Metalothioneín 2A inhibuje aktiváciu NF-kB dráhu a predpovedá klinický výsledok po radikálnej resection

metalothioneín 2A oddelené s TNM štádiu u pacientov s karcinómom žalúdka inhibuje aktiváciu NF-kB dráhu a predpovedá klinický výsledok po radikálnej resekcii
Abstrakt oddelené s TNM štádiu u pacientov s rakovinou žalúdka
pozadí
metalothioneín 2A (MT2A) ako stresové proteíny, zohráva ochrannú úlohu v žalúdočnej sliznice bariéry. Jeho úloha v rozvoji rakoviny žalúdka (GC) je nejasný. Mechanizmus MT2A budú skúmané v žalúdočnej vzniku nádorov.
Metódy
MT2A expresie bola detekovaná u 973 žalúdočných vzoriek. Biologická funkcia bola stanovená pomocou ektopickú expresiou MT2A in vitro a in vivo
. Možné nadväzujúce efektory MT2A boli skúmané v NF-kB signalizácia. Úrovne proteínovej MT2A, IKB-a a p-IKB-a (ser32 /36) expresie boli analyzované v podskupine 258 pacientov pomocou IHC farbenie. Prognostické účinky MT2A, stav IKB-a a TNM fázy boli hodnotené za použitia metódy Kaplan-Meier a porovnané pomocou log-rank testu. Výsledky
Znížené MT2A expresie bola zistená v bunkových líniách a primárne nádory GC. V klinických dát, stratu MT2A (MT2A + v normálnej (n = 171, 76,0%), črevné metaplázia (n = 118, 50,8%), GC (n = 684. 22,4%, P Hotel < 0,001)) bola spojená so zlou prognózou (P Hotel &0,001), pokročilé štádium TNM (P
= 0,05) a down-reguláciu expresie IKB-alfa (P Hotel &0,001). Okrem toho, MT2A bol nezávislý prognostický podpis oddelení od stavu IKB-alfa a patologické rysy. Okrem toho, MT2A inhibujú rast buniek prostredníctvom apoptózy a G2 /M zástave, čo negatívne regulovaný NF-kB prostredníctvom dráhy up-regulácia IKB-a a down-reguláciu p-IKB-a a cyklin D1 expresie
. Závery
MT2A môže hrať tumor supresívnu aktivitu cez inhibíciu NF-kB signalizácie a môže byť prognostický biomarker a potenciálnym cieľom pre individuálnu liečbu pacientov GC.
Kľúčové
metalothioneín 2A NF-kB signalizácia karcinóm žalúdka prognóza TNM pozadia
Čo je nové
Dostatok metalothioneín 2A (MT2A) exponátov v žalúdočnej slizničnej bariéry, ale jeho úloha v progresii rakoviny žalúdka (GC) je stále nejasná. V tejto analýze 171 normálne žalúdočné tkaniva, 118 črevnej metaplázia, a 684 primárnych karcinómov žalúdka, zníženie MT2A významne koreluje so zlou prognózou. Inhibuje proliferáciu GC buniek prostredníctvom NF-kB signalizácia inaktiváciu. Tieto výsledky naznačujú, že MT2A môže byť dôležitý prognostický marker a terapeutický cieľ pre GC.
Karcinómu žalúdka (GC) je najčastejšie diagnostikovaná malignity a stále značnú záťaž rakoviny v Ázii, najmä v Číne [1, 2]. Väčšina pacientov GC podstupujúci chirurgický zákrok je už v pokročilom štádiu a prežitie 5 rokov je rozmanitá. Boli hlásené niekoľko histologické faktory ako prognostické faktory GC, vrátane veľkosti nádoru, klasifikácia WHO, javiskové systém tumor-node-metastázy (TNM) a diferenciácie stupňa [3, 4]. Avšak, prognóza pacientov GC v rovnakej fáze je stále v rozpore [5]. Preto, identifikácia špecifických diagnostických markerov a terapeutický cieľ by umožnila spoľahlivú predpoveď, efektívne rozšírenie pooperačné prežitie a kvalitu života pacientov [6].
Cellular stres bolo preukázané, že hrá úlohu v regulácii molekulovej karcinogenézy [7, 8]. Metalotioneínu (MTS) ako stresové proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou a bohatou-cysteínu majú schopnosť vysokou afinitou pre kovové ióny a ROS zachycovačov. MT2A ako hlavný izoformy MT hrá dôležitú úlohu v žalúdočnej sliznice bariéry u pacientov s gastritídou, a na modeloch hlodavcov [9, 10]. Pre-podanie exogénneho MT2A alebo pre-indukcii endogénnej MT2A môže chrániť žalúdok a pečeň proti poškodeniu vyvolaná stresom a inhibujú tvorbu stresom indukovanej peroxidom lipidu, čo znamená, ochranný účinok MT2A na patogenéze vyvolaná stresom a potenciálny terapeutický cieľ aplikovaný pre včasnú prevenciu [11] - [13]. V poslednej dobe, MT2A hrá dôležitú úlohu pri vzniku nádorov a progresii rôznych karcinómov, vrátane GC [14]. Strata myšou MT2A génu s predispozíciou k diethylnitrosamine vyvolanej hepatokarcinogeneze aktiváciou NF-kB cieľových génov, čo ukazuje, že MT2A chráni myši pred hepatocarcinogen indukovaného poškodenia pečene a karcinogenézy, čo podčiarkuje jeho potenciálny terapeutickú aplikáciu pred hepatocelulárny rakoviny [15]. Niektoré štúdie sa zamerala na rolu MT2A na ochranu proti H. pylori
indukovanej žalúdočnej zranenia s použitím myši MT-null. Himeno, S. zistené, že aktivácia NF-kB a expresie NF-kB sprostredkovanej chemokiny v žalúdočných bunkách boli výrazne vyššie v MT2A-null myší ako u myší široký typu [9]. Tieto údaje naznačujú, že MT2A realizuje negatívnu kontrolu transkripčného faktoru NF-kB aktivity, ale jeho úloha v žalúdočnej karcinogenéze je stále nejasný [16] - [18].
Aberrant aktivácia NF-kB je spojená so zápalom buniek, zhubné bujnenie a progresiu nádorov [7, 19]. Funkčné aktivita NF-kB je inhibovaná väzbou k jeho inhibítora IKB-alfa. Aktivácia NF-kB je výsledkom proteazómu sprostredkovaná degradácia IKB-a fosforyláciou inhibítora (p-IKB-a), čo naznačuje, že NF-kB cesta je potenciálnym cieľom pre individuálne terapie [20] - [23] .
Niektoré dôkazy, že uvedené zvýšenie MT2A expresie je dôležité pre progresiu rakoviny, a MT2A je pôvodne navrhol ako preto-onkogénu v prsníku, pažeráka, prostaty, vaječníkov a rakoviny, spojené s malignity a zlou prognózou [24] - [27 ]. Na rozdiel od toho je down-regulovaná v gastrointestinálnych nádorov a hepatocelulárny karcinóm, kde MT2A buď nepriamo úmerná alebo nesúvisí s úmrtnosti [28, 29]. Avšak, variácie MT2A a klinickom hodnotení zostáva rozporné GC [28, 30, 31]. Tieto výsledky naznačujú, že regulačné poruchy MT2A sa podieľa na patogenéze nádoru, hoci presná úloha je stále nejasná v GC.
Preto sme sa zamerali odhaliť ko-expresiu MT2A a IKB-a génu koreluje s klinickými patologické rysy a výsledky vo veľkom meradle nádorov žalúdka s dlhodobými follow-up dát. Ďalej sme systematicky analyzoval úlohu MT2A ako stres bielkovín a negatívny regulátor pri aktivácii NF-kB, aby bolo možné určiť ich biologickú úlohu a molekulárnej mechanizmus, in vitro a in vivo
.
Metódy
Patient charakteristiky vzorky
nádor žalúdka od 684 pacientov liečených GC v nemocnici v Pekingu rakoviny od roku 1997 do roku 2007 boli posúdené. Pacienti zahrnutie 513 mužov (75,0%) a 171 žien (25,0%) s priemerným vekom v čase diagnózy 54 rokov (v rozmedzí od 19 do 81 rokov). Doba sledovania v rozmedzí od 1 do 127,2 mesiacov (medián 34,2 mesiacov). Všetci pacienti podstúpili radikálnu resekciu s kuratívnym zámerom. Žiadny z pacientov podstúpilo neoadjuvantnej chemoterapii alebo radiačnej terapie pred chirurgickým zákrokom. Kritériá pre zaradenie všetkých pacientov je nasledovné: (a) výrazná diagnostika GC založený na šiestej vydanie nádoru-Node-metastázy (TNM) klasifikácie Medzinárodnej únie proti GC, (b) radikálna resekcia, (c) vhodné formol pevné, parafínové vložené tkaniva. Celkom 684 GC mal klinicko-dáta (označované ako "kohorty"). Okrem toho sada 258 oprávnených vzorky boli odobraté z kohorty s 10-ročné follow-up dáta (nazývajú ako "podmnožinu"). Klinický výsledok pacientov bol zaznamenaný odo dňa chirurgie k dátumu úmrtia. Okrem toho, 118 črevnej metaplázia (IM) a 171 normálne žalúdočné tkaniva boli odobraté z týchto pacientov GC. Histologické hodnotenie bolo vykonané tromi vedúcich patológov. Demografický rozpis kohorty a podskupiny je uvedené v doplnkovom tabuľke 1. Okrem toho 36 spárované gastrických nádorov s priľahlými normálnych tkanivách sa rozomelie na prášok pod kvapalným dusíkom pre RT-PCR a real-time PCR MT izoforiem (ďalej file1). Tabuľka 1 Logistická regresná analýza klinicko-funkcií a prognózy v GC
variance
No. prípadov (n = 258)
Prežívanie (mesiace)
P-hodnota
Sex
Muž
186
66,4 ± 4.6
Žena
72
54,1 ± 4,8
0,604
vek v čase stanovenia diagnózy Hotel < 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM štádium
Aj
34
105,5 ± 7,7
Aj vs. IV Hotel < 0,001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs. IV Hotel < 0,001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs. IV
0,010
IV
hĺbke 52
35,8 ± 4,1
nádoru
PT1
13
87,2 ± 9,9
PT1 vs. PT4
0,005
pt2
50
89,1 ± 9,1
pt2 vs. PT4 Hotel < 0,001
PT3
157
49,1 ± 2,9
PT3 vs. PT4
0,159
PT4
38
40,1 ± 5,3
lymfatických uzlín stav
PN0
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs. PN3
0,001
PN1
115
50,5 ± 3,4
PN1 vs. PN3
0,212
PN2
49
46,6 ± 6,0
PN2 vs. PN3
0,326
PN3
16
47,5 ± 12,6
vzdialenej metastázy
pm0
232
67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8 Hotel < 0,001
Stupeň diferenciácie
D1
54
76,0 ± 6,0
d0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A výraz Hotel < 0.001
nízka
202
53,9 ± 3,4
s vysokým
56
86,9 ± 9,2
IkappaB-α výraz
nízka
164
61,6 ± 4,9
vysoká
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-IkappaB-α výraz
nízka
126
74,1 ± 5,3
s vysokým
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: nie vzdialených metastáz; M1: vzdialenej metastázy;
D1: no /stredne diferencované GC; D0: zle diferencované GC
imunohistochemická analýza
IHC farbenie vo tkanivovej poli bola vykonaná s protilátkou MT2A. (Riedenie 1: 100; 18-0133, Invitrogen, CA, USA), p-IKB-α protilátky (1 : 200 riedenie; ab47752, abca, Cambridge, UK), IKB-α protilátky (1: 300 riedenie, SC-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). Pri každom biomarkeru, obrazy boli hodnotené vizuálne troma patológmi, ktorí boli oslepení na klinickým výsledkom. Nezrovnalosti boli vyriešené na základe konsenzu. Skóre bolo pridelené ako percento pozitívneho farbenia v každom valci. Priemerná percentuálna hodnota z dvoch jadier bola vypočítaná reprezentovať jeden nádor (ďalej súbor1).
Bunkové línie
rakovinou žalúdka bunkových línií BGC823, MGC803, SGC7901 a PAMC82 boli založené v Číne a zakúpených v tkanivovej banky v Šanghaji (Shanghai, Čína). Zvlášť, BGC823 bunky vykazovali vysokú tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 a SNU-16 bunkové línie boli zakúpené od ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA). GES-1, imortalizovaná žalúdočné epiteliálne bunková línia ľudského, bola vytvorená SV40 vírusu transfekcia v nemocnici v Pekingu rakoviny a kultivované v DMEM médiu doplnenom sérom 10% fetálne bovinné (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) pri teplote 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% CO 2 [32].
MTT a mäkký agar test
bunky boli schovať do 96-jamkových kultivačných doštičiek, a MTT bolo pridané k bunkám na 1-5 dni. MTT (5 ug /ml), bola odstránená po 4 hodinách inkubácie, a potom bol pridaný dimetylsulfoxid (DMSO), na rozpustenie formazánu. Absorbancia pri 490 nm /570 nm bola testovaná pomocou čítačky mikrodoštičiek (Bio-rad680 ELISA). Bunky potom boli inkubované po dobu 4 týždňov, zafarbené vitálne tetrazoliového farbiva INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) dokumentovať prítomnosť alebo neprítomnosť životaschopných buniek kolónií. Mäkký agar bola stanovená s 100 ul metanolu a kyseliny octovej. (3: 1 obj /obj) a kolónie boli počítané
karcinogenity test
BGC823 bunky (5 x 10 5 bunky suspendované v 0,1 ml PBS) transfekované MT2A nadmerne exprimované vektora alebo prázdnym vektorom boli injikované subkutánne do dorzálnej boku piatich 4 týždne staré samice Balb /C nahých myší (MT2A-expresných klonov na klony pravej a kontrolné vektor na ľavej strane. priemer nádoru bol meraný a zdokumentované raz za 5 dní nádorový objem bol vypočítaný podľa vzorca ab 2/2 (a > b) ... na konci 25 dní, boli všetky myši usmrtené a bol zmeraný objem nádoru tri nezávislé experimenty boli vykonané a dal podobné výsledky. zvieratá bola udržiavaná v zariadeniach schválených združení pre posudzovanie a akreditáciu laboratória starostlivosť o zvieratá v súlade s platnými predpismi a medzinárodnými štandardmi.
Štatistická analýza
χ
2 skúšobné štatistík a Studentov
-test boli použité pre porovnanie pred liečbou charakteristiky prípadov pacientov. Prežitie nádorových ochorení bola analyzovaná za použitia metódy Kaplan-Meierovej a v porovnaní s použitím log-rank testy. Hodnosť Test Oštepár a Fisherov presný test boli použité na preukázanie klinicko-korelácia. Cox proporcionálny nebezpečenstvo regresný model bol použitý s pridruženými 95% intervalom spoľahlivosti (CIS) a P
hodnôt. Všetky štatistické testy boli obojstranné, a p
hodnoty menšie ako 0,05 boli považované za štatisticky významné. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou štatistického balíka SPSS (verzia 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL).
Štúdia schválenie
Všetky štúdie na zvieratách boli schválené etickou komisiou Peking Fakultnej nemocnice rakoviny. Využitie ľudských tkanív a klinických dát bolo vykonané podľa pokynov nemocnice a schválené miestnej etickou komisiou.
Výsledky
Znížené MT2A výraz je molekulárna udalosť v bunkových línií a primárnych nádorov GC
Expression z MT2A bola hodnotená pomocou RT-PCR a Western blot v paneli bunkových línií GC a GES1, ktorá sa podáva ako "normálny kontrolou". Ako je znázornené na obrázku 1A, MT2A mRNA v podstate meniť s najvyššou úrovňou v GES1. Nedostatok alebo zníženie MT2A expresie bola pozorovaná v BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 a N87 buniek. Úroveň expresie proteínu MT2A bola ďalej zistená v šiestich spoločných použité GC bunkových línií (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, a MKN45) v porovnaní s GES1. Western blot analýza ukázala, že, v šiestich bežne používaných GC bunkových líniách boli hladiny expresie boli MT2A chýba alebo je nízka v porovnaní s GES1, v súlade s expresiou mRNA nad detekovaná (obrázok 1B). Najmä, BGC823, MGC803 a SGC7901 bunky s nedostatkom MT2A expresie vykazujú vysokú tumorigenecity u nahých myší. Obrázok 1 chýbajúce alebo znížená expresia MT2A sú detekované v bunkových línií a primárnych nádorov GC. Úroveň, MT2A mRNA bola meraná pomocou RT-PCR v bunkových líniách GC a normálne nesmrteľná bunková línia-GES1. A semi-kvantitatívnej analýzy boli vykonané s ImageTool šedej stupnice skenovací softvér 3.0 (vztiahnuté k beta-aktínu úrovne). Experiment bol vykonaný v triplikátech. B, úroveň MT2A proteín bola stanovená analýzou Western blot v bunkových líniách GC a normálne nesmrteľné bunkové línie GES1. Proteínové pásy MT2A boli naskenované (normalizované na beta-aktínu úrovne). C, Diferenciálny expresie MT2A transkriptov mRNA v 36 párových GC tkanív a priľahlé normálneho tkaniva. V MT2A mRNA pásy boli naskenované (normalizované na beta-aktínu úrovne). D, hladiny MT2A proteínov boli detekované v 36 párových GC tkanivách pomocou Western blotting. Proteínové pásy MT2A boli naskenované (normalizované na beta-aktínu úrovne). E, znížená MT2A bolo pozorované počas žalúdočnej malígny transformáciu. (A) intenzívne farbenie MT2A v normálnych tkanivách, (b) mierne farbenie MT2A v IM tkanivách, (c) slabé farbenie MT2A v stredne diferencovaných primárnych karcinómov žalúdka a (d) negatívne expresie MT2A vo zle diferencované GCS (pôvodné zväčšenie × 400). (D), v porovnaní so vzorkami normálne a prekanceróznych lézií-IM, znižuje MT2A bol spoločný molekulárnej udalosť v žalúdočnej karcinogenéze (P Hotel &0,001) F: Diferenciálna expresia MT2A v GC, IM a normálnych tkanív IHC farbenie. Negatívny: skóre 0; Slabá: skóre 1-4; Strong: skóre 5-12. Podrobnosti nájdete v Dodatkový file1.
36 primárnych nádorov GC s priľahlými normálnych tkanivách Boli preskúmané na obrázku 1C a D, s cieľom potvrdiť výsledky získané z GC bunkových línií, sa znížil MT2A mRNA bola zobrazená v GC v porovnaní s údajmi v prispôsobená normálne kontroly (27/36, 75,0%, P Hotel < 0.001, 1C). Bola zistená nízka expresie MT2A bielkoviny v 29 z 36 prípadov GC (80,6%) v porovnaní s spárovaných normálnych tkanivách (P Hotel < 0,001, obr 1D). Hladina mRNA MT2A bola závislá na úrovni proteínu detekovanej westernovým prenosom (R = 0,510, p = 0,009)
. U ľudí, MTS sú kódované rodiny génov sa skladá z 10 funkčných MT izoforiem a kódované proteíny sú zvyčajne rozdelené do štyroch skupín, MT1, MT2, MT3 a MT4 proteínov. Vzhľadom k tomu, kódujúcich oblastí MT izoforiem sú vysoko konzervované v transkriptov a proteínové úrovni, MT2A je vysoko homológnej s MT1G, MT1E a MT1F (ďalší súbor 1: Obrázok S1B). Z tohto dôvodu, experimenty na každé jednotlivé izoformy by mali byť starostlivo vykonané, aby sa zabezpečilo, že presná izoforma je analyzovaný. V tejto štúdii, diferenciálnej expresie MT1 transkriptov bola pozorovaná v bunkových líniách GC a primárnych nádorov GC s priľahlými normálnych kontrol (n = 36) (ďalšie súbor 1: obr S1A a S2). overený sme skutočné MT2A gén, down-regulácia v GC výrazne v porovnaní so susednými normálnych tkanivách (27/36, 75%, obrázok 1C). Nebol žiadny rozdiel MT1E a MT1F a MT1G mRNA transkriptov v normálnych a nádorových vzoriek, ako aj MT1B transkriptov mRNA nebola detekovateľná vo všetkých bunkách a tkanivách (ďalší súbor 1: Údaje S1A a S2).
Skúmať kandidatúru MT2A v žalúdku vzniku nádorov, sme pôvodne charakterizoval stav MT2A expresiou v normálnych tkanivách 171, 118 IM a 684 vzoriek GC IHC farbenie. Protilátka pre MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) nie je špecifická pre MT-2A iba, a cross-reaguje s MT-1, do určitej miery, a to aj v prípade, že sa klonom do celej dĺžke MT2A. Pretože neexistuje žiadna špecifická protilátka pre detekciu MT2A, takže použijeme spoločnej obchodnej protilátky pre IHC farbenie, ktorá bola zverejnená vo väčšine súvisiacich štúdií, MT2A výraz je klasifikovaný ako nízku a vysokú expresiou v normálnych tkanivách vzhľad, IM, a primárne GC. bola detekovaná vysoká hladina MT2A expresie v 153 z 684 (22,4%) prípadov GC, a 60 z 118 (50,8%) prípadov IM, ako aj 130 171 (76,0%) bežných prípadoch vzhľad, v uvedenom poradí (ďalej file1: Tabuľka S3 , P Hotel &0,001), sa skladala s MT2A transkripcie mRNA a expresie proteínu vo Western blot. Expresia MT2A bol klasifikovaný ako negatívne, slabých a silných prípadoch, v 13 (7,6%), 28 (16,4%) a 130 (76,0%) z 171 normálnych tkanív, v tomto poradí; V tkanivách IM, 27 (22,9%), 31 (26,3%) a 60 (50,8%) z celkového počtu 118 prípadov IM boli zistené v uvedenom poradí; Vo vzorkách GC, 494 (72,2%), 37 (5,4%) a 153 (22,4%) z celkového počtu 684 prípadov GC boli detekované v tomto poradí (obrázok 1F, ďalej file1). Došlo k postupnému zníženiu expresie proteínu v MT2A IM a GC (P Hotel &0,001, obr 1E a F). Je zrejmé, že MT2A mRNA bol vysoko exprimovaný v bunkách GES1 a normálnych tkanivách, ale došlo k zníženiu alebo k strate vo väčšine GC buniek a tkanív. Tieto výsledky naznačujú, že sa znížil MT2A je molekulárna udalosť v tumorigenezi a progresii.
MT2A expresie koreluje so zlou prognózou GC
MT2A bol často down-regulované v GC. Preskúmať, či MT2A výraz bol prognostický faktor v ľudskom GC, výraz MT2A proteín bola skúmaná v podskupine pomocou IHC farbenie. Jednotlivé vzorky boli rozdelené do kategórií ako nízka (MT2A-) alebo vysokou expresiou (MT2A +). MT2A- bola spojená so zlou celkové prežívanie (obrázok 2A, P Hotel &0,001). Jednorozmerné analýza ukazuje, že niektoré faktory, vrátane zníženej MT2A výraz (P Hotel &0,001), TNM fázu (P Hotel &0,01), hĺbky nádoru (P
menšie ako 0,05), stav lymfatických uzlín (P
&0,05), vzdialených metastáz (P Hotel &0,001) a stupeň diferenciácie (P
= 0,011), boli korelované so zlou prežitie (Tabuľka 1). Cox multivariačný analýza ukázala, že celkové prežívanie bolo spojené s MT2A výrazu (MT2A + oproti MT2A- pomer rizika [HR], 0,429; 95% SNS, 0.187-0.683; P
= 0,002, tabuľka 2). sme odhadli potenciálny klinický význam MT2A korelácií svoj výraz vzor s klinickými parametrami (dodatočná file1: Tabuľka S4). MT2A vykazovali rozsiahlu pozitívnu koreláciu s diferenciáciou nádoru (P Hotel &0,001) a inverzný korelácia s TNM fáze (P
= 0,05). Tieto výsledky ukazujú, že MT2A koreluje s klinickými patologické rysy a prežitie u pacientov s GC. Obrázok 2 Analýza kombinovaného MT2A s TNM štádiu predpovedať klinický výsledok v GC. Kaplan-Meierova analýza celkového prežitia-MT2A expresiu bol použitý podľa TNM fáze. A prognostický význam MT2A expresie u pacientov s GC bola prínosom pre predpovedanie výsledkov pacientov, nízka expresia MT2A bola spojená so zlou celkové prežívanie (P <
0,01); B, TNM etapa bola prínosom pre prognostického predikciu u pacientov GC. C D, prognosticky význam MT2A v TNM štádiu I-II a štádiu III-IV (P
= 0,048, P <
0,001, príslušne); E F, Prognostická hodnota MT2A expresie v lymfatických uzlín alebo nie (P Hotel &0,001, p = 0,052
, v uvedenom poradí); G. prognostická hodnota MT2A expresie v žiadnom vzdialenej metastázy podskupiny (n = 232, P Hotel &0,001); H. prognostický význam MT2A v PT3-PT4 podskupiny (P Hotel <0,001). Všetky dáta naznačujú, že MT2A by mohol byť účinný prognostický podpis.
Tabuľka 2 Cox regresná analýza klinicko-funkcií a molekulárnych podpisov v GC
viacrozmerné analýzy
kovarianciou od koncového bodu

pomer rizika
95% CI
P-
hodnota
vek ≥ 60 rokov
1,300 0,840
na 1.934
0,254
Sex
0,823
0,499 1,233 do 0,292
Diferenciácia
0,753 0,509
na 1.778
0,875
nádor invazívne hĺbku
1,914 1,389
na 2,638 Hotel < 0,001
lymfatických stav uzla
1,291
1,034-1,612
0,024
vzdialenej metastázy
2,595
1,332-5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187 - 0,683 0,002
IkappaB-α
0,779
0,524-1,311
0,423
p-IKB-alfa
1,857 1,256
na 2.912
0,003
prognostický význam MT2A v kombinácii s TNM štádiu u pacientov GC
Pre ďalšie objasnenie MT2A výraz v prognostický význam, sme spojili MT2A výraz s klinicko-funkcií v GC. Cieľom bolo vyhodnotiť prognózu pacientov GC s patologickou klasifikáciou, a zistiť, či patologickú klasifikácii by mali byť ďalej sub-klasifikované presnejšie predikciu výsledku. Ako je uvedené v doplnkovej file1: Tabuľka S4, MT2A expresie v GC bola spojená s TNM fáze a diferenciácie nádoru, čo znamená, že MT2A môže byť potenciálnym molekulárnej biomarker predpovedať patologické zaradenie do GC. Ako dichotomických kovariátov, ako MT2A a TNM štádium boli nezávislé prediktory prežitia (tabuľka 2, obrázok 2A a B). Prognostický význam MT2A prejavu bol ďalej analyzovaný u pacientov GC podľa klasifikačného systému pTNM. Tam bol významný rozdiel v celkovom prežívaní medzi pacientmi s MT2A prejavu ako v ranom (I a II) a pokročilé (III a IV) javiskových skupín (P
= 0,048 a P Hotel < 0,001, respektíve; Obr 2C a D). Navyše stav MT2A expresie bol tiež účinný pre prognózu v rovnakých fázach (P
= 0,052, obr 2E, P Hotel &0,001, obr 2F; P Hotel &0,001, obr 2G a P
< 0,001, obr 2H). Tieto údaje predstavujú, že MT2A je molekulárna podpis predpovedať klinický výsledok na základe TNM javisku.
Obnovenie MT2A expresie vedie potlačenie rastu GC buniek in vitro a in vivo
Pre odhalenie mechanizmu z MT2A v GC, sme stabilne transfekované MT2A nadmerne exprimované plazmid a prázdneho vektora do troch GC bunkových línií (BGC823, SGC7901 a AGS). Skúmali sme rastu, apoptózy a bunkového cyklu ceny týchto bunkových línií transfekciou MT2A plazmidu. Životaschopnosť buniek bola znížená v GC buniek re-vyjadrovať MT2A pomocou MTT testu (BGC823, P
= 0,0038, 3B; AGS, P
= 0,0007, Dodatočné file1: Obrázok S3A; SGC7901, P
= 0,0004 , Dodatočné file1: Obrázok S3C). Ďalej skúmať funkcie MT2A v GC bunkových línií sme analyzovali účinky MT2A expresie na proliferáciu buniek a reguláciu bunkového cyklu od annexin-V /PI farbenie a prietokovej cytometrie. Viac apoptózy bola detekovaná v týchto GC buniek re-exprimujúcich MT2A (P
< 0,01, v danom poradí, obrázok 3F; Ďalšie file1: Obrázok S3A a C). Okrem toho, G2 /M zástava bola pozorovaná v bunkách za použitia GC ektopickú expresiu MT2A. Pomery G2 /M fázy MT2A skupín boli dvakrát vyššie ako v vektora skupín urobil (P
< 0,01, v danom poradí, obrázok 3E a ďalšie file1: Obrázok S3B a D). Obrázok 3 ektopická expresia MT2A inhibuje GC bunky rast in vitro a in vivo. MT2A inhibuje bunkovú proliferáciu a tvorbu kolónií u ľudských GC buniek. A, Western blot MT2A bola detekovaná v bunkách transfekciou BGC823 ektopickú expresiou MT2A plazmidu a prázdnym vektorom. Proteínové pásy MT2A boli naskenované (normalizované na beta-aktínu ku kontrole pre nakládku). B, množenia buniek bola analyzovaná pomocou MTT testu in re-exprimujúce MT2A z BGC823 buniek alebo nie. Údaje boli uvedené ako stredná hodnota ± .SD z troch nezávislých experimentov. C, Rast BGC823 buniek bola analyzovaná v polotuhom mäkkého testovacieho média. Prázdne vektora kolónie tvorili štatisticky významne viac kolónií (priemer = 426 veľké kolónie na misku 95% CI: 387-472. Kolóniám), než MT2A klonov (priemer = 136 kolónií 95% CI: .. 100-164 kolónie Čísla predstavujú priemer počet kolónií z troch nezávislých experimentov ± SD relatívny počet bol vypočítaných riadiacich a BGC823-MT2A buniek, a analyzované pomocou Studentovho t-test
(P
= 0,0038). D, MT2A inhibovanú karcinogenity BGC823 buniek . u nahých myší Priemerný objem nádoru na BGC823-MT2A na 3 týždne po injekcii bol 112 mm 3 (95% CI: 93 až 147 mm3), v porovnaní s 352 mm 3 (95% CI: 298-423 mm3) pre BGC823-Vector. dáta predstavujú priemer ± SD objemu nádoru odvodeného z každej skupiny. v každej skupine, veľkosti nádoru boli merané za použitia posuvného merítka v uvedených časových bodoch. údaje boli uvedené ako priemer ± SD (t
teste detekcie, P
= 0,0027), E, ​​FACS analýza ukázala, že MT2A nadmerná expresia vedie k G2 /M zástavy, a pomer G2 /M fáza bola vyššia ako v kontrolných prázdnych a rodičovských buniek (P <
0,01). F, protinádorového účinku MT2A bola detekovaná annexin V /farbiacim teste FITC-PI. Percento apoptotických buniek bolo v skupine MT2A 52,9% ± 5,4% v porovnaní s údajmi v rodičovských bunkách (8,3% ± 2,4% a buniek transfekciou prázdnym vektorom (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Ďalej sme á BGC823 bunky potláčajúce MT2A alebo nie do mäkkého agaru, ektopická expresia MT2A bola potvrdená metódou western blot analýzou prvého (obrázok 3A). Po 3 týždňoch kultivácie MT2A výrazu spôsobila štatisticky významné zníženie tvorby kolónií (P
= 0,0053, 3C). Okrem toho došlo k dramatickému inhibícia rastu MT2A-re-exprimujúcich buniek v porovnaní s negatívnou kontrolou (p = 0,0027
, obrázok 3D) v modeloch štepov. Tieto dáta ukazujú, že MT2A by mohol hrať úlohu v potlačení proliferácie GC buniek in vitro a in vivo
.
MT2A potláča NF-kB aktivity prostredníctvom IKB-a up-regulácia
bolo oznámené, že strata MT2A indukované aktivácia NF-kB signál transgenetic myšiam modelu (MT2A-knock out) [15]. Ale role MT2A ako priateľ alebo nepriateľ v signálnej dráhy NF-kB bol ešte sporný [18, 33]. Aby bolo možné interpretovať mechanizmus MT2A sprostredkované GC potlačenie bunkového rastu in vivo stroje a in vitro
, snažili sme sa preskúmať možnú súvislosť medzi MT2A a NF-kB signálne dráhy, a vnútorný mechanizmus bol stále nejasné v GC , MT2A a hlavné gény NF-kB signalizácie, ako je P65, IKB-a, p-IkappaB-alfa a následný efektor NF-kB signalizácia, cyklin D1 boli zistené v tejto štúdii (ďalej file1). Ektopická expresia z MT2A indukovaného ako mRNA a proteín expresie IKB-alfa vo všetkých skúmaných GC bunkových línií (BGC823, SGC7901 a AGS), IkappaB-α mRNA hladiny v rovnovážnom stave boli zvýšené 5,5-krát v BGC823 buniek re-vyjadrovať MT2A pre 48 h. V AGS a SGC7901 buniek, sme pozorovali 7,2 krát a 4,3-násobné indukciu IKB-a mRNA (obr 4A), relatívna hladiny proteínov sú v súlade s mRNA transkriptov, a proteín p-IKB-α bola znížená v týchto GC bunky transfekované MT2A vektora (obrázok 4B). Ako je znázornené na obrázkoch 4 ° C a D, porazený endogénneho MT2A v GES1 bunkách vedie k down-regulácii IKB-a expresiu rovnako ako up-regulácia p-IKB-a a cyklin D1 expresie, čo naznačuje spojenie medzi MT2A aktivitou a IKB -α výraz. Tieto experimenty ukazujú, že MT2A vyvoláva IkappaB-alfa expresiu v mRNA a nízka hladina bielkovín. A MT2A sprostredkovaná up-regulácia expresie IKB-a bola ďalej potvrdená pomocou imunofluorescencie (obrázok 5A, ďalej file1). Tabuľka S2. Tabuľka S3. Tabuľka S4. Tabuľka S5. Tabuľka S6. Obrázok S1. Obrázok S2. Obrázok S3. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Prejavy COX-2 a VEGF-C u karcinómu žalúdka: korelácia s Lymfangiogeneze a prognostické dôsledky
• Downregulaci SPARC výrazu znižuje rakoviny žalúdka bunkovú inváziu a prežitie