Metalotioneína 2A inhibe la activación de NF-kB y predice el resultado clínico segregados con el estadio TNM en pacientes con cáncer gástrico tras resection

radical metalotioneína 2A inhibe la activación de NF-kB y predice el resultado clínico segregados con el estadio TNM en pacientes con cáncer gástrico después de la resección radical
Resumen Antecedentes

metalotioneína 2A (MT2A) como una proteína de estrés, juega un papel protector en la barrera de la mucosa gástrica. Su papel en el desarrollo de cáncer gástrico (GC) no está clara. El mecanismo de MT2A será investigado en la tumorigénesis gástrico. Se detectó
Métodos
MT2A expresión en 973 especímenes gástricos. La función biológica se determinó a través ectópico MT2A expresar in vitro e in vivo

. Los posibles efectores de MT2A se investigaron en la señalización NF-kB. Los niveles de proteína de MT2A, I? B-α y p-I? B-α (Ser32 /36) expresión se analizaron en un subgrupo de 258 pacientes mediante la tinción IHC. Los efectos pronósticos de MT2A, estado de I? B-α y el estadio TNM se calculan utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank.
: Resultados de la disminución de la expresión MT2A se detectó en las líneas celulares y los tumores primarios de GC. En los datos clínicos, la pérdida de MT2A (+ MT2A en normal (n = 171, 76,0%); metaplasia intestinal (n = 118, 50,8%); GC (n = 684. 22.4%, P Hotel < 0.001)) se asoció con un mal pronóstico (P Hotel < 0,001), el estadio TNM avanzada (P = 0,05
), y la baja regulación de la expresión de I? B-α (P Hotel < 0,001). Por otra parte, MT2A fue la firma de pronóstico independiente segregados del estado de I? B-α y las características patológicas. Además, MT2A inhibió el crecimiento celular por apoptosis y G2 /M detención, que regula negativamente la ruta de NF-kB a través de la regulación de I? B-α y la baja regulación de p-I? B-α y la expresión de ciclina D1.
Conclusiones
MT2A podría jugar un supresor tumoral a través de la actividad inhibidora de la señalización NF-kB y puede ser un biomarcador pronóstico y objetivo potencial para la terapia individual de los pacientes con cáncer gástrico.
Palabras clave
metalotioneína 2A señalización NF-kB cáncer gástrico pronóstico TNM etapa de fondo
Qué hay de nuevo
Abundancia de metalotioneína 2A (MT2A) exhibe en la barrera mucosa gástrica, pero su papel en la progresión del cáncer gástrico (CG) todavía no está claro. En este análisis de 171 tejidos normales gástricas, 118 metaplasia intestinal, y 684 cánceres gástricos primarios, disminuyó MT2A se correlacionó significativamente con un mal pronóstico. Se inhibió la proliferación de células de GC a través de NF-kappa B inactivación de señalización. Estos resultados indican que MT2A puede ser un importante marcador pronóstico y la diana terapéutica para la GC.
Cáncer gástrico (CG) es el tumor maligno más frecuentemente diagnosticado y sigue siendo una importante carga de cáncer en Asia, especialmente en China [1, 2]. La mayoría de los pacientes sometidos a cirugía de GC ya están en una etapa avanzada y la supervivencia a 5 años es variada. Varios factores histológicos se han notificado a ser factores pronósticos de GC, incluyendo el tamaño del tumor, la clasificación de la OMS, el sistema de la etapa del tumor-nódulo-metástasis (TNM), y el grado de diferenciación [3, 4]. Sin embargo, el pronóstico de los pacientes de GC en la misma etapa sigue siendo incompatible [5]. Por lo tanto, la identificación de marcadores de diagnóstico específicos y diana terapéutica permitiría predicción fiable, la extensión efectiva de la supervivencia postoperatoria y la calidad de vida de los pacientes [6].
Estrés celular se ha demostrado que desempeñan un papel en la regulación molecular de la carcinogénesis [7, 8]. Las metalotioneínas (MTs) como las proteínas de estrés de bajo peso molecular y rica en cisteína tienen la capacidad de una alta afinidad por iones metálicos y eliminadores de ROS. MT2A como la isoforma principal de MTs juega un papel importante en la barrera de la mucosa gástrica en pacientes con gastritis y roedores modelos [9, 10]. Pre-administración de MT2A exógeno o pre-inducción de MT2A endógena puede proteger el estómago y el hígado contra el daño inducido por el estrés e inhibir la formación de peróxido de lípidos inducida por el estrés, lo que implica un efecto protector de MT2A sobre la patogénesis inducida por el estrés y una diana terapéutica potencial aplicada para la prevención temprana [11] - [13]. Recientemente, MT2A juega un papel importante en la tumorigénesis y progresión de múltiples carcinomas incluyendo GC [14]. La pérdida de ratones gen MT2A predispuesto a hepatocarcinogenesis dietilnitrosamina inducida mediante la activación de NF-kB genes diana, lo que demuestra que MT2A protege a los ratones de daño hepático hepatocarcinógeno inducida y la carcinogénesis, lo que subraya su potencial aplicación terapéutica contra el cáncer hepatocelular [15]. En algunos estudios se centran en el papel de MT2A en la protección contra las lesiones gástricas
H. pylori inducida por el uso de ratones MT-nulos. Himeno, S. descubrió que la activación de NF-kappa B y la expresión de quimiocinas mediadas por NF kappa B en células gástricas fueron marcadamente mayor en los ratones MT2A nulo que en los ratones de tipo amplia [9]. Estos datos implican que se da cuenta de MT2A control negativo del factor de transcripción actividad de NF-kB, pero su papel en la carcinogénesis gástrica es todavía ambigua [16] - [18].
Activación aberrante de NF-kappa B se asocia con la inflamación celular, malignidad , y la progresión tumoral [7, 19]. La actividad funcional de NF-kB se inhibe mediante la unión a su inhibidor, I? B-α. La activación de NF-KB es resultado de la degradación mediada por proteasoma de I? B-α por la fosforilación del inhibidor (p-I? B-α), lo que sugiere que la vía NF-kappa B es una diana potencial para la terapia individual [20] - [23] .
Cierta evidencia indica que el aumento de expresión MT2A es importante para la progresión del cáncer, y MT2A se propone inicialmente como un proto-oncogén en mama, esofágico, de próstata, y cáncer de ovario, asociada con malignidad y mal pronóstico [24] - [27 ]. Por el contrario, es el regulado en tumores gastrointestinales y carcinomas hepatocelulares, donde se MT2A ya sea inversamente correlacionada o no con la mortalidad [28, 29]. Sin embargo, la variación de MT2A y su evaluación clínica sigue siendo contradictoria en GC [28, 30, 31]. Estos resultados sugieren que la desregulación de MT2A está implicada en la patogénesis del tumor, aunque el papel exacto todavía no está claro en GC.
Por lo tanto, nos hemos centrado para revelar la co-expresión de MT2A y el gen I? B-α correlacionada con características patológicas clínicos y resultados en una gran escala de los tumores gástricos con los datos de seguimiento a largo plazo. Por otra parte, hemos considerado sistemáticamente el papel de MT2A como una proteína de estrés y regulador negativo de la activación de NF-kB para caracterizar su función biológica y mecanismo molecular in vitro e in vivo

.
Métodos
Características de los pacientes se evaluaron muestras de tumores gástricos
de 684 pacientes con cáncer gástrico tratados en el hospital de cáncer de Beijing 1997-2007. Los pacientes incluidos 513 hombres (75,0%) y 171 mujeres (25,0%) con una edad media al diagnóstico de 54 años (rango, 19 a 81 años). El período de seguimiento fue de 1 127,2 meses (mediana, 34,2 meses). Todos los pacientes fueron sometidos a resección radical con intención curativa. Ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia neoadyuvante o radioterapia antes de la cirugía. Los criterios de inclusión de todos los pacientes es: (a) la clasificación de un diagnóstico GC distintivo basado en la sexta edición del tumor-nódulo-metástasis (TNM) de la Unión Internacional contra el GC, (b) una resección radical, (c) adecuados fijadas con formalina, incluidos en parafina tejidos. El total de 684 GC tenía los datos clínico-patológicos (denominado como "cohorte"). Por otra parte, un conjunto de 258 muestras elegibles se obtuvieron de la cohorte con datos de seguimiento a 10 años (denominado como 'subgrupo'). La evolución clínica de los pacientes se registró a partir de la fecha de la cirugía a la fecha de la muerte. Además, se recogieron 118 metaplasia intestinal (MI) y 171 tejidos gástricos normales de estos pacientes GC. La evaluación histológica fue realizada por tres patólogos altos. El desglose demográfico de la cohorte y subconjunto se enumeran en la Tabla 1. Además suplementario, 36 tumores gástricos emparejados con los tejidos normales adyacentes se molió a un polvo en nitrógeno líquido para RT-PCR y PCR en tiempo real de las isoformas de MT (archivo1 adicional). Tabla 1 análisis de regresión logística de las características clínico y el pronóstico en GC
variables aleatorias
No. de los casos (n = 258) guía empresas Supervivencia tiempo (mes)
P-valor

Sexo Masculino

186
66,4 ± 4,6
Mujer
72
54,1 ± 4,8
0,604
edad media al diagnóstico Hotel < 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
etapa 85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM
I
34
105,5 ± 7,7 vs.
I IV Hotel < 0,001
II
57
74,0 ± 5,9 vs.
II IV Hotel < 0,001
III
115
49,1 ± 3,4 vs.
III IV
0,010
IV
profundidad de 52
35,8 ± 4,1
tumor pT1

13
87,2 ± 9,9 vs.
pT1 pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1 vs.
pT2 pT4 Hotel < 0,001
pT3
157
49,1 ± 2,9 vs.
pT3 pT4
0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
estado de los ganglios linfáticos
pN0
78
89,8 ± 6,2 vs.
pN0 pN3
0,001
pN1
115
50,5 ± 3,4 vs.
pN1 pN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0 vs.
pN2 pN3
0,326
pN3
16
47,5 ± 12,6 metástasis distante

pM0
232
67,5 ± 4,3
pM1
26
27,6 ± 5,8 Hotel < 0,001
grado de diferenciación
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
expresión
204 59,8 ± 4,4
0,011
MT2A Hotel < 0,001
baja
202
53,9 ± 3,4
alta
56
86,9 ± 9,2
I? B-α expresión
baja
164
61,6 ± 4,9
alta
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-I? B-α expresión
baja
126
74,1 ± 5,3
alta
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: no hay metástasis a distancia; M1: metástasis a distancia;
D1: bien diferenciados /GC-moderadamente; D0: GC pobremente diferenciados análisis inmunohistoquímico
tinción IHC en matriz de tejido se realizó con el anticuerpo MT2A. (Dilución 1: 100; 18 hasta 0133, Invitrogen, CA, EE.UU.), anticuerpos p-I? B-α (1 : 200 dilución; ab47752, Abcam, Cambridge, Reino Unido), el anticuerpo I? B-α (dilución 1: 300; sc-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). Para cada biomarcador, las imágenes se puntuaron visualmente por tres patólogos que desconocían el resultado clínico. Las discrepancias se resolvieron por consenso. Las puntuaciones se asignan como un porcentaje de tinción positiva en cada cilindro. El valor porcentual media de los dos núcleos se calculó para representar un tumor (archivo1 adicional). Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer gástrico BGC823, MGC803, SGC7901 y PAMC82 se establecieron en China y adquiridos de banco de tejidos de Shanghai (Shanghai, China). Especialmente, las células BGC823 exhiben alta tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, las líneas de RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 y SNU-16 celulares se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, EEUU). GES-1, una línea celular inmortalizada humana gástrica epitelial, se generaron mediante transfección viral de SV40 en el Hospital de Cáncer de Beijing y se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 [32].
MTT y el ensayo de agar blando
las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos, y MTT se añadió a las células a 1-5 días. MTT (5 mg /ml) se retiró después de 4 h de incubación, y después se añadió sulfóxido de dimetilo (DMSO) para solubilizar el producto de formazán. La absorbancia a 490 nm /570 nm se ensayó mediante un lector de microplacas (Bio-rad680 ELISA). Las células se incubaron a continuación durante 4 semanas, se tiñeron con tetrazolio INT colorante vital (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) para documentar la presencia o ausencia de colonias de células viables. El agar blando se fijó con 100 de metanol-ácido acético l.: Ensayo de tumorigenicidad (3 1 vol /vol) y se contaron las colonias
BGC823 células (5 × 10 5 células suspendidas en 0,1 ml PBS) transfectadas con MT2A se inyectaron sobre-expresado vector o vector vacío por vía subcutánea en el flanco dorsal de cinco 4 semanas de edad clones de ratones Balb /C ratones desnudos (MT2A-expresión de la derecha y de control de vectores clones de la izquierda. se midió el diámetro del tumor y documentado cada 5 días se calculó el volumen del tumor según la fórmula AB 2/2 (a > b)... al final de 25 días, todos los ratones fueron sacrificados y se midió el volumen del tumor tres experimentos independientes fueron realizó y dio los resultados similares. los animales fueron mantenidos en instalaciones aprobadas por la asociación para la evaluación y acreditación de Laboratorio Animal Care, de acuerdo con la normativa vigente y las normas internacionales.
el análisis estadístico χ

2 pruebas estadísticas y Estudiante de t-test
se utilizaron para comparar las características de pre-tratamiento de los casos de pacientes. La supervivencia relacionada con el cáncer se analizó mediante el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante pruebas de log-rank. La prueba de rangos de Spearman y la prueba exacta de Fisher se aplicaron para demostrar correlaciones clínico-patológicas. Un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox se utilizó con intervalos de 95% asociados de confianza (IC) y los valores de P
. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y P
valores de menos de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS (versión 16.0; SPSS Inc., Chicago, IL).
Estudiar la aprobación MyBestPlay Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital de Cáncer de la Universidad de Pekín. La utilización de tejidos humanos y los datos clínicos fue de acuerdo a las directrices del hospital y aprobado por el Comité Ético local.
: Resultados de la disminución de la expresión MT2A es un evento molecular en líneas celulares y tumores primarios de GC
Expresión de MT2A se evaluó mediante RT-PCR y Western blot en un panel de líneas celulares de GC y GES1, que se sirve como "control normal". Como se muestra en la Figura 1A, MT2A ARNm varió sustancialmente con los más altos niveles en GES1. se observó falta o disminución de la expresión MT2A en BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 y las células N87. El nivel de proteína de expresión MT2A se detectó más en las seis líneas comunes utilizados GC celulares (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, y MKN45) en comparación con GES1. El análisis de transferencia Western mostró que, en las seis líneas celulares de GC de uso común, los niveles de expresión eran MT2A ausente o baja en comparación con GES1, consistente con la expresión del ARNm detectado anteriormente (Figura 1B). Especialmente, BGC823, MGC803 y SGC7901 células con falta de expresión MT2A exhiben alta tumorigenecity en ratones desnudos. Figura 1 Ausencia o disminución de la expresión de MT2A se detecta en líneas celulares y tumores primarios de GC. Un nivel, mRNA MT2A se midió mediante RT-PCR en líneas celulares de GC y la normal de células inmortales línea GES1. Y los análisis semi-cuantificación se realizaron con imagetool 3.0 software de escaneo en escala de grises (normalizado a los niveles de ß-actina). El experimento se realizó por triplicado. B, nivel de proteína MT2A se determinó mediante análisis de transferencia Western en líneas celulares de cáncer gástrico y la normal de las células inmortales alineación GES1. Las bandas de proteína fueron escaneados MT2A (normalizados los niveles de ß-actina). C, La expresión diferencial de MT2A transcrito de ARNm en 36 tejidos GC emparejados y tejidos normales adyacentes. Las bandas MT2A mRNA fueron escaneados (normalizados los niveles de ß-actina). D, se detectaron niveles de proteína MT2A en los 36 tejidos GC emparejados por Western Blot. Las bandas de proteína fueron escaneados MT2A (normalizados los niveles de ß-actina). E, Disminución MT2A se observó durante la transformación maligna gástrica. (A) una intensa tinción de MT2A en los tejidos normales, (b) la tinción moderada de MT2A en los tejidos de mensajería instantánea, (c) débil tinción de MT2A en los cánceres gástricos primarios moderadamente diferenciados y (d) la expresión negativa de MT2A en GC pobremente diferenciados (aumento original × 400). (D) En comparación con las muestras normales y precancerosas lesiones de mensajería instantánea, la reducción de MT2A fue un evento molecular común en la carcinogénesis gástrica (P Hotel < 0,001) F: Expresión diferencial de MT2A en GC, mensajería instantánea y los tejidos normales mediante tinción IHC. Negativo: Puntuación 0; Débil: puntuación 1-4; Fuerte: anotar 5-12. Para más detalles, ver el archivo1 adicional.
36 tumores primarios de GC con los tejidos normales adyacentes también fueron examinados en la figura 1C y D, para confirmar los resultados derivados de las líneas celulares de GC, disminuyó MT2A ARNm se muestra en los GC en comparación con la de controles emparejados normales (27/36, 75,0%, P Hotel < 0,001, Figura 1C). Bajo la expresión de la proteína MT2A se detectó en 29 de los 36 casos de CG (80,6%) en comparación con los tejidos normales emparejados (P Hotel < 0,001, Figura 1D). El nivel de ARNm de MT2A fue correlacionada con el nivel de proteína detectada por Western blot (R = 0,510, P = 0,009
). En los seres humanos, los MTs están codificadas por una familia de genes que consta de 10 isoformas MT funcionales y las proteínas codificadas se subdividen convencionalmente en cuatro grupos, MT1, MT2, MT3, MT4 y proteínas. Dado que las regiones codificantes de las isoformas de MT están muy conservadas en los niveles de transcripción y proteínas, MT2A es altamente homóloga con MT1G, MT1E y MT1F (archivo adicional 1: Figura S1B). Por lo tanto, los experimentos en cualquier isoforma individuo deben llevarse a cabo cuidadosamente para asegurar que se analiza la isoforma exacta. En este estudio, la diferencia se observó expresión de los transcritos MT1 en líneas celulares de cáncer gástrico y tumores primarios de GC con controles adyacentes normales (n = 36) (archivo adicional 1: Figuras S1A y S2). Nos autenticados gen MT2A real baja regulación en GC significativamente en comparación con los tejidos normales adyacentes (27/36, 75%, Figura 1C). No hubo diferencias de las transcripciones MT1E y MT1F mRNA y MT1G en condiciones normales y muestras de tumores, así como MT1B ARNm transcrito no era detectable en todas las células y tejidos (archivo adicional 1: Figuras S1A y S2).
Para investigar la candidatura de MT2A en la tumorigénesis gástrico, que inicialmente se caracteriza el estado de expresión MT2A en 171 tejidos normales, IM 118 y 684 muestras de GC por tinción IHC. El anticuerpo para MT2A (E9 18 a 0133, Invitrogen) no es específico para MT-2A solamente, y reacciona de forma cruzada con MT-1, en cierta medida, incluso si se clona por toda la longitud de MT2A. Puesto que no hay anticuerpos específicos para detectar MT2A, de manera que usamos el anticuerpo comercial común para la tinción IHC que fue publicado en estudios más relacionados, la expresión MT2A se clasifica como de alta y baja expresión en tejidos normales apariencia, mensajería instantánea y los GC primaria. Alto nivel de expresión MT2A se detectó en 153 de 684 (22,4%) casos de CG, y 60 de 118 (50,8%) casos de mensajería instantánea, así como 130 de 171 (76,0%) casos normales apariencia, respectivamente (archivo1 adicional: Tabla S3 , P
< 0,001), se consistió con transcripciones MT2A ARNm y la expresión de proteínas por transferencia Western. La expresión de MT2A se clasificó como casos negativos, débiles y fuertes en 13 (7,6%), 28 (16,4%) y 130 (76,0%) de 171 tejidos normales, respectivamente; En los tejidos de mensajería instantánea, 27 (22,9%), 31 (26,3%) y 60 (50,8%) de un total de 118 casos de IM fueron detectadas respectivamente; En las muestras de GC, 494 (72,2%), 37 (5,4%) y 153 (22,4%) de un total de 684 casos de CG se detectaron respectivamente (Figura 1F, fichero1 adicional). Hubo una disminución de la expresión de la proteína gradualmente MT2A en IM y GC (P
< 0,001, figura 1E y F). Está claro que MT2A mRNA fue altamente expresado en las células GES1 y tejidos normales, pero se redujo o se pierde en la mayoría de las células de GC y tejidos. Estos resultados sugieren que la disminución de MT2A es un evento molecular en la tumorigénesis y progresión.
Expresión MT2A se correlaciona con mal pronóstico en GC
MT2A era con frecuencia el regulado en el GC. Para explorar si la expresión MT2A fue un factor pronóstico en GC humano, expresión de la proteína MT2A fue examinado en el subconjunto de tinción IHC. Las muestras individuales se clasificaron como bajo (MT2A-) o de alta expresión (MT2A +). MT2A- se asoció con una pobre supervivencia global (Figura 2A, P
< 0,001). El análisis univariante indicó que algunos factores que incluyen disminución de la expresión MT2A (P Hotel < 0,001), el estadio TNM (P Hotel < 0,01), la profundidad del tumor (P Hotel < 0,05), los ganglios linfáticos (P
< 0,05), metástasis a distancia (P
< 0,001) y el grado de diferenciación (P
= 0,011) se correlaciona con escasa supervivencia (Tabla 1). Cox análisis multivariado mostró que la supervivencia global se asoció con la expresión MT2A (+ MT2A frente MT2A- hazard ratio [HR], 0,429; IC del 95%, 0,187 a 0,683; P = 0,002
, Tabla 2). Se estimó el potencial importancia clínica de MT2A correlacionando su patrón de expresión con los parámetros clínicos (archivo1 adicional: Tabla S4). MT2A exhibió una amplia correlación positiva con la diferenciación del tumor (P
< 0,001) e inversa correlación con el estadio TNM (P
= 0,05). Estos resultados indican que MT2A está correlacionada con características patológicas clínicos y la supervivencia en pacientes GC. Figura 2 Análisis de MT2A combinado con el estadio TNM para predecir el resultado clínico en GC. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier de supervivencia global para la expresión MT2A acuerdo con el estadio TNM. Un valor, pronóstico de la expresión MT2A en pacientes GC era beneficio para predecir el resultado de los pacientes, baja expresión de MT2A se asocia a peor supervivencia global (P < 0,01
); B, el estadio TNM fue beneficio para la predicción pronóstica en pacientes con cáncer gástrico. C D, Valor pronóstico de MT2A en el estadio TNM I-II y fase III-IV (P = 0,048
, P <
0,001, respectivamente); E F, el valor pronóstico de la expresión MT2A en la metástasis de los ganglios linfáticos o no (P Hotel < 0,001, P = 0,052
, respectivamente); G. valor pronóstico de la expresión MT2A en ningún subgrupo de metástasis a distancia (n = 232, P Hotel < 0,001); H. Valor pronóstico de MT2A en pT3-pT4 subgrupo (P Hotel < 0,001). Todos los datos implican que MT2A podría ser una firma de pronóstico eficaz.
Tabla 2 Análisis de regresión de Cox de características clínico-patológicos y firmas moleculares de GC
El análisis multivariado
Covariate por el punto
cociente de riesgos
95% IC
P-
valor
Edad ≥ 60 años
1.300
0,840-1,934 0,254

Sexo
0.823
0,499 a 0,292 1.233

Diferenciación
0,753
0,509 a 0,875 1.778

tumor invasivo profundidad
1.914
1.389 a 2.638 Hotel < 0,001
linfa estado de los ganglios
1.291
1,034-1,612 0,024

metástasis a distancia
2.595
1,332-5,056 0,005

MT2A
0,429
0,187-0,683 0,002

I? B-α
0.779
0,524-1,311 0,423

p-I? B-α
1.857
1,256-2,912 0,003

significado pronóstico de MT2A combinado con el estadio TNM en pacientes GC
Para aclarar aún más la expresión MT2A en importancia pronóstica, que combina la expresión MT2A con las características clínico-patológicas en GC. El objetivo fue evaluar el pronóstico de los pacientes con GC clasificación patológica, y para investigar si la clasificación patológica debe ser aún más sub-clasificarse para la predicción más precisa del resultado. Como se muestra en fichero1 adicional: Tabla S4, la expresión MT2A en GC se asoció con el estadio TNM y la diferenciación del tumor, lo que implica que MT2A puede ser un biomarcador molecular potencial para predecir la clasificación patológica en GC. Como covariables dicotómicas, tanto MT2A y el estadio TNM fueron predictores independientes de la supervivencia (Tabla 2, Figura 2A y B). Significado pronóstico de la expresión MT2A se analizó adicionalmente en pacientes con cáncer gástrico según el sistema de clasificación pTNM. Hubo una diferencia significativa en la supervivencia global entre los pacientes con expresión MT2A en ambos grupos de la etapa (P
= 0,048 y P <
temprano (I y II) y avanzada (IV III y); 0,001, respectivamente; Figura 2C y D). Por otra parte, el estado de la expresión MT2A también fue eficaz para el pronóstico de las mismas etapas (P = 0,052
, Figura 2E; P Hotel < 0,001, Figura 2F; P Hotel < 0,001, Figura 2G y P
< 0,001, Figura 2H). Estos datos representan que MT2A es una firma molecular para predecir el resultado clínico basado en el estadio TNM.
Restauración de MT2A resultados de la expresión en la supresión del crecimiento de las células GC in vitro e in vivo

Para revelar el mecanismo de MT2A en GC, que transfectadas establemente MT2A sobreexpresado plásmido y vector vacío en tres líneas celulares (GC BGC823, SGC7901 y AGS). Se examinó el crecimiento, las tasas de apoptosis y el ciclo celular de estas líneas celulares transfectadas con MT2A plásmido. La viabilidad celular se reduce en las células GC MT2A la re-expresión mediante el ensayo de MTT (BGC823, P = 0,0038
, la figura 3B; AGS, P = 0,0007
, fichero1 adicional: Figura S3 A; SGC7901, P = 0,0004
, fichero1 adicional: Figura S3C). Para investigar más a fondo la función de MT2A en líneas celulares de GC, se analizaron los efectos de la expresión MT2A sobre la proliferación celular y la regulación del ciclo celular por Anexina-V /PI tinción y análisis de citometría de flujo. Más apoptosis se detectó en estas células GC re-expresión de MT2A (P
< 0,01, respectivamente, la figura 3F; archivo1 adicional: Figura S3A y C). Además, se observó detención en G2 /M en células de GC usando la expresión ectópica de MT2A. Las proporciones de la fase G2 /M en grupos MT2A eran dos veces superiores a los de los grupos de vectores hicieron (P Hotel < 0,01, respectivamente, Figura 3E y fichero1 adicional: Figura S3 B y D). Figura 3 La expresión ectópica de MT2A inhibe GC crecimiento celular in vitro e in vivo. MT2A inhibe la proliferación celular y la formación de colonias en las células de GC humanos. Se detectó una, Western blot de MT2A en BGC823 células transfectadas con la expresión ectópica de MT2A plásmido y vector vacío. Las bandas de proteína fueron escaneados MT2A (normalizaron a ß-actina en el control de la carga). B, la proliferación celular se analizó mediante el ensayo de MTT en la re-expresión de MT2A BGC823 células o no. Los datos se muestran como la media ± .SD de tres experimentos independientes. C, Crecimiento de BGC823 células se analizó en un medio de agar blando semisólido. Las colonias vector vacío formado estadísticamente significativamente más colonias (media = 426 grandes colonias por placa IC del 95%:. 387-472 colonias) de clones MT2A (media = 136 colonias IC del 95%:.. 100-164 colonias Los números representan la media número de colonias de tres experimentos independientes ± SD se calculó el número relativo de células de control y BGC823-MT2A, y se analizaron mediante la t de Student
-test (P = 0,0038
). D, MT2A inhibida tumorigenicidad de células BGC823 . en ratones desnudos El volumen medio del tumor para BGC823-MT2A a las 3 semanas después de la inyección fue de 112 mm3 (95% IC: 93 a 147 mm 3), en comparación con los 352 mm3 (95% IC: 298-423 mm3) para BGC823-vector. los datos representan la media ± SD de volumen de los tumores derivados de cada grupo. en cada grupo, los tamaños tumorales se midieron usando un calibrador en los puntos de tiempo indicados. los datos se muestran como media ± SD de detección (t-
prueba, P
= 0,0027) e, el análisis FACS demostró que MT2A sobre-expresión llevó a G2 /M detención, y la relación de fase G2 /M fue mayor que en las células de control y de los padres vacíos (P < 0,01
). F, efecto antitumoral de MT2A se detectó mediante ensayo de tinción con anexina V /FITC-PI. Porcentaje de células apoptóticas fue 52,9% ± 5,4% en el grupo MT2A comparación con la de las células parentales (8,3% ± 2,4% y las células transfectadas con el vector vacío (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Además, hemos plateó BGC823 células reprimir MT2A o no en agar blando, la expresión ectópica de MT2A se confirmó por análisis de transferencia de Western primera (Figura 3A). Después de 3 semanas de expresión cultura MT2A causaron una reducción estadísticamente significativa en la formación de colonias (P
= 0,0053, Figura 3C). Además, hubo una inhibición del crecimiento dramático de MT2A-re-expresión de las células en comparación con el control negativo (P = 0,0027
, Figura 3D) en los modelos de xenoinjerto. Estos datos demuestran que MT2A podría desempeñar un papel en la supresión de la proliferación de las células GC in vitro e in vivo

.
MT2A reprime la actividad de NF-kB a través de I? B-α regulación
se informó que la pérdida de MT2A inducida activación de la señal NF-kB en el modelo de ratón transgénico (MT2A-knock out) [15]. Pero el papel de MT2A como amigo o enemigo en la vía de señalización NF-kB seguía siendo controvertida [18, 33]. Con el fin de interpretar el mecanismo de MT2A mediada GC supresión del crecimiento celular in vivo e in vitro

, tratamos de explorar la posible relación entre MT2A y NF-kB vía de señalización, y el mecanismo interno todavía no estaba claro en GC . MT2A y de los principales genes en la señalización de NF-kappa B, tales como p65, I? B-α, p-I? B-α y el efector aguas abajo de la señalización de NF-kappa B, ciclina D1 se detectaron en este estudio (archivo1 adicional). La expresión ectópica de MT2A inducida tanto mRNA y expresión de la proteína de I? B-α en todas las líneas celulares GC investigados (BGC823, SGC7901 y AGS), los niveles de estado estacionario de I? B-α mRNA se incrementaron 5,5 veces en BGC823 células MT2A la re-expresión de 48 marido. En AGS y SGC7901 células, se observó un 7,2 veces y 4,3 veces la inducción de I? B-α mRNA (Figura 4A), los niveles de proteína relativos fueron consistentes con los transcritos de ARNm, y la proteína p-I? B-α disminuyó en los que GC Las células transfectadas MT2A vector (Figura 4B). Como se muestra en las figuras 4C y D, desmontables de MT2A endógeno en células GES1 llevó a la baja regulación de I? B-α expresión, así como la regulación de p-I? B-α y la expresión de ciclina D1, lo que sugiere una conexión entre la actividad MT2A y I? B -α expresión. Estos experimentos indican que MT2A induce la expresión de I? B-α en el ARNm y los niveles de proteína. Y MT2A mediada por la regulación de la expresión de I? B-α fue confirmado por inmunofluorescencia (Figura 5A, fichero1 adicional). Tabla S2. Tabla S3. Tabla S4. Tabla S5. Tabla S6. Figura S1. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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