Métallothionéine 2A inhibe l'activation de la voie NF-kB et prédit les résultats cliniques distincts avec le stade TNM chez les patients atteints de cancer gastrique suivant resection

radical métallothionéine 2A inhibe l'activation de la voie NF-kB et prédit les résultats cliniques distincts avec le stade TNM chez les patients atteints de cancer gastrique après résection radicale
Résumé
fond
métallothionéine 2A (MT2A) comme une protéine de stress, joue un rôle protecteur dans l'estomac barrière muqueuse. Son rôle dans le développement du cancer gastrique (GC) est incertain. Le mécanisme de MT2A sera étudiée dans la tumorigenèse gastrique.
Méthodes de MT2A expression a été détectée dans 973 échantillons gastriques. La fonction biologique a été déterminé par ectopique MT2A exprimant in vitro et in vivo

. Les éventuelles effecteurs en aval de MT2A ont été étudiés dans la signalisation de NF-kB. Les niveaux de MT2A, IKB-α et p-IKB-α protéines (Ser32 /36) expression ont été analysés dans un sous-ensemble de 258 patients par coloration IHC. Les effets pronostiques de MT2A, statut de IkB-α et le stade TNM ont été évalués selon la méthode de Kaplan-Meier et comparées en utilisant le test du log-rank
Résultats
diminution de l'expression MT2A a été détectée dans des lignées cellulaires et les tumeurs primaires de. GC. Dans les données cliniques, la perte de MT2A (MT2A + Normal (n = 171, 76,0%); Intestinal métaplasie (n = 118, 50,8%); GC (n = 684. 22,4%, P
< 0,001)) a été associée à un mauvais pronostic (P
< 0,001), le stade TNM avancé (P
= 0,05), et la régulation de la IKB-α expression (P
< 0,001). En outre, MT2A a été la signature pronostique indépendant distincts du statut de IkB-α et les caractéristiques pathologiques. En outre, MT2A a inhibé la croissance cellulaire par apoptose et G2 /M arrêté, qui régulait négativement voie NF-kB par l'intermédiaire Conclusions de la régulation de la IkB-α et la régulation négative de p-IkB-α et de la cycline D1 expression.
MT2A pourrait jouer une activité suppressive de tumeur par inhibition de la signalisation NF-kB et peut être un biomarqueur pronostique et cible potentielle pour le traitement individuel des patients du GC.
Mots-clés
métallothionéine 2A NF-kB signalisation cancer gastrique Pronostic TNM stade fond
Quoi de neuf
Abondance de métallothionéine 2A (MT2A) présente dans la barrière de la muqueuse gastrique, mais son rôle dans la progression du cancer gastrique (GC) est encore peu clair. Dans cette analyse de 171 tissus normaux gastriques, 118 métaplasie intestinale, et 684 cancers gastriques primaires, a diminué MT2A était significativement corrélée à un mauvais pronostic. Il inhibe la prolifération des cellules par CPG signalisation NF-kB inactivation. Ces résultats indiquent que MT2A peut être un marqueur pronostique important et cible thérapeutique pour GC.
Cancer gastrique (GC) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et demeure un fardeau important du cancer en Asie, notamment en Chine [1, 2]. La plupart des patients subissant une chirurgie du GC sont déjà à un stade avancé et la survie à 5 ans est varié. Plusieurs facteurs histologiques ont été signalés comme des facteurs pronostiques de GC, y compris la taille de la tumeur, la classification de l'OMS, la tumeur-node-métastases (TNM) système de stade, et la différenciation de qualité [3, 4]. Cependant, le pronostic des patients atteints de GC au même stade est toujours incompatible [5]. Par conséquent, l'identification de marqueurs diagnostiques spécifiques et cible thérapeutique permettrait une prévision fiable, extension effective de la survie post-opératoire et la qualité de vie des patients [6].
Le stress cellulaire a été montré à jouer un rôle dans la régulation moléculaire de la cancérogenèse [7, 8]. Métallothionéines (MTs) comme les protéines de stress à faible poids moléculaire et riche en cystéine ont la capacité d'une forte affinité pour les ions métalliques et les charognards ROS. MT2A comme l'isoforme principale de MTs joue un rôle important dans l'estomac barrière muqueuse chez les patients souffrant de gastrite et de rongeurs modèles [9, 10]. Pré-administration de MT2A exogène ou pré-induction de MT2A endogène peut protéger l'estomac et le foie contre les dommages induits par le stress et inhiber la formation de stress induit par le peroxyde lipidique, ce qui implique un effet protecteur de MT2A sur la pathogenèse induite par le stress et une cible thérapeutique potentielle appliquée pour la prévention précoce [11] - [13]. Récemment, MT2A joue un rôle important dans la tumorigenèse et la progression des cancers multiples comprenant GC [14]. La perte d'un gène MT2A prédisposés à des souris hépatocarcinogenèse diéthylnitrosamine-induite par l'activation de gènes cibles NF-kB, ce qui démontre que MT2A protège les souris contre les dommages et la carcinogenèse hépatique induite par hépatocarcinogène, soulignant son potentiel thérapeutique contre le cancer hépatocellulaire [15]. Certaines études ont porté sur le rôle des MT2A dans la protection contre les lésions gastriques induite par H. pylori en utilisant des souris de MT-nulles. Himeno, S. a découvert que l'activation de NF-kB et l'expression de chimiokines NF-kB à médiation par des cellules gastriques étaient nettement plus élevés chez les souris nulles pour MT2A que chez les souris de type large [9]. Ces données impliquent que MT2A réalise un contrôle négatif du facteur de transcription de l'activité de NF-kB, mais son rôle dans la carcinogenèse gastrique est encore ambiguë [16] - [18]. Activation
aberrante de NF-kB est associée à une inflammation cellulaire, une tumeur maligne et la progression tumorale [7, 19]. L'activité fonctionnelle de NF-kB est inhibée par la liaison à l'inhibiteur IkB-α. L'activation de NF-kB est résulté de la dégradation par le protéasome de IkB-α par la phosphorylation de l'inhibiteur (p-IkB-α), ce qui suggère que la voie NF-kB est une cible potentielle pour une thérapie individuelle [20] - [23] .
Certaines données indiquent que l'expression accrue MT2A est important pour la progression du cancer, et MT2A est initialement proposé comme un proto-oncogène dans le sein, de l'œsophage, de la prostate et cancers de l'ovaire, associé à la malignité et de mauvais pronostic [24] - [27 ]. En revanche, elle est régulée à la baisse dans les tumeurs gastro-intestinales et des carcinomes hépatocellulaires, où MT2A est soit inversement corrélé ou non à la mortalité [28, 29]. Cependant, la variation de MT2A et son évaluation clinique reste contradictoire en GC [28, 30, 31]. Ces résultats suggèrent que la dysrégulation de MT2A est impliquée dans la pathogenèse de la tumeur, bien que le rôle exact ne sait pas encore dans GC.
Par conséquent, nous nous sommes concentrés pour révéler la co-expression de MT2A et le gène IKB-α en corrélation avec les caractéristiques et les résultats cliniques pathologiques à grande échelle des tumeurs gastriques avec des données de suivi à long terme. En outre, nous avons analysé systématiquement le rôle de MT2A comme une protéine de stress et d'un régulateur négatif de l'activation de NF-kB pour caractériser son rôle biologique et le mécanisme moléculaire in vitro et in vivo

. Les caractéristiques des patients de méthodes échantillons de tumeurs gastriques
de 684 patients GC traités à l'hôpital du cancer de Beijing de 1997 à 2007 ont été évalués. Les patients inclus 513 hommes (75,0%) et 171 femmes (25,0%) avec un âge moyen au moment du diagnostic de 54 ans (extrêmes, 19 à 81 ans). La période de suivi variait de 1 à 127,2 mois (médiane, 34,2 mois). Tous les patients ont subi une résection radicale à visée curative. Aucun des patients avaient reçu une chimiothérapie néo-adjuvante ou de la radiothérapie avant la chirurgie. Les critères d'inclusion de tous les patients est: (a) un diagnostic de GC distinctif fondé sur la sixième édition de la tumeur-node-métastases (TNM) classification de l'Union internationale contre le GC, (b) une résection radicale, (c) adapté fixés au formol, tissus de paraffine. Le total de 684 GCS avait les données clinico (appelées aussi «cohorte»). En outre, un ensemble de 258 échantillons admissibles ont été collectées à partir de la cohorte des données de suivi de 10 ans (nommé comme «sous-ensemble»). Le résultat clinique des patients a été enregistré à partir de la date de la chirurgie à la date du décès. En outre, 118 métaplasie intestinale (GI) et 171 tissus gastriques normaux ont été prélevés sur ces patients du GC. L'évaluation histologique a été réalisée par trois pathologistes supérieurs. La répartition démographique de la cohorte et sous-ensemble est répertorié dans le tableau complémentaire 1. Par ailleurs, 36 tumeurs gastriques appariés avec les tissus normaux adjacents a été broyé en une poudre sous azote liquide pour la RT-PCR et PCR en temps réel des isoformes MT (de file1 supplémentaires). Tableau 1 analyse de régression logistique des caractéristiques clinico et le pronostic en GC
Taxipost
No. des cas (n = 258)
Survival temps (mois)
P
-value
Sex
Homme
186
72
54,1 ± 4,8
0,604
Age 66,4 ± 4,6
Femme au moment du diagnostic
< 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
étape 85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM
I
34
105,5 ± 7,7
I ou IV
< 0,001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs IV
< 0,001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs IV
0,010
IV
profondeur 52
35,8 ± 4,1
Tumor
pT1
13
87,2 ± 9,9
pT1 vs. pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 vs pT4
< 0,001
pT3
157 38
40,1 ± 5,3
ganglionnaire état
pN0
49,1 ± 2,9
pT3 vs pT4
0,159
pT4
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs 0,212
pN2 0.001
pN1 de pN3
115
50,5 ± 3,4
pN1 vs. pN3
49
46,6 ± 6,0
pN2 contre 16
47,5 ± 12,6 métastase
Distant de 0,326
pN3 de pN3
pM0
232
67,5 ± 4,3
pM1
26
27,6 ± 5,8
< 0,001
Degré de différenciation
D1
54
76,0 ± 6,0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A expression de D0
< 0,001
faible
202
53,9 ± 3,4
haute
expression 56
86,9 ± 9,2
IKB-α
bas
164
61,6 ± 4,9
haute
94
64,9 ± 5,1
0,248
expression p-IKB-α
faible
126
74,1 ± 5,3
haute
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: pas de métastases à distance; M1: métastases à distance;
D1: bien /GCS modérément différenciées; D0: GCS mal différenciées analyse immunohistochimique
coloration IHC dans le tableau de tissu a été effectuée avec un anticorps MT2A. (Dilution 1: 100; 18-0133, Invitrogen, CA, US) anticorps, p-IKB-α (1 : 200 dilution; ab47752, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), l'anticorps IKB-α (dilution 1: 300; sc-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). Pour chaque biomarqueur, les images ont été marqués visuellement par trois pathologistes qui ont été aveuglés à l'issue clinique. Des écarts ont été résolus par consensus. Les scores ont été assignés en tant que pourcentage de coloration positive dans chaque cylindre. La valeur moyenne des deux noyaux de pourcentage a été calculé pour représenter une tumeur (file1 supplémentaires).
Lignées cellulaires
lignées cellulaires de cancer gastrique BGC823, MGC803, SGC7901 et PAMC82 ont été établis en Chine et achetés auprès de la banque de tissus de Shanghai (Shangai, Chine). Surtout, les cellules BGC823 exposées haute tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, lignes RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 et SNU-16 cellules ont été achetées auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA). GES-1, une ligne immortalisés gastrique humaine des cellules épithéliales, a été généré par SV40 transfection virale à l'hôpital du cancer de Beijing et cultivées dans un milieu DMEM additionné de 10% de sérum de veau fœtal (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 [32] de. MTT et dosage en gélose molle
les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture à 96 puits, et on a ajouté du MTT aux cellules à 5/1 journées. MTT (5 pg /ml) a été éliminé au bout de 4 heures d'incubation, puis du diméthylsulfoxyde (DMSO) a été ajouté pour solubiliser le produit de formazan. L'absorbance à 490 nm /570 nm a été dosée par un lecteur de microplaque (Bio-rad680 ELISA). Les cellules ont été ensuite mises en incubation pendant 4 semaines, colorées avec vital INT colorant tétrazolium (de piodonitrotetrazolium, Invitrogen) pour documenter la présence ou l'absence de colonies de cellules viables. L'agar mou a été fixé à 100 méthanol-acide acétique ul.: Le dosage de la tumorigénicité de (3 1 vol /vol) et les colonies ont été comptées
BGC823 cellules (5 x 10 5 cellules en suspension dans 0,1 ml de PBS) transfectées avec MT2A surexprimé vecteur ou vecteur vide ont été injectés par voie sous cutanée dans le flanc dorsal de cinq 4 semaines d'âge clones Balb /C souris nude femelle (MT2A-expression de droite et de contrôle vectoriel clones sur la gauche. diamètre de la tumeur a été mesurée et documenté tous les 5 jours le volume tumoral a été calculé selon la formule suivante: AB 2/2 (a > b)... au bout de 25 jours, toutes les souris ont été sacrifiées et le volume tumoral a été mesuré trois expériences indépendantes étaient réalisée et a donné les mêmes résultats. les animaux ont été maintenus dans des installations agréées par l'association pour l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux en conformité avec les réglementations en vigueur et aux normes internationales.
analyse statistique
χ
2 statistiques de test et de Student t
-test ont été utilisés pour comparer les caractéristiques de prétraitement des cas de patients. La survie liée au cancer a été analysée en utilisant la méthode de Kaplan-Meier et comparées en utilisant des tests du log-rank. Le test de rang de Spearman et le test exact de Fisher ont été appliquées pour démontrer les corrélations clinicopathologiques. Un modèle de régression des risques proportionnels de Cox a été utilisé avec des intervalles associés à 95% de confiance (IC) et P
valeurs. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux et les valeurs de P inférieures à 0,05 étaient considérées comme statistiquement significatives. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel statistique SPSS (version 16.0, SPSS Inc, Chicago, IL).
Étudier l'approbation
Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'hôpital du cancer Université de Pékin. L'utilisation de tissus humains et de données cliniques a été selon les lignes directrices de l'hôpital et approuvé par le comité d'éthique local.: Résultats
diminution de l'expression MT2A est un événement moléculaire dans des lignées cellulaires et les tumeurs primaires du GC Expression de MT2A a été évaluée par RT-PCR et Western blot dans un panel de lignées cellulaires de GC et GES1, qui est servi comme «témoin normal». Comme le montre la figure 1A, MT2A ARNm varie considérablement avec les plus hauts niveaux de GES1. Le manque ou une diminution de l'expression MT2A a été observée dans BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 et les cellules N87. Le niveau d'expression de la protéine MT2A a également été détectée dans les six lignes communes utilisé GC cellulaires (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87 et MKN45) par rapport à GES1. L'analyse Western blot a montré que, dans les six lignées cellulaires GC couramment utilisés, les niveaux d'expression étaient absents ou MT2A faible par rapport à GES1, en accord avec l'expression d'ARNm détectée précédemment (figure 1B). Surtout, BGC823, MGC803 et SGC7901 cellules avec le manque d'expression MT2A présentent une forte tumorigenecity chez la souris nude. La figure 1 absent ou diminution de l'expression de MT2A est détectée dans des lignées cellulaires et des tumeurs primaires de la CPG. Un niveau MT2A ARNm est mesuré par RT-PCR dans des lignées cellulaires de GC et la lignée cellulaire immortelle-GES1 normale. Et les analyses semi-quantification ont été réalisées avec imagetool 3.0 logiciel de numérisation en échelle de gris (normalisée à des niveaux ß-actine). L'expérience a été effectuée en triple. B, la teneur en protéines MT2A a été déterminée par analyse par transfert de Western dans des lignées cellulaires de GC et la lignée cellulaire immortelle-GES1 normale. Les bandes de protéines ont été scannés MT2A (taux de ß-actine normalisée). C, L'expression différentielle de MT2A ARNm transcrit dans 36 tissus GC appariés et les tissus normaux adjacents. Les bandes MT2A ARNm ont été scannés (niveaux de ß-actine normalisés). D, les niveaux de protéine MT2A ont été détectés dans les 36 tissus GC appariés par Western blot. Les bandes de protéines ont été scannés MT2A (taux de ß-actine normalisée). E, Diminué MT2A a été observée au cours de la transformation maligne gastrique. (A) une coloration intense de MT2A dans les tissus normaux, (b) une coloration modérée de MT2A dans les tissus IM, (c) une faible coloration des MT2A dans les cancers gastriques primaires modérément différenciées et (d) de l'expression négative de MT2A dans des glucocorticoïdes mal différenciées (grossissement d'origine × 400). (D) En comparaison avec les échantillons normaux et lésions précancéreuses-IM, MT2A réduite a été un événement moléculaire commune dans la carcinogenèse gastrique (P
< 0,001) F: L'expression différentielle des MT2A en GC, IM et tissus normaux par coloration IHC. Négatif: score à 0; Faible: score 1-4; Strong: marquer 5-12. Pour plus de détails, voir le file1 supplémentaires.
36 primaires des tumeurs de GC avec les tissus normaux adjacents ont également été examinés à la figure 1C et D, pour confirmer les résultats obtenus à partir des lignées cellulaires de GC, a diminué MT2A ARNm a été visualisée en glucocorticoïdes par rapport à celle de témoins appariés normaux (27/36, 75,0%, P
< 0,001, figure 1C). Faible expression de la protéine MT2A a été détectée dans 29 des 36 cas de GC (80,6%) comparativement aux tissus normaux appariés (P
< 0,001, figure 1D). Le niveau de MT2A de l'ARNm a été corrélée au niveau de la protéine détectée par Western Blot (R = 0,510, P = 0,009
). Chez les humains, les MTs sont codées par une famille de gènes constitués de 10 isoformes MT fonctionnels et les protéines codées sont classiquement divisées en quatre groupes, MT1, MT2, MT3, et les protéines MT4. Étant donné que les régions codantes des isoformes MT sont hautement conservés dans les niveaux de transcription et de protéines, MT2A est hautement homologue avec MT1G, MT1E et MT1F (fichier additionnel 1: Figure S1B). Par conséquent, des expériences sur toute isoforme individuelle doivent être menées avec soin pour veiller à ce que l'isoforme exacte est analysée. Dans cette étude, expression différentielle de transcrits MT1 a été observée dans les lignées cellulaires du GC et des tumeurs primaires de GC avec des contrôles adjacents normaux (n = 36) (fichiers supplémentaires 1: Figures S1A et S2). Nous authentifié gène MT2A réelle régulation à la baisse en GC de manière significative par rapport aux tissus normaux adjacents (27/36, 75%, figure 1C). Il n'y avait pas de différence de MT1E et MT1F et MT1G transcrits d'ARNm dans des conditions normales et des échantillons de tumeurs, ainsi que la transcription MT1B ARNm était pas détectable dans toutes les cellules et les tissus (fichier supplémentaire 1: Figures S1A et S2).
Pour étudier la candidature de MT2A dans la tumorigenèse gastrique, nous avons d'abord caractérisé le statut d'expression MT2A dans 171 tissus normaux, 118 IM et 684 échantillons de GC par coloration IHC. L'anticorps pour MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) ne sont pas spécifiques pour MT-2A seulement, et une réaction croisée avec MT-1 dans une certaine mesure, même si elle est clonée par la longueur de MT2A. Comme il n'y a pas d'anticorps spécifiques pour détecter MT2A, nous utilisons donc l'anticorps commerciale commune pour la coloration IHC qui a été publié dans la plupart des études connexes, l'expression de MT2A est classé comme faible et une forte expression dans les tissus d'apparence normale, IM et primaire GCS. Haut niveau d'expression MT2A a été détecté dans 153 des 684 (22,4%) des cas de GC, et 60 sur 118 (50,8%) des cas de messagerie instantanée, ainsi que 130 171 (76,0%) des cas d'apparence normale, respectivement (file1 supplémentaires: Tableau S3 P
< 0,001), on a consisté avec des transcrits d'ARNm MT2A et l'expression protéique par Western blot. L'expression de la MT2A a été classée comme cas négatifs, faibles et fortes en 13 (7,6%), 28 (16,4%) et 130 (76,0%) sur 171 tissus normaux, respectivement; Dans les tissus IM, 27 (22,9%), 31 (26,3%) et 60 (50,8%) sur 118 cas de MI ont été détectés respectivement; Dans les échantillons de GC, 494 (72,2%), 37 (5,4%) et 153 (22,4%) sur 684 cas de GC ont été détectés respectivement (figure 1F, file1 supplémentaires). Il y avait une diminution progressive expression de la protéine MT2A dans IM et GC (P
< 0,001, figure 1E et F). Il est clair que MT2A ARNm a été fortement exprimé dans les cellules GES1 et les tissus normaux, mais a été réduit ou perdu dans la plupart des cellules et des tissus GC. MT2A expression Ces résultats suggèrent que la diminution de MT2A est un événement moléculaire dans la tumorigenèse et la progression. Est corrélée à un mauvais pronostic en GC de la MT2A était souvent régulée à la baisse en GC. Pour déterminer si l'expression de MT2A était un facteur pronostique dans GC humaine, MT2A expression de la protéine a été examinée dans le sous-ensemble par la coloration IHC. Les échantillons individuels ont été classés comme faible (MT2A-) ou une expression élevée (MT2A +). MT2A- a été associée à une survie globale médiocre (figure 2A, P
< 0,001). L'analyse univariée a indiqué que certains facteurs, y compris diminution de l'expression MT2A (P
< 0,001), le stade TNM (P
< 0,01), la profondeur de la tumeur (P
< 0,05), l'état des ganglions lymphatiques (P
< 0,05), métastases à distance (P
< 0,001) et le degré de différenciation (P
= 0,011) ont été corrélées avec une faible survie (tableau 1). Cox analyse multivariée a montré que la survie globale a été associée à l'expression de MT2A (MT2A + contre MT2A- risque relatif [HR], 0,429; IC à 95%, 0,187 à 0,683; P = 0,002
, tableau 2). Nous avons estimé la signification clinique potentielle de MT2A en corrélant son modèle d'expression avec les paramètres cliniques (file1 supplémentaires: Tableau S4). MT2A présentait une corrélation positive avec une vaste différenciation tumorale (P
< 0,001) et corrélation inverse avec le stade TNM (P
= 0,05). Ces résultats indiquent que MT2A est en corrélation avec les caractéristiques cliniques et pathologiques de survie chez les patients atteints de GC. Figure 2 Analyse des MT2A combiné avec le stade TNM pour prédire les résultats cliniques en GC. L'analyse de Kaplan-Meier de l'ensemble survie pour l'expression MT2A a été utilisé selon le stade TNM. A, la valeur pronostique de l'expression MT2A chez les patients du GC était avantage pour prédire les résultats des patients, une faible expression de MT2A était associée à une survie globale médiocre (P <
0,01); B, le stade TNM était avantage pour la prédiction pronostique chez les patients du GC. C D, la valeur pronostique de MT2A au stade TNM I-II et le stade III-IV (P
= 0,048, P <
0,001, respectivement); E F, la valeur pronostique de l'expression MT2A dans métastase ganglionnaire ou non (P
< 0,001, P = 0,052
, respectivement); valeur G. Prognostic d'expression MT2A en aucune métastase sous-groupe distant (n = 232, P
< 0,001); H. Valeur pronostique de MT2A dans pT3-pT4 sous-groupe (P
< 0,001). Toutes les données impliquent que MT2A pourrait être une signature pronostique efficace.
Tableau 2 Cox analyse de régression des caractéristiques clinico et signatures moléculaires GC
analyse multivariée
Covariable par point final

Le rapport de hasard
95% CI
P-
valeur
Age ≥ 60 ans
1.300
0,840 à 1,934
0,254
Sex
0,823
0,499 à 1,233
0,292
Différenciation
0,753
0,509 à 1,778
0,875
tumeur invasive profondeur
1.914
1.389 à 2.638
< 0,001
lymphe état du noeud
1.291
1,034 à 1,612
0,024
métastases à distance
2.595
1,332 à 5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187 à 0,683
0,002
IKB-α
0,779
0,524 à 1,311
0,423
p-IKB-α
1.857
1,256 à 2,912 0,003

signification pronostique de MT2A combiné avec le stade TNM chez les patients du GC
Pour élucider davantage l'expression de MT2A en signification pronostique, nous avons combiné expression MT2A avec les caractéristiques clinico en GC. L'objectif était d'évaluer le pronostic des patients du GC avec la classification pathologique, et de rechercher si la classification pathologique devrait être encore sous-classé pour une prévision plus précise des résultats. Comme le montre le file1 supplémentaire: Tableau S4, l'expression de MT2A en GC a été associée à stade TNM et la différenciation de la tumeur, ce qui implique que MT2A peut être un biomarqueur moléculaire potentielle pour prédire la classification pathologique dans GC. covariables Comme dichotomiques, à la fois MT2A et le stade TNM étaient des facteurs prédictifs indépendants de survie (tableau 2, figure 2A et B). signification pronostique d'expression MT2A a en outre été analysée chez des patients atteints de GC selon le système de classification pTNM. Il y avait une différence significative de la survie globale entre les patients avec une expression de MT2A dans les deux groupes de la scène (P
= 0,048 et P
<précoce (I et II) et avancé (IV III et); 0,001, respectivement; la figure 2C et D). En outre, le statut d'expression de MT2A était également efficace pour le pronostic dans les mêmes étapes (P = 0,052
, Figure 2E; P
< 0,001, Figure 2F; P
< 0,001, Figure 2G et P
< 0,001, figure 2H). Ces données représentent MT2A qui est une signature moléculaire pour prédire l'issue clinique basée sur le stade TNM.
La restauration des résultats d'expression MT2A dans la suppression des cellules GC de croissance in vitro et in vivo

Pour révéler le mécanisme de MT2A en GC, nous transfectées de façon stable MT2A surexprimé plasmide et vecteur vide en trois lignées de cellules GC (BGC823, SGC7901 et AGS). Nous avons étudié la croissance, les taux d'apoptose et le cycle cellulaire des lignées cellulaires transfectées avec le plasmide MT2A. La viabilité cellulaire a été réduite dans les cellules du GC re-exprimant MT2A en utilisant un test MTT (BGC823, P = 0,0038
, Figure 3B; AGS, P = 0,0007
, file1 supplémentaires: Figure S3A; SGC7901, P = 0,0004
, file1 supplémentaires: Figure S3C). Pour étudier davantage la fonction de MT2A dans des lignées cellulaires de GC, nous avons analysé les effets de l'expression MT2A sur la prolifération cellulaire et la régulation du cycle cellulaire par Annexin-V /PI coloration et cytométrie de flux. Plus l'apoptose a été détectée dans ces cellules GC réexprimer MT2A (P
< 0,01, respectivement, figure 3F; file1 supplémentaires: Figure S3A et C). En outre, G2 /M arrêt a été observée dans les cellules GC en utilisant l'expression ectopique de MT2A. Les ratios de phase G2 /M dans les groupes MT2A étaient deux fois plus élevés que ceux dans les groupes de vecteurs a fait (P
< 0,01, respectivement, Figure 3E et file1 supplémentaires: Figure S3B et D). Figure 3 L'expression ectopique de MT2A inhibe la croissance des cellules GC in vitro et in vivo. MT2A a inhibé la prolifération cellulaire et la formation de colonies dans les cellules humaines GC. A, Western blot de MT2A a été détecté dans BGC823 cellules transfectées avec l'expression ectopique de MT2A plasmide et vecteur vide. Les bandes de protéines ont été scannés MT2A (normalisés par rapport à la ß-actine pour le contrôle du chargement). B, La prolifération cellulaire a été analysée par le test MTT dans réexprimer MT2A de BGC823 cellules ou non. Les données ont été montrée comme étant la moyenne ± .SD de trois expériences indépendantes. C, la croissance des cellules BGC823 a été analysée dans un milieu gélose molle semi-solide. Les colonies de vecteurs vides formé statistiquement significativement plus de colonies (moyenne = 426 grandes colonies par plaque IC à 95%:. 387-472 colonies) que les clones MT2A (moyenne = 136 colonies IC à 95%:.. 100-164 colonies Les chiffres représentent la moyenne nombre de colonies de trois expériences indépendantes ± SD Le nombre relatif a été calculé dans les cellules témoins et BGC823-MT2A et analysées à l'aide de t de Student
-test (P = 0,0038
). D, tumorigénicité MT2A inhibée des cellules BGC823 . chez la souris nude Le volume tumoral moyen pour BGC823-MT2A à 3 semaines après l'injection était de 112 mm3 (IC à 95%: 93-147 mm3), comparativement à 352 mm3 (IC à 95%: 298-423 mm3) pour BGC823-Vector. les données représentent la moyenne ± écart-type du volume tumoral provenant de chaque groupe. Dans chaque groupe, les tailles des tumeurs ont été mesurées en utilisant un pied à coulisse aux points de temps indiqués. les données ont été montré que la détection moyenne ± écart-type (T-
test, P
= 0,0027) E, l'analyse FACS a montré que MT2A surexpression conduit à G2 /M arrestation, et le rapport de phase G2 /M était plus élevé que dans les cellules témoins et des parents vides (P <
0,01). F, l'effet antitumoral de MT2A a été détectée par l'annexine V /FITC-PI test de coloration. Pourcentage de cellules apoptotiques était de 52,9% ± 5,4% dans le groupe MT2A par rapport à celle dans les cellules mères (8,3% ± 2,4% et les cellules transfectées avec le vecteur vide (8,2% ± 3,7%, P
<. 0,001)
de plus, nous avons des plus généreux BGC823 cellules réprimant MT2A ou non dans de la gélose molle, l'expression ectopique de MT2A a été confirmée par analyse par western blot première (figure 3A). au bout de 3 semaines d'expression culture de MT2A a provoqué une réduction statistiquement significative de la formation de colonies (P
= 0,0053, figure 3C). en outre, il y avait une inhibition de la croissance spectaculaire de MT2A-re des cellules exprimant par rapport au témoin négatif (P
= 0,0027, figure 3D) des modèles de xénogreffe. Ces données démontrent que MT2A pourrait jouer un rôle dans la suppression de la prolifération des cellules GC in vitro et in vivo

.
MT2A refoule activité de NF-kB par IKB-α-régulation
Il a été rapporté que la perte de MT2A induite NF-kB activation du signal dans des souris transgéniques modèle (MT2A-knock out) [15]. Mais le rôle de MT2A comme un ami ou un ennemi dans la voie de signal NF-kB était encore controversée [18, 33]. Afin d'interpréter le mécanisme de médiation MT2A GC suppression de la croissance cellulaire in vivo et in vitro

, nous avons essayé d'explorer la relation potentielle entre MT2A et NF-kB voie de signalisation, et le mécanisme interne était encore clair dans GC . MT2A et les principaux gènes de signalisation NF-kB, tels que p65, IkB-α, le p-IkB-α et de l'effecteur en aval de la signalisation du NF-kB, la cycline D1 ont été détectés dans cette étude (dossier1 additionnel). MT2A expression ectopique de MT2A induite à la fois l'ARNm et l'expression des protéines de IkB-α dans toutes les lignées cellulaires GC étudiés (BGC823, SGC7901 et AGS), les niveaux d'état stable IKB-α d'ARNm ont augmenté de 5,5 fois dans BGC823 cellules re-exprimant 48 h. AGS et SGC7901 cellules, nous avons observé une 7,2 fois et 4,3 fois l'induction de la IkB-α ARNm (figure 4A), le taux de protéines par rapport concordaient avec la transcription de l'ARNm et la protéine p-IkB-α a été réduite dans les GC Les cellules transfectées MT2A vecteur (figure 4B). Comme le montrent les figures 4C et D, knockdown de MT2A endogène dans les cellules GES1 conduit à la régulation de la IKB-α expression, ainsi que la régulation de p-IKB-α et de l'expression de la cycline D1, suggérant un lien entre l'activité de MT2A et IKB expression -α. Ces expériences indiquent que MT2A induit l'expression IkB-α dans les niveaux d'ARNm et de protéines. Et MT2A médiée par la régulation de l'expression IKB-α a été confirmé par immunofluorescence (figure 5A, file1 supplémentaires). Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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