Metalotioneína 2A inibe a ativação da via NF-kB e prevê resultado clínico segregados com o estádio TNM em pacientes com câncer gástrico após ressecção radical

Metalotioneína 2A inibe a ativação da via NF-kB e prevê resultado clínico segregados com o estádio TNM em pacientes com câncer gástrico após ressecção radical da arte abstracta
Fundo
metalotioneína 2A (MT2A) como uma proteína de stress, desempenha um papel protetor na gástrica barreira mucosa. O seu papel no desenvolvimento do câncer gástrico (GC) não é clara. O mecanismo de MT2A será investigado na tumorigênese gástrico.
Métodos
expressão MT2A foi detectado em 973 amostras gástricas. A função biológica foi determinada por meio ectópica MT2A expressar in vitro e in vivo

. Os possíveis efectores a jusante de MT2A foram investigados na sinalização de NF-kB. Os níveis de proteína de MT2A, IkB-α e p-IkB-α (ser32 /36) foram analisados ​​expressão num subconjunto de 258 pacientes por coloração IHC. Os efeitos prognósticos de MT2A, estado de IkB-α e estágio TNM foram avaliados pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank.
Resultados
diminuição da expressão MT2A foi detectada em linhagens celulares e tumores primários GC. Em dados clínicos, perda de MT2A (+ MT2A em Normal (n = 171, 76,0%); metaplasia intestinal (n = 118, 50,8%); GC (n = 684. 22.4%, P
< 0,001)) foi associada com mau prognóstico (P Art < 0,001), avançado estágio TNM (P
= 0,05), e para baixo-regulação da IkB-α expressão (P Art < 0,001). Além disso, MT2A foi a assinatura prognóstico independente segregados do estatuto de IkB-α e características patológicas. Além disso, MT2A inibiu o crescimento celular através de apoptose e G2 /M de detenção, que regulado negativamente NF-kB via através da sobre-regulação da IkB-α e sub-regulação de p-IkB-α e expressão da ciclina D1.
Conclusões
MT2A pode desempenhar uma atividade supressora de tumor através da inibição de sinalização NF-kB e pode ser um biomarcador prognóstico e potencial alvo para terapia individual dos pacientes do GC.
Palavras-chave
metalotioneína 2A NF-kB sinalização gástrica câncer Prognosis TNM fundo de estágio
o que há de novo
Abundância de metalotioneína 2A (MT2A) exibe na barreira mucosa gástrica, mas o seu papel na progressão do câncer gástrico (GC) ainda é incerto. Nesta análise de 171 tecidos normais gástricos, 118 metaplasia intestinal e 684 cancros gástricos primários, diminuição MT2A foi significativamente correlacionada com mau prognóstico. Ele inibiu a proliferação de células através de GC NF-kB inactivação de sinalização. Estes resultados indicam que MT2A pode ser um importante marcador de prognóstico e alvo terapêutico para GC.
Câncer gástrico (CG) é o tumor maligno mais comumente diagnosticado e continua a ser uma carga significativa de câncer na Ásia, especialmente na China [1, 2]. A maioria dos pacientes submetidos a cirurgia de GC já estão em um estágio avançado ea sobrevivência de 5 anos é variada. Vários fatores histológicos foram relatados para ser fatores prognósticos de GC, incluindo o tamanho do tumor, classificação da OMS, o sistema de estágio do tumor-nódulo-metástase (TNM), e diferenciação de grau [3, 4]. No entanto, o prognóstico dos pacientes GC na mesma fase ainda é inconsistente [5]. Portanto, a identificação de marcadores de diagnóstico específicos e alvo terapêutico permitiria previsão fiável, eficaz extensão de sobrevivência pós-operatória e a qualidade de vida dos pacientes [6].
Stress celular tem mostrado desempenhar um papel na regulação molecular de carcinogénese [7, 8]. As metalotioneínas (MTS) como as proteínas de stress de baixo peso molecular e rica em cisteína tem a capacidade de uma elevada afinidade para os iões de metal e eliminadores de ROS. MT2A como a principal isoforma de Mts desempenha um papel importante na barreira da mucosa gástrica de pacientes com gastrite e de roedores modelos [9, 10]. Pré-administração de MT2A exógeno ou pré-indução de MT2A endógena pode proteger estômago e fígado contra danos induzidos por stress e inibir a formação de peróxidos de lípidos induzida por stress, implicando um efeito protector de MT2A na patogénese induzida por tensão e um potencial alvo terapêutico aplicado para a prevenção precoce [11] - [13]. Recentemente, MT2A desempenha um importante papel na tumorigénese e na progressão de vários carcinomas incluindo GC [14]. A perda ratos de gene MT2A predispostos a hepatocarcinogênese dietilnitrosamina induzida pela ativação de genes alvo NF-kB, o que demonstra que MT2A protege ratos de lesão hepática induzida por hepatocarcinogen e carcinogênese, ressaltando sua aplicação terapêutica potencial contra o câncer hepatocelular [15]. Alguns estudos focados sobre o papel do MT2A na proteção contra a lesão gástrica induzida por H.pylori
utilizando camundongos MT-nulos. Himeno, S. descoberto que a activação de NF-kB e a expressão das quimiocinas de NF-kB mediada por células gástricas foram marcadamente mais elevada em ratinhos MT2A-nula do que em ratinhos de tipo ampla [9]. Estes dados implicam que MT2A realiza o controle negativo da actividade de factor de transcrição NF-kB, mas o seu papel na carcinogénese gástrica ainda é ambígua [16] - [18].
Activação aberrante de NF-kB está associada com a inflamação de células, malignidade e progressão tumoral [7, 19]. A actividade funcional de NF-kB é inibida através da ligação ao seu inibidor, IkB-α. A activação de NF-kB é resultado da degradação mediada por proteassoma de IkB-α por fosforilação do inibidor (p-IkB-α), o que sugere que o NF-kB via é um alvo potencial para a terapia individual [20] - [23] .
Algumas evidências indicam que o aumento da expressão MT2A é importante para a progressão do cancro, e MT2A é inicialmente proposto como um proto-oncogene na mama, do esófago, da próstata, e cancro do ovário, associada a malignidade e prognóstico pobre [24] - [27 ]. Em contraste, é regulada negativamente em tumores gastrointestinais e carcinomas hepatocelulares, onde MT2A ou é inversamente correlacionada ou não relacionado com a mortalidade [28, 29]. No entanto, a variação do MT2A e sua avaliação clínica permanece contraditória em GC [28, 30, 31]. Estes resultados sugerem que a desregulação de MT2A está envolvida na patogénese do tumor, embora o papel exacto ainda não é claro em GC.
Assim, concentramos para revelar a co-expressão de gene e MT2A IkB-α correlacionada com características patológicas clínicas e resultados em uma grande escala de tumores gástricos com dados de acompanhamento a longo prazo. Além disso, foram analisadas sistematicamente o papel de MT2A como uma proteína de stress e regulador negativo na activação de NF-kB para caracterizar seu papel biológico e mecanismo molecular in vitro e in vivo

.
Métodos
características dos pacientes amostras de tumores gástricos
de 684 pacientes GC tratados no Hospital do Câncer Pequim 1997-2007 foram avaliados. Os pacientes incluídos 513 homens (75,0%) e 171 mulheres (25,0%) com idade média no momento do diagnóstico de 54 anos (variando de 19 a 81 anos). O período de seguimento variou de 1 a 127,2 meses (mediana, 34,2 meses). Todos os pacientes foram submetidos à ressecção radical com intenção curativa. Nenhum dos pacientes tinha recebido quimioterapia neoadjuvante ou radioterapia antes da cirurgia. Os critérios de inclusão de todos os pacientes é: (a) um diagnóstico GC distintivo com base na sexta edição do tumor-nódulo-metástase (TNM) de classificação da União Internacional contra o GC, (b) a ressecção radical, (c) adequado fixadas em formalina, tecidos embebidos em parafina. O total de 684 GCs tinham os dados clínico-patológicos (denominado como 'coorte'). Além disso, um conjunto de 258 amostras elegíveis foram coletados a partir da coorte com dados de acompanhamento de 10 anos (denominado como "subconjunto"). A evolução clínica dos pacientes foi registrada a partir da data da cirurgia até a data da morte. Além disso, 118 a metaplasia intestinal (MI), e 171 tecidos normais gástricos foram recolhidos a partir destes pacientes GC. A avaliação histológica foi realizada por três patologistas seniores. A composição demográfica da coorte e subconjunto é apresentado na Tabela Suplementar 1. Além disso, 36 tumores gástricos emparelhados com os tecidos normais adjacentes foi moída a um pó em azoto líquido para RT-PCR e PCR em tempo real das isoformas MT (file1 adicionais). tabela 1 análise de regressão logística de características clínicas e prognóstico em GC
de Variáveis ​​
No. dos casos (n = 258)
Survival tempo (mês)
P
-valor
Sexo Masculino

186
66,4 ± 4,6
Feminino
72
54,1 ± 4,8
0,604
idade de diagnóstico Art < 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
estágio 85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM
I
34
105,5 ± 7,7
I vs. IV Art < 0,001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs. IV Art < 0,001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs. IV
0,010
IV
profundidade 52
35,8 ± 4,1
Tumor
pT1
13
87,2 ± 9,9
pT1 vs. pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 vs. pT4 Art < 0,001
pT3
157
49,1 ± 2,9
pT3 vs. pT4
0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
linfonodos estatuto
pN0
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs. PN3
0,001
pN1
115
50,5 ± 3,4
pN1 vs. PN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
pN2 vs. PN3
0,326
PN3
16
47,5 ± 12,6 metástase
Distante
pM0
232
67,5 ± 4,3
pM1
26
27,6 ± 5,8 Art < 0,001
grau de diferenciação
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
expressão 204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A Art < 0,001
baixo
202
53,9 ± 3,4
alta
56
86,9 ± 9,2
IkB-α expressão
baixo
164
61,6 ± 4,9
alta
94
64,9 ± 5,1
0,248
expressão p-IkB-α
baixo
126
74,1 ± 5,3
alta
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: sem metástases à distância; M1: metástases à distância;
D1: bem /GCs moderadamente diferenciadas; D0: GC pobremente diferenciadas análise imuno-histoquímica
coloração IHC na matriz de tecido foi realizada com anticorpo MT2A. (Diluição 1: 100; 18-0133, Invitrogen, CA, EUA), anticorpo p-IkB-α (1 : 200 de diluição; ab47752, Abcam, Cambridge, Reino Unido), o anticorpo de IkB-α (diluição 1: 300; SC-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). Para cada biomarcador, as imagens foram avaliadas visualmente por três patologistas que foram cegados a evolução clínica. Discrepâncias foram resolvidas por consenso. Escores foram atribuídos em percentagem do coloração positiva dentro de cada cilindro. O valor percentual média dos dois núcleos foi calculado para representar um tumor (file1 adicionais). As linhas celulares
linhas celulares de cancro gástrico BGC823, MGC803, SGC7901 e PAMC82 foram estabelecidas na China e adquiridos a partir do banco de tecidos de Shanghai (Xangai, China). Especialmente, as células BGC823 exibiu alta tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, linhas de RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 e SNU-16 de células foram adquiridos a partir de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, EUA). GES-1, uma linha celular imortalizada humana epiteliais gástricas, foi gerado por transfecção virai de SV40 no Hospital Câncer Pequim e cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo um 5% de CO 2 [32].
MTT e agar mole
as células foram semeadas em placas de cultura de 96 cavidades, e adicionou-se MTT às células a 1-5 dias. MTT (5 mg /ml) foi removida após 4 h de incubação, e, em seguida, foi adicionado dimetil sulfóxido (DMSO) para solubilizar o produto formazan. A absorvência a 490 nm /570 nm, foi determinada por um leitor de microplacas (Bio-rad680 ELISA). As células foram então incubadas durante 4 semanas, coradas com corante vital INT tetrazólio (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) para documentar a presença ou ausência de colónias de células viáveis. O agar mole foi fixada com metanol-ácido 100 acético ul.: Ensaio de tumorigenicidade (3 1 vol /vol) e as colónias foram contadas
BGC823 células (5 × 10 5 células em suspensão em 0,1 ml de PBS) transfectadas com MT2A sobre-expressos vector ou vector vazio foram injectados subcutaneamente no flanco dorsal de cinco clones de 4 semanas de idade, do sexo feminino ratinhos nus Balb /C (MT2A-expressão à direita e de controle de vetores clones do lado esquerdo. diâmetro do tumor foi medido e documentada a cada 5 dias o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula 2/2 (a > b)... ao fim de 25 dias, todos os ratinhos foram sacrificados e o volume do tumor foi medida três experiências independentes eram realizada e deu os resultados semelhantes. os animais foram mantidos em instalações aprovadas pela associação de avaliação e acreditação do Laboratório animal Care em conformidade com os regulamentos e as normas internacionais.
análise estatística
χ
2 estatísticas de teste e estudante de t
-test foram usadas para comparar as características de pré-tratamento de casos de pacientes. A sobrevida relacionada ao câncer foi analisada pelo método de Kaplan-Meier e comparadas por meio de testes de log-rank. O teste de Spearman eo teste exato de Fisher foram aplicados para demonstrar correlações clínico-patológicas. Um modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox foi utilizado com intervalos associados de 95% de confiança (IC) e os valores P
. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e P
valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise estatística foi realizada utilizando o pacote estatístico SPSS (versão 16.0; SPSS Inc, Chicago, IL).
Estudo aprovado
Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Peking University Hospital do Câncer de Ética. O uso de tecidos humanos e dados clínicos foi de acordo com as diretrizes do hospital e aprovados pelo Comitê de Ética local.
Resultados
diminuição da expressão MT2A é um evento molecular em linhas celulares e tumores primários do GC
Expression de MT2A foi avaliada por RT-PCR e Western blot num painel de linhas celulares de GC e GES1, que é servido como "controlo normal". Como mostrado na Figura 1A, MT2A ARNm variaram substancialmente com os níveis mais elevados em GES1. Falta ou diminuição da expressão MT2A foi observada em BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 e células N87. O nível de proteína de expressão MT2A foi ainda detectado nas seis linhas comuns utilizados GC celulares (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, e MKN45) em comparação com GES1. A análise Western blot mostrou que, em seis linhagens de células GC vulgarmente utilizados, os níveis de expressão MT2A estavam ausentes ou baixa, em comparação com GES1, consistente com a expressão do mRNA detectado acima (Figura 1B). Especialmente, BGC823, MGC803 e SGC7901 células com falta de expressão MT2A exibem alta tumorigenecity em ratinhos nus. A Figura 1 Ausente ou diminuição da expressão de MT2A é detectada em linhas celulares e tumores primários de GC. Um nível, MT2A ARNm foi medido por RT-PCR em linhas celulares de GC e a linha de células imortais normais-GES1. E análises semi-quantificação foram realizadas com 3,0 software de digitalização em escala de cinza ImageTool (normalizada para p-actina níveis). A experiência foi realizada em triplicado. B, nível de proteína MT2A foi determinado por análise de Western blot em linhas de células normais de GC e a linha celular imortal-GES1. As bandas de proteínas MT2A foram digitalizadas (normalizados níveis de beta-actina). C, a expressão diferencial de mRNA transcrito MT2A em 36 tecidos GC emparelhados e tecidos normais adjacentes. As bandas de mRNA MT2A foram digitalizadas (normalizados níveis de beta-actina). D, os níveis de proteína MT2A foram detectados nos tecidos 36 GC emparelhadas por Western blotting. As bandas de proteínas MT2A foram digitalizadas (normalizados níveis de beta-actina). E, diminuição MT2A foi observado durante a transformação maligna gástrico. (A) intensa coloração das MT2A em tecidos normais, (b) coloração moderada de MT2A em tecidos IM, (c) coloração fraca de MT2A em cancros gástricos primários moderadamente diferenciados e (d) a expressão negativa de MT2A em GCs pouco diferenciados (ampliação original × 400). (D) Em comparação com as amostras normais e pré-cancerosas lesões de IM, reduziu MT2A foi um evento molecular comum na carcinogênese gástrica (P Art < 0,001) F: A expressão diferencial de MT2A no GC, IM e tecidos normais por coloração IHC. Negativo: score 0; Ruim: marcar 1-4; Strong: marcar 5-12. Para mais detalhes, consulte o file1 adicionais.
36 tumores primários do GC com os tecidos normais adjacentes foram também examinados na Figura 1C e D, para confirmar os resultados derivados de linhas celulares GC, diminuição do mRNA MT2A foi exibido em GCs em comparação com a de controles pareados normais (27/36, 75,0%, P
< 0,001, Figura 1C). Baixa expressão da proteína MT2A foi detectada em 29 dos 36 casos de GC (80,6%) em comparação com os tecidos normais pareados (P Art < 0,001, Figura 1D). O nível de ARNm de MT2A foi correlacionado com o nível de proteína detectada através de Western blot (R = 0,510, P = 0,009
). Nos seres humanos, as TMs são codificados por uma família de genes que consistem de 10 MT isoformas funcionais e as proteínas codificadas são convencionalmente subdivididos em quatro grupos, MT1, MT2, MT3, proteínas e MT4. Uma vez que as regiões codificantes de isoformas de MT são altamente conservadas em níveis de transcrição e de proteínas, MT2A é altamente homóloga com MT1G, MT1E e MT1F (arquivo adicional 1: Figura S1B). Assim, as experiências com qualquer isoforma indivíduo deve ser cuidadosamente conduzido para assegurar que a isoforma exacta é analisada. Neste estudo, a expressão diferencial de transcritos MT1 foi observada em linhas de células de GC e tumores primários do GC com controles adjacentes normais (n = 36) (arquivo adicional 1: Figuras S1A e S2). Nós autenticado gene MT2A real para baixo-regulação no GC significativamente em comparação com os tecidos normais adjacentes (27/36, 75%, Figura 1C). Não houve diferença de transcritos MT1E e MT1F e mRNA MT1G em circunstâncias normais e amostras de tumor, bem como mRNA transcrito MT1B não era detectável em todas as células e tecidos (arquivo adicional 1: Figuras S1A e S2).
Para investigar a candidatura de MT2A na tumorigênese gástrico, inicialmente caracterizado o estado de expressão MT2A em 171 tecidos normais, 118 IM e 684 amostras de GC por coloração IHC. O anticorpo para MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) não é específico para a TA-2A apenas, e reage de forma cruzada com MT-1, em certa medida, mesmo que é clonado por todo o comprimento do MT2A. Como não há anticorpo específico para detectar MT2A, por isso usamos o anticorpo comercial comum para a coloração IHC que foi publicado em estudos mais relacionados, expressão MT2A é classificado como de baixa e alta expressão em tecidos aparência normal, IM, e GCs primário. Elevado nível de expressão MT2A foi detectada em 153 dos 684 (22,4%) casos de GC, e 60 de 118 (50,8%) casos de IM, bem como 130 de 171 (76,0%) casos aparência normal, respectivamente (file1 adicional: Tabela S3 , P
< 0,001), foi consistiu com transcritos de ARNm e a expressão da proteína MT2A por Western blot. A expressão de MT2A foi classificada como casos negativos, fracos e fortes em 13 (7,6%), 28 (16,4%) e 130 (76,0%) dos 171 tecidos normais, respectivamente; Em tecidos IM, 27 (22,9%), 31 (26,3%) e 60 (50,8%) dos 118 casos de IM foram detectados, respectivamente; Em amostras de GC, 494 (72,2%), 37 (5,4%) e 153 (22,4%) dos 684 casos de GC foram detectados respectivamente (Figura 1F, file1 adicionais). Houve uma diminuição gradual expressão de proteína em MT2A IM e GC (P
< 0,001, Figura 1E e F). É claro que MT2A ARNm foi altamente expressa em células GES1 e tecidos normais, mas foi reduzida ou perdida na maioria das células e tecidos GC. Estes resultados sugerem que a diminuição da MT2A é um evento molecular na tumorigênese e progressão.
Expressão MT2A está correlacionada com mau prognóstico em GC
MT2A era frequentemente regulada para baixo em GC. Para explorar se a expressão MT2A foi um fator prognóstico em GC humana, a expressão da proteína MT2A foi examinado no subconjunto por coloração IHC. As amostras individuais foram classificados como baixa (MT2A-) ou expressão elevada (MT2A +). MT2A- foi associado com menor sobrevida global (Figura 2A, P Art < 0,001). A análise univariada indicou que alguns fatores, incluindo a diminuição da expressão MT2A (P Art < 0,001), estadiamento TNM (Art <P; 0,01), a profundidade do tumor (P Art < 0,05), status do nó de linfa (P
< 0,05), metástases à distância (P Art < 0,001) e grau de diferenciação (P
= 0,011) foram correlacionados com pior sobrevida (Tabela 1). Cox análise multivariada mostrou que a sobrevida global foi associada com a expressão MT2A (MT2A + contra MT2A- hazard ratio [HR], 0,429; IC de 95%, 0,187-0,683; P
= 0,002, Tabela 2). Estimou-se o significado clínico potencial da MT2A correlacionando seu padrão de expressão com os parâmetros clínicos (file1 adicional: Tabela S4). MT2A exibiu uma extensa correlação positiva com a diferenciação do tumor (P Art < 0,001) e inversa correlação com estágio TNM (P
= 0,05). Estes resultados indicam que MT2A está correlacionada com características patológicas clínicas e sobrevivência em pacientes GC. Figura 2 Análise de MT2A combinado com estágio TNM para prever o resultado clínico em GC. A análise de Kaplan-Meier de-sobrevida global para a expressão MT2A foi utilizado de acordo com a fase TNM. Um valor, prognóstico da expressão MT2A em pacientes GC foi benefício para prever o resultado de pacientes, baixa expressão de MT2A foi associado à sobrevida global pobres (P <
0,01); B, fase TNM foi benefício para a previsão de prognóstico em pacientes GC. C D, o valor prognóstico da MT2A no estágio TNM I-II e fase III-IV (P
= 0,048, P <
0,001, respectivamente); E F, o valor prognóstico da expressão MT2A em linfonodo metástase ou não (P Art < 0,001, P
= 0,052, respectivamente); valor G. prognóstico da expressão MT2A em nenhum subgrupo metástases à distância (n = 232, P Art < 0,001); H. Valor prognóstico da MT2A em pT3-pT4 subgrupo (P Art < 0,001). Todos os dados implicam que MT2A poderia ser uma assinatura prognóstico eficaz.
Tabela 2 Cox análise de regressão das características clínicas e assinaturas moleculares em GC
análise multivariada
de covariáveis ​​por ponto final

Hazard ratio
95% CI
P-
valor
Idade ≥ 60 anos
1.300
0,840-1,934
0,254
Sex
0,823
0,499-1,233
0,292
Diferenciação
0,753
0,509-1,778
0,875
Tumor profundidade invasiva
1.914
1.389 para 2.638 Art < 0,001
linfa status do nó
1.291
1,034-1,612
0,024
metástases à distância
2.595
1,332-5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187-0,683
0,002
IkB-α
0,779
0,524-1,311
0,423
p-IkB-α
1.857
1,256-2,912
0,003
significado prognóstico da MT2A combinado com estágio TNM em pacientes GC
Para melhor elucidar expressão MT2A no significado prognóstico, combinamos expressão MT2A com as características clínico-patológicas em GC. O objetivo foi avaliar o prognóstico de pacientes com GC classificação patológica, e investigar se a classificação patológica deve ser mais sub-classificados para a previsão mais precisa do resultado. Como mostrado na file1 adicionais: Tabela S4, expressão MT2A no GC foi associada com o estágio TNM e diferenciação do tumor, o que implica que MT2A pode ser um biomarcador molecular potencial para prever classificação patológica no GC. co-variáveis ​​como dicotômicas, tanto MT2A e estágio TNM foram preditores independentes de sobrevivência (Tabela 2, Figura 2A e B). significado prognóstico de expressão MT2A foi ainda analisada em pacientes GC de acordo com o sistema de classificação pTNM. Houve uma diferença significativa na sobrevida global entre os pacientes com expressão MT2A em ambos os grupos de estágio (P
= 0,048 e P <
precoce (I e II) e avançado (IV III e); 0,001, respectivamente; Figura 2C e D). Além disso, o estado de expressão MT2A também foi eficaz para o prognóstico nas mesmas fases (P = 0,052
, Figura 2E; P Art < 0,001, Figura 2F; P Art < 0,001, Figura 2G e P
< 0,001, Figura 2H). Estes dados representam que MT2A é uma assinatura molecular para prever o resultado clínico baseado em estágio TNM.
Restauração de resultados de expressão MT2A na supressão do crescimento de células GC in vitro e in vivo

Para revelar o mecanismo de MT2A no GC, nós estavelmente transfectadas MT2A sobre-expressos plasmídeo e vector vazio em três linhas de células GC (BGC823, SGC7901 e AGS). Foi examinado o crescimento, a taxa de apoptose e do ciclo celular destas linhas de células transfectadas com o plasmídeo MT2A. A viabilidade celular foi reduzida em células GC re-expressando MT2A utilizando o ensaio MTT (BGC823, P = 0,0038
, Figura 3B; AGS, P = 0,0007
, file1 adicionais: Figura S3A; SGC7901, P = 0,0004
, file1 adicionais: Figura S3C). Para investigar ainda mais a função de MT2A em linhas celulares de GC, foram analisados ​​os efeitos de expressão MT2A sobre a proliferação celular e regulação do ciclo celular por Anexina-V /coloração de PI e análise de citometria de fluxo. Mais apoptose foi detectada nestas células que expressam GC re MT2A (P
< 0,01, respectivamente, Figura 3F; arq1 adicionais: Figura S3A e C). Além disso, G2 /M de captura foi observada em células GC usando a expressão ectópica de MT2A. Os rácios de fase G2 /M em grupos MT2A eram duas vezes maiores do que aqueles nos grupos vetor fez (P Art < 0,01, respectivamente, Figura 3E e file1 adicionais: Figura S3B e D). A Figura 3 A expressão ectópica de MT2A GC inibe o crescimento de células in vitro e in vivo. MT2A inibiu a proliferação celular ea formação de colónias em células GC humanos. A, Western blot de MT2A foi detectado em BGC823 células transfectadas com expressão ectópica do plasmídeo MT2A e vector vazio. As bandas de proteínas MT2A foram digitalizadas (normalizada para p-actina para controlar o carregamento). B, a proliferação celular foi analisada pelo ensaio de MTT em MT2A expressando re-BGC823 de células ou não. Os dados foram apresentados como a média ± .sd de três experiências independentes. C, o crescimento de células BGC823 foi analisado num meio de agar semi-sólido macio. As colônias vetor vazios formados estatisticamente significativamente mais colônias (média = 426 grandes colónias por placa de 95% IC:. 387-472 colónias) do que clones MT2A (média = 136 colónias 95% IC:.. 100-164 colónias Os números representam a média número de colónias de três experimentos independentes ± SD O número relativo foi calculado em células de controlo e BGC823-MT2A, e analisados ​​utilizando t de Student
-test (P
= 0,0038). D, tumorigenicidade MT2A inibido de BGC823 células . em ratinhos nus O volume médio do tumor para BGC823-MT2A às 3 semanas após a injecção foi de 112 mm3 (95% cis: 93-147 mm3), em comparação com 352 mm3 (95% cis: 298-423 mm3) para BGC823-vector. os dados representam a média ± DP de volume de tumor derivado de cada grupo. Em cada grupo, os tamanhos do tumor foram medidos utilizando um compasso de calibre, nos pontos de tempo indicados. os dados foram representados como a média ± SD de detecção (t-
teste, P
= 0,0027) e, a análise de FACS mostrou que MT2A sobre-expressão conduziu a G2 /M de captura, e o rácio de fase G2 /M foi maior do que em células de controlo e dos pais vazias (P < 0,01
). F, efeito antitumoral de MT2A foi detectada por ensaio de coloração de anexina V /FITC-PI. Percentagem de células apoptóticas foi de 52,9% ± 5,4% no grupo MT2A comparada com a das células-mãe (8,3% ± 2,4% e as células transfectadas com o vector vazio (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Além disso, nós banhado BGC823 células reprimindo MT2A ou não em ágar macio, a expressão ectópica de MT2A foi confirmada por análise de western blot primeira (Figura 3A). Após 3 semanas de expressão em cultura de MT2A causou uma redução estatisticamente significativa na formação de colónias (P
= 0,0053, Figura 3C). Além disso, houve uma inibição do crescimento dramático de MT2A-re-expressando células em comparação com o controlo negativo (P = 0,0027
, Figura 3D) nos modelos de xenoenxerto. Estes dados demonstram que MT2A pode desempenhar um papel na supressão da proliferação de células GC in vitro e in vivo

.
MT2A reprime a actividade de NF-kB por meio de IkB-α-regulação
foi relatado que a perda de MT2A induzida ativação do sinal de NF-kB em modelo de camundongos transgênicos (MT2A-knock out) [15]. Mas o papel de MT2A como um amigo ou inimigo na via de sinalização de NF-kB ainda era controversa [18, 33]. Para interpretar o mecanismo de supressão do crescimento de células GC MT2A mediada in vivo e in vitro

, tentamos explorar a potencial relação entre MT2A e NF-kB via de sinalização, e o mecanismo interno ainda não estava claro no GC . MT2A e os principais genes na sinalização de NF-kB, tais como p65, IkB-α, p-IkB-α e o efector a jusante de sinalização de NF-kB, a ciclina D1 foram detectados neste estudo (arq1 adicionais). A expressão ectópica de MT2A induzida tanto de ARNm e a expressão da proteína de IkB-α em todas as linhas celulares de GC investigados (BGC823, SGC7901 e AGS), ARNm IkB-α níveis de estado estacionário foram aumento de 5,5 vezes em BGC823 células re-expressando MT2A para 48 h. Em AGS e SGC7901 células, observou-se uma indução de 7,2 vezes e 4,3 vezes da IkB-α ARNm (Figura 4A), os níveis de proteína relativos eram consistentes com transcritos de ARNm, e a proteína p-IkB-α foi diminuída em aqueles CG células transfectadas MT2A vetor (Figura 4B). Como se mostra nas Figuras 4C e D, knockdown de MT2A endógeno em células GES1 levado a regulação negativa da IkB-α expressão, bem como a sobre-regulação de p-IkB-α e expressão da ciclina D1, sugerindo uma ligação entre a actividade MT2A e IkB expressão -α. Estas experiências indicam que a expressão de IkB MT2A induz-α em ARNm e os níveis de proteína. E MT2A mediada por sobre-regulação da expressão de IkB-α foi ainda confirmada por imunofluorescência (Figura 5A, arq1 adicionais). Para clarificar o mecanismo de MT2A sobre a expressão de IkB-α, realizamos ensaios de repórter de luciferase pela reestruturação da região promotora de IkB-α, 5,6 vezes a sobre-regulação da actividade do promotor de luciferase IkB-α foi encontrado no grupo MT2A do que no grupo de vetor ( Tabela S2. Tabela S3. Tabela S4. Tabela S5. Tabela S6. Figura S1. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• Expressões da COX-2 e VEGF-C em câncer gástrico: correlação com Linfangiogênese e implications
• Regulação negativa da expressão de SPARC diminui câncer gástrico celular invasão e survival