (t-
test påvisning, P
= 0,0027) E, FACS-analyse viste at MT2A over-uttrykk førte til G2 /M arrest, og forholdet mellom G2 /M fase var høyere enn i tomme kontroll og foreldreceller (P <
0,01). F, Antitumoreffekt av MT2A ble påvist ved annexin V /FITC-PI farging analysen. Andel apoptotiske celler var 52,9% ± 5,4% i MT2A gruppen sammenlignet med det i de overordnede cellene (8,3% ± 2,4% og celler transfektert med tom vektor (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Videre vi belagt BGC823 celler repressing MT2A eller ikke i myk agar, ble ektopisk uttrykk for MT2A bekreftet av western blot analyse først (figur 3A). etter 3 uker med kultur MT2A uttrykk forårsaket en statistisk signifikant reduksjon i kolonidannelse (P
= 0,0053, figur 3C). Videre var det en dramatisk vekst inhibering av MT2A-re-uttrykkende celler, sammenlignet med den negative kontroll (P
= 0,0027, figur 3D) i de xenograft-modeller. Disse data viser at MT2A kan spille en rolle i å undertrykke spredning av GC-celler in vitro Hotell og in vivo
.
MT2A undertrykker NF-kB aktivitet gjennom IkB-α oppregulering
det ble rapportert at tapet av MT2A indusert NF-kB signal aktivering i transgene mus modell (MT2A-knock out) [15]. Men rollen som MT2A som en venn eller fiende i NF-kB signalveien var fremdeles kontroversiell [18, 33]. For å tolke mekanisme MT2A mediert GC cellevekst undertrykkelse in vivo Hotell og in vitro
, prøvde vi å undersøke mulighetene forholdet mellom MT2A og NF-kB signalveien, og den indre mekanismen var fortsatt uklart i GC . MT2A og hoved gener i NF-kB-signalering, så som p65, IkB-α, p-IkB-α og nedstrøms effektor av NF-kB-signalering, cyklin D1 ble påvist i denne studien (Tilleggs fil1). Ektopisk uttrykk for MT2A indusert både mRNA og protein uttrykk for IkB-α i alle undersøkte GC cellelinjer (BGC823, SGC7901 og AGS), ble IkB-α mRNA likevektsnivåer økt 5,5 ganger i BGC823 celler re-uttrykke MT2A for 48 h. I AGS og SGC7901 celler, observerte vi en 7,2-ganger og 4,3 ganger induksjon av IkB-α mRNA (figur 4A), den relative proteinnivåene var i samsvar med mRNA-transkripter, og den p-IkB-α protein ble redusert i de GC -celler transfektert MT2A vektor (figur 4B). Som vist i figurene 4C og D, knockdown av endogent MT2A i GES1 celler førte til nedregulering av IkB-α ekspresjon, så vel som opp-regulering av p-IkB-α og cyclin D1 ekspresjon, noe som tyder på en sammenheng mellom MT2A aktivitet og IkB -α uttrykk. Disse eksperimentene indikerer at MT2A induserer IkB-α ekspresjon i mRNA og proteinnivåer. Og MT2A-mediert oppregulering av IkB-α ekspresjon ble ytterligere bekreftet ved immunofluorescens (figur 5A, Ytterligere fil1). For å klargjøre mekanismen for MT2A på IkB-α uttrykk, utførte vi luciferase reporter-analyser ved restrukturering av IkB-α promoter-regionen, 5,6-fold oppregulering av IkB-α promoter luciferaseaktivitet ble funnet i MT2A gruppe enn i vektor gruppe ( Tabell S2. Tabell S3. Tabell S4. Tabell S5. Tabell S6. Figur S1. Figur S2. Figur S3. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Uttrykk for COX-2 og VEGF-C i magekreft: korrelasjoner med lymphangiogenesis og prognostisk implications
• Nedregulering av SPARC uttrykk reduserer magekreft celleinvasjon og overlevelse