Metallotioneiinin 2A estää NF-KB-reitin aktivaatio ja ennustaa kliinistä tulosta erillisiä kanssa TNM mahasyövän potilaista radikaali resektio

Metallotioneiinin 2A estää NF-KB-reitin aktivaatio ja ennustaa kliinistä tulosta erillisiä kanssa TNM mahasyövän potilaista radikaali resektio
tiivistelmä
tausta
metallotioneiinin 2A (MT2A) kuten stressi proteiini, näyttelee suojaava rooli mahan limakalvoestettä. Sen rooli kehityksen mahasyövän (GC) on epäselvä. Mekanismi MT2A tutkitaan mahalaukun kasvaimien syntyyn. Tool Menetelmät
MT2A ekspressiota havaittiin 973 mahalaukun yksilöitä. Biologinen toiminta määritettiin läpi kohdunulkoinen ilmentävien MT2A in vitro
ja in vivo
. Mahdollisia alavirran efektoreita MT2A tutkittiin NF-KB signalointi. Proteiinin tasot MT2A, lKB-α ja p-IKB-α (ser32 /36) ilmentyminen analysoitiin osajoukko 258 potilaasta, IHC värjäys. Prognostisia vaikutukset MT2A, tilan IKB-α ja TNM arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin käyttäen log-rank-testi.
Tulokset
Vähentynyt MT2A ilmentymistä havaittiin solulinjoissa ja ensisijainen kasvain GC. Kliinisissä tietojen menetys MT2A (MT2A + Normaali (n = 171, 76,0%); Intestinaalinen metaplasiaa (n = 118, 50,8%), GC (n = 684. 22,4%, P
< 0,001)) liittyi huonoon ennusteeseen (P
< 0,001), kehittynyt TNM (P
= 0,05), ja alas-säätely IKB-α lauseke (P
< 0,001). Lisäksi MT2A oli itsenäinen ennustetekijöiden allekirjoituksen erillään asemasta IKB-α ja patologisia piirteitä. Lisäksi MT2A esti solun kasvua apoptoosin ja G2 /M pidätys, joka säätelee negatiivisesti NF-KB-reitin kautta säätely ylöspäin IKB-α ja alas-säätely p-IKB-α ja sykliini D1 ilmentyminen.
Johtopäätökset
MT2A voisi olla kasvain tukahduttava aktiivisuus estämällä NF-KB: n signalointi ja se voi olla ennustetyövälineenä biomarkkereiden ja potentiaalinen kohde Yksittäisenä terapia GC potilaista.
avainsanat
metallotioneiini 2A NF-KB signalointi Mahasyöpää ennuste TNM Taustaa
uutta
runsaus metallotioneiini 2A (MT2A) näyttelyt mahalaukun limakalvon este, mutta sen rooli etenemistä mahasyövän (GC) on vielä epäselvä. Tämän analyysin 171 normaali mahan kudoksissa, 118 suoliston metaplasia, ja 684 ensisijainen syöpien, vähentynyt MT2A korreloi merkitsevästi huonoon ennusteeseen. Se esti leviämisen GC-solujen avulla NF-KB signalointi inaktivaatiota. Nämä tulokset osoittavat, että MT2A voi olla tärkeä prognostisia merkki ja terapeuttinen kohde GC.
Mahasyöpää (GC) on yleisimmin diagnosoitu maligniteetin ja edelleen merkittävä taakka syövän Aasiassa, erityisesti Kiinassa [1, 2]. Useimmat GC leikkauspotilaiden ovat jo edenneet pitkälle, ja 5 vuoden pysyvyys on vaihteleva. Useat histologiset tekijät on raportoitu olevan ennustavia tekijöitä GC, mukaan lukien kasvaimen koon, WHO: n luokituksen, kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) vaiheessa järjestelmä, ja erilaistumisen luokka [3, 4]. Kuitenkin ennusteen GC potilaita samassa vaiheessa on vielä epäjohdonmukainen [5]. Siksi kartoittaa erityisiä diagnostisia markkereita ja terapeuttinen kohde mahdollistaisi luotettavan ennusteen, tehokas laajentaminen postoperatiivisten selviytymisen ja elämän laadun potilaiden [6].
Cellular stressi on osoitettu rooli molekyyli asetuksessa syövän [7, 8]. Metallotioneiinit (MTS), kun stressi proteiinit pienimolekyylisil- ja rikas-kysteiini on kyky korkea affiniteetti metalli-ionien ja ROS scavengers. MT2A tärkein isoformin MT: iden tärkeä rooli mahan limakalvon potilailla, joilla on gastriitti ja jyrsijöiden [9, 10]. Pre-eksogeenisen MT2A tai ennen induktiota endogeenisen MT2A voi suojata mahan ja maksan vastaan ​​stressin aiheuttama vahinko ja estää muodostumista stressin aiheuttama lipidiperoksidia, mikä merkitsee suojaavaa vaikutusta MT2A on stressin aiheuttama synnyssä ja mahdollinen terapeuttinen kohde hakenut ennalta ehkäisevinä [11] - [13]. Äskettäin MT2A tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja etenemisessä useita karsinoomien, mukaan lukien GC [14]. Hiiret menetys MT2A geenin alttiita diethylnitrosamine aiheuttama hepatokarsinogeneesin aktivoimalla NF-KB: n kohdegeenien, mikä osoittaa, että MT2A suojaa hiiriä hepatocarcinogen aiheuttaman maksavaurion ja karsinogeneesin, korostaen sen mahdollista terapeuttista soveltamista vastaan ​​maksasolusyövän [15]. Jotkut tutkimukset keskittyivät roolista MT2A että suojan H.pylori
indusoima mahan vahinkoa käyttämällä MT-null hiiret. Himeno, S. huomasi, että NF-KB: n ja ilmentymisen NF-KB: n välittämää kemokiinien mahalaukun soluissa olivat merkittävästi korkeammat MT2A-null hiiret kuin laajalle tyypin hiirillä [9]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että MT2A ymmärtää negatiivinen kontrolli transkriptiotekijän NF-KB: n aktiivisuutta, mutta sen merkitys mahasyövän on vielä epäselvä [16] - [18].
Poikkeava NF-KB liittyy solujen tulehdus, maligniteetti , ja syövän etenemiseen [7, 19]. Toiminnallinen aktiivisuus NF-KB estyy sitoutumalla sen estäjä, IKB-α. NF-KB on seurausta proteasomin-välitteinen hajoaminen lKB-α fosforylaatio inhibiittori (p-IKB-α), mikä viittaa siihen, että NF-KB-reitin on potentiaalinen kohde yksittäisen hoidon [20] - [23] .
Jotkut näytön mukaan lisääntynyt MT2A lauseke on tärkeä syövän etenemisen, ja MT2A aluksi ehdotetaan esikasvaintekijän rinta-, ruokatorven, eturauhas-, ja munasarjojen syöpien, jotka liittyvät maligniteetti ja huonon ennusteen [24] - [27 ]. Sen sijaan se on säädellä vähentävästi ruoansulatuskanavan kasvaimet ja hepatosellulaarikarsinoomien, jossa MT2A joko korreloi käänteisesti tai liity kuolleisuutta [28, 29]. Kuitenkin vaihtelu MT2A ja sen kliininen arviointi edelleen ristiriitainen GC [28, 30, 31]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että häiriöstä MT2A on mukana kasvaimen synnyssä, vaikka tarkkaa rooli on edelleen epäselvä GC.
Siksi olemme keskittyneet paljastaa koekspressio MT2A ja IKB-α-geenin korreloi kliinisten patologisia piirteitä ja tulosten suuressa mittakaavassa mahalaukun kasvainten pitkäaikaisen seurantatiedot. Lisäksi olemme analysoidaan järjestelmällisesti rooli MT2A kuten stressiproteiinia ja negatiivinen säätelijä NF-KB: n aktivaation luonnehtimiseksi biologinen tehtävä ja molekyylitason mekanismin in vitro
ja in vivo
.
Menetelmät
Potilaiden ominaisuudet
mahakasvaimen näytettä 684 GC potilaista hoidettiin Peking Cancer sairaalan 1997-2007 arvioitiin. Potilaat mukana 513 miestä (75,0%) ja 171 naista (25,0%), joiden keskimääräinen ikä diagnoosin 54 vuotta (vaihteluväli, 19-81 vuotta). Seuranta-aikana vaihteli 1-+127,2kuukautta (mediaani 34,2 kuukautta). Kaikki potilaat saivat radikaalin resektoimalla parantava tarkoitus. Yksikään potilaista ei ollut saanut neoadjuvant kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Mukaanottokriteereihin Kaikkien potilaiden on: (a) erottuva GC diagnoosi perustuu kuudes painos kasvaimeen solmu-etäpesäke (TNM) luokittelu International Union vastaan ​​GC, (b) radikaali resektio, (c) sopiva formaliinilla, parafiiniin upotetut kudokset. Yhteensä 684 GC oli kliinis data (kutsutaan nimellä "kohortin"). Lisäksi joukko 258 voivat kerättiin kohortti 10-vuoden seuranta-data (kutsutaan nimellä "osajoukko"). Kliininen tulos potilaiden kirjattiin alkaen leikkaus kuolinpäivä. Lisäksi 118 suoliston metaplasiaa (IM) ja 171 normaali mahan kudoksissa kerättiin näistä GC potilaista. Histologinen arviointi suoritettiin kolmella vanhempi patologia. Väestörakenteen jakautuminen kohortin ja osajoukko on lueteltu Täydentävä taulukossa 1. Lisäksi 36 pariksi mahalaukun kasvaimet viereisten normaaleissa kudoksissa jauhettiin jauheeksi nestemäisessä typessä RT-PCR ja Real-Time PCR MT isoformeja (Additional file1). Taulukko 1 Logistinen regressioanalyysi kliinis ja ennusteeseen GC
sen vaihtelun
No. tapauksista (n = 258)
Elinaika (kk)
P
-arvo
Sukupuoli
Mies
186
66,4 ± 4,6
Female
72
54,1 ± 4,8
0,604
Ikä diagnoosin
< 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM
I
34
105,5 ± 7,7
I vs. IV
< 0,001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs. IV
< 0,001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs. IV
0,010
IV
52
35,8 ± 4,1
Kasvain syvyys
pT1
13
87,2 ± 9,9
pT1 vs. pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 vs. pT4
< 0,001
pT3
157
49,1 ± 2,9
pT3 vs. pT4
0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
Imusolmuke tila
pN0
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs. PN3
0,001
PN1
115
50,5 ± 3,4
PN1 vs. PN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
pN2 vs. PN3
0,326
PN3
16
47,5 ± 12,6
etäpesäkkeiden
pM0
232
67,5 ± 4,3
PK1
26
27,6 ± 5,8
< 0,001
eriytyminen
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A ilmaisu
< 0,001
alhainen
202
53,9 ± 3,4
korkea
56
86,9 ± 9,2
IKB-α ilmaisu
alhainen
164
61,6 ± 4,9
korkea
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-IKB-α ilmaisu
alhainen
126
74,1 ± 5,3
korkea
132
47.7 ± 3.4
0,005
M0: ei kaukainen etäpesäke; M1: kaukainen etäpesäke;
D1: hyvin /kohtuullisesti erilaistunut GC; D0: huonosti erilaistunut GC.
Immunohistokemiallinen analyysi
IHC värjäytyminen kudoksessa array suoritettiin MT2A vasta-aineella (1: 100 laimennos, 18-0133, Invitrogen, CA, USA), p-IKB-α-vasta-ainetta (1 : 200 laimennus; ab47752, Abcam, Cambridge, UK), IKB-α-ainetta (1: 300 laimennus, sc-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). Kunkin biomarkkereiden, kuvia pisteytettiin visuaalisesti kolme patologit jotka sokaisi kliiniseen lopputulokseen. Eroavuudet ratkaistiin yksimielisesti. Tulokset jaettiin prosentteina positiivista värjäytymistä kussakin sylinterissä. Keskimääräinen prosenttiosuus arvo kaksi ydintä laskettiin edustamaan yhtä kasvain (Additional file1).
Solulinjat
Mahasyöpää solulinjoissa BGC823, MGC803, SGC7901 ja PAMC82 perustettiin Kiinassa ja ostetaan kudospankille Shanghai (Shanghai, Kiina). Erityisesti BGC823 solut osoittivat korkean tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 ja SNU-16 solulinjat hankittiin ATCC: ltä (American Type Culture Collection, Manassas, USA). GES-1, immortalisoitu ihmisen mahalaukun epiteeli- solulinjan, syntyi SV40-viruksen transfektiota Beijing Cancer sairaalan ja viljellään DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 37 ° C: ssa kosteutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO 2 [32].
MTT ja pehmeä agar määritys
solut ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille, ja MTT lisättiin soluihin 1-5 päivää. MTT (5 ug /ml) poistettiin 4 tunnin inkuboinnin ja sitten dimetyylisulfoksidiin (DMSO) lisättiin liuottamaan formatsaani. Absorbanssi 490 nm: ssä /570 nm: ssä määritettiin mikrolevylukijassa (Bio-rad680 ELISA). Sitten soluja inkuboitiin 4 viikkoa, värjättiin tärkeää tetratsoliumvärin INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) dokumentoida läsnäolo tai puuttuminen elinkykyisten solujen pesäkkeiden. Pehmeä agar kiinnitettiin 100 ul: lla metanoli-etikkahappo (3: 1 tilavuus /tilavuus), ja pesäkkeet laskettiin.
Tuumorigeenisyyden määrityksessä
BGC823-soluja (5 x 10 5-solut suspendoitiin 0,1 ml: aan PBS: ää) transfektoitu MT2A yli-ilmaistu vektori tai tyhjän vektorin injektoitiin ihonalaisesti selän kylkeen viiden 4-viikkoisen naaras-Balb /c-nude-hiirissä (MT2A-kloonien oikean ja vektorisäätö kloonit vasemmalla. Tuumorin läpimitta mitattiin ja dokumentoitu välein 5 päivää. kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla ab 2/2 (a > b). lopussa 25 päivää, kaikki hiiret tapettiin ja kasvaimen tilavuus mitattiin. Kolme erillistä koetta, olivat suoritettu ja antoi samanlaisia ​​tuloksia. eläimiä pidettiin tilat hyväksymä yhdistys arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care mukaisesti nykyisten määräysten ja kansainvälisten standardien mukaisesti.
tilastollinen
χ
2 testisuureen ja Studentin t
-testiä käytettiin vertaamaan esikäsittelyyn ominaisuuksia Potilastapausten. Syöpä liittyvä eloonjääminen analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin käyttäen log-rank testejä. Spearman rank testi ja Fisherin testiä sovellettiin osoittamiseksi kliinis korrelaatioita. Coxin suhteellisen vaaran regressiomallia käytettiin siihen liittyvine 95%: n luottamusväli (CI) ja P
arvoja. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja P
arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen tilastollista pakettia SPSS (versio 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL).
Tutkimus hyväksyntä
Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eettisen komitean Pekingin yliopiston Cancer sairaala. Käyttää ihmisen kudosten ja kliinisten tietojen oli ohjeiden mukaan sairaalan ja hyväksytty paikallisen eettisen komitean.
Tulokset
Vähentynyt MT2A ilme on molekyyli tapahtuma solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia GC
Expression ja MT2A arvioitiin RT-PCR: llä ja Western blot paneelissa GC solulinjojen ja GES1, joka toimi "normaali kontrolli". Kuten kuviossa 1A on esitetty, MT2A mRNA vaihteli olennaisesti korkeimmilla tasoilla GES1. Puuttuminen tai väheneminen MT2A ilmentymistä havaittiin BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 ja N87-soluja. Proteiini taso MT2A ilmentymisen edelleen havaittiin kuusi yhteistä käytetty GC solulinjojen (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, ja MKN45) verrattuna GES1. Western blot-analyysi osoitti, että kuusi yleisesti käytetty GC solulinjojen tasot MT2A ilmentymisen olivat poissa tai alhainen verrattuna GES1, sopusoinnussa mRNA: n ekspressio havaittiin edellä (kuvio 1 B). Erityisesti BGC823, MGC803 ja SGC7901 solujen puute MT2A ilmaisun osoittavat suurta tumorigenecity nude-hiirissä. Kuvio 1 lainkaan tai vähentynyt ilmentyminen MT2A havaitaan solulinjoja ja primaarisia kasvaimia GC. A, MT2A mRNA taso mitattiin RT-PCR GC solulinjoissa ja normaalin kuolematon solulinja-GES1. Ja semi-kvantifiointiin analyysit suoritettiin Imagetool 3,0 harmaansävyisiä skannausohjelmisto (normalisoitu p-aktiini tasot). Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. B, MT2A proteiinin taso määritettiin Western blot-analyysi GC solulinjoissa ja normaali kuolematon solulinja-GES1. MT2A Proteiinivyöhykkeet skannattu (normalisoitu p-aktiini tasot). C, Differentiaalinen ilmentyminen MT2A mRNA transkriptin 36 pariksi GC kudosten ja viereisten normaaleissa kudoksissa. MT2A mRNA-vyöhykkeitä skannattiin (normalisoitu p-aktiini tasot). D, MT2A proteiinin tasot havaittiin 36 pariksi GC kudosten Western-blottauksella. MT2A Proteiinivyöhykkeet skannattu (normalisoitu p-aktiini tasot). E, Laskua MT2A aikana havaittiin mahalaukun pahanlaatuisiksi. (A) voimakas värjäys MT2A normaaleissa kudoksissa, (b) kohtalainen värjäytyminen MT2A IM kudoksissa, (c) heikko värjäys MT2A kohtalaisen eriytetty ensisijainen syöpien ja (d) negatiivinen ilmaus MT2A huonosti eriytetty GC (alkuperäinen suurennos × 400). (D) verrattuna normaalin ja syövän esiasteita-IM näytteitä, vähentää MT2A oli yhteinen molekyyli tapahtuma mahasyövän (P
< 0,001) F: Differential ilmaus MT2A GC, IM ja normaaleissa kudoksissa IHC värjäystä. Negatiivinen: pisteet 0; Heikko: pisteet 1-4; Vahva: pisteet 5-12. Katso lisätietoja Additional file1.
36 ensisijainen kasvaimia GC viereisten normaaleissa kudoksissa tutkittiin myös kuviossa 1C ja D, tulosten varmistamiseksi johdettu GC solulinjoista, vähentynyt MT2A mRNA näytetään GC verrattuna vuonna Hyväksytty terveillä (27/36, 75,0%, P
< 0,001, kuvio 1C). Alhainen ilmentyminen MT2A proteiinia ei havaittu 29 ulos 36 GC tapauksista (80,6%) verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin (P
< 0,001, kuvio 1 D). MRNA taso MT2A oli korreloi proteiinin taso havaitaan Western blot (R = 0,510, P
= 0,009). Ihmisillä MT koodaavat geenien perhe, joka koostuu 10 toiminnalliset MT isoformit ja koodatut proteiinit ovat perinteisesti jaettu neljään ryhmään, MT1, MT2, MT3, ja MT4-proteiineja. Koska koodaavat alueet MT isoformien ovat erittäin konservoituneita transkriptio ja proteiinin tasot, MT2A on erittäin homologisia MT1G, MT1E ja MT1F (Additional tiedosto 1: Kuva S1B). Näin ollen kokeet yksittäisen isoformia on huolellisesti suoritettava sen varmistamiseksi, että tarkka isoformi analysoidaan. Tässä tutkimuksessa tasauspyörästö ilmentyminen MT1 transkriptien havaittiin GC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia GC viereisten terveillä (n = 36) (Additional tiedosto 1: Kuviot S1A ja S2). Me todennettu todellinen MT2A geeni alassäätöä GC merkittävästi verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa (27/36, 75%, kuvio 1C). Ei ollut eroa MT1E ja MT1F ja MT1G mRNA-transkriptien normaalissa ja kasvaimen näytteitä sekä MT1B mRNA transkriptio ei ollut havaittavissa kaikissa soluissa ja kudoksissa (Additional tiedosto 1: Kuviot S1A ja S2).
Tutkimiseksi ehdokkuutta MT2A mahalaukun kasvainten synnyssä, me aluksi ominaista tilan MT2A ilmentymisen 171 normaaleissa kudoksissa, 118 IM ja 684 GC näytteiden IHC värjäystä. Vasta-aineen MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) ei ole spesifinen MT-2A ainoastaan, ja reagoi ristiin MT-1 jonkin verran, vaikka se kloonattiin täyspitkä MT2A. Koska ei ole spesifistä vasta-ainetta havaitsemaan MT2A, joten käytämme yhteistä kauppapolitiikkaa vasta-IHC värjäystä, joka julkaistiin useimmissa vastaavien tutkimusten MT2A ilme on luokiteltu matala ja korkea ekspressio normaaleissa ulkonäkö kudoksissa, IM, ja ensisijainen GC. Korkea MT2A ekspressiota havaittiin 153 684 (22,4%) GC tapauksissa ja 60 118 (50,8%) IM tapauksissa sekä 130 171 (76,0%) normaali tapauksessa vastaavasti (Additional file1: Taulukko S3 P
< 0,001), se koostui kanssa MT2A mRNA-transkriptien ja proteiinin ilmentymistä Western blotilla. Ilmentyminen MT2A luokiteltiin negatiivisiksi, heikkojen ja vahvojen tapauksissa 13 (7,6%), 28 (16,4%) ja 130 (76,0%) ulos 171 normaaleissa kudoksissa, vastaavasti; IM kudoksissa, 27 (22,9%), 31 (26,3%) ja 60 (50,8%) ulos 118 IM tapauksista havaittiin vastaavasti; GC näytteitä, 494 (72,2%), 37 (5,4%) ja 153 (22,4%) ulos 684 GC tapauksista havaittiin (kuvio 1 F, Additional file1). Oli vähitellen vähentynyt ilmentyminen MT2A proteiinin IM ja GC (P
< 0,001, kuvio 1E ja F). On selvää, että MT2A mRNA ilmentyy suuresti GES1 soluissa ja normaaleissa kudoksissa, mutta se on supistunut tai kadonnut useimmissa GC soluja ja kudoksia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vähentynyt MT2A on molekyyli tapahtuma kasvaimien syntyyn ja etenemiseen.
MT2A ilmentyminen korreloi huonon ennusteen GC
MT2A oli usein säädellä vähentävästi GC. Tutkitaan onko MT2A ilme oli ennustetekijä ihmisen GC, MT2A proteiinin ilmentyminen tutkittiin osajoukon IHC värjäystä. Yksittäiset näytteet luokiteltiin alhainen (MT2A-) tai korkea lauseke (MT2A +). MT2A- oli yhteydessä huonoon kokonaiselinaikaa (kuvio 2A, P
< 0,001). Univariate analyysi osoitti, että jotkut tekijät, kuten vähentynyt MT2A lauseke (P
< 0,001), TNM (P
< 0,01), kasvain syvyys (P
< 0,05), imusolmukkeesta tila (P
< 0,05), kaukainen etäpesäke (P
< 0,001) ja eriytyminen (P
= 0,011) korreloivat huono selviytyminen (taulukko 1). Cox monimuuttuja-analyysi osoitti, että eloonjäämisaste liittyi MT2A ilme (MT2A + versus MT2A- riskisuhde [HR], 0,429; 95% CI, ,187-,683; P
= 0,002, taulukko 2). Arvioimme mahdollinen kliininen merkitys MT2A vertaamalla sen ilme kuvio kliinisten parametrien (Additional file1: Taulukko S4). MT2A näytteillä laaja positiivinen korrelaatio kasvaimen erilaistumiseen (P
< 0,001) ja käänteinen korrelaatio TNM (P
= 0,05). Nämä tulokset osoittavat, että MT2A korreloi kliinisten patologisia piirteitä ja selviytymisen GC potilailla. Kuvio 2 analyysi yhdistettynä MT2A kanssa TNM ennustaa kliinistä tulosta GC. Kaplan-Meier-analyysi yleistä-selviytymisen MT2A ilmentymistä käytettiin mukaisesti TNM-luokitus. A Prognostiset arvo MT2A ilmaisun GC potilailla oli hyötyä lopputuloksen ennustaminen potilaista, alhainen ilmentyminen MT2A liittyi huono kokonaiselinaikaa (P <
0,01); B, TNM oli hyötyä ennustetekijöiden ennusteen GC potilailla. C D, Prognostic arvo MT2A TNM vaiheen I-II ja III-IV (P
= 0,048, P <
0,001, tässä järjestyksessä); E F Prognostic arvo MT2A ilmaisun imusolmuke etäpesäke tai ei (P
< 0,001, P
= 0,052, tässä järjestyksessä); G. Prognostiset arvo MT2A ilmaisun ei etäpesäkkeiden alaryhmä (n = 232, P
< 0,001); H. Prognostiset arvo MT2A in pT3-pT4 alaryhmä (P
< 0,001). Kaikki tiedot tarkoita, että MT2A voisi olla tehokas ennustetekijöiden allekirjoitus.
Taulukko 2 Coxin regressioanalyysi kliinis-ja molekyylitason allekirjoitukset GC
Monimuuttuja-analyysi
kovariaattina mennessä päätepiste

Riskisuhde
95% CI
P-
arvo
Ikä ≥ 60 vuotta
1,300
0,840-1,934
0,254
Sex
0,823
0,499-1,233
0,292
erilaistuminen
0,753
0,509-1,778
0,875
Kasvain invasiivisia syvyys
1,914
1,389 kohteeseen 2,638
< 0,001
Imusolmuke tila
1,291
1,034-1,612
0,024
etäpesäkkeiden
2,595
1,332-5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187-0,683
0,002
IKB-α
0,779
0,524-1,311
0,423
p-IKB-α
1,857
1,256-2,912
0,003
Prognostic merkitys MT2A yhdistettynä TNM vaiheessa GC potilailla
edelleen selvittämiseksi MT2A ilmaisun prognostisissa merkitys, yhdistimme MT2A ilmaisun kanssa kliinis-GC. Tavoitteena oli arvioida ennustetta GC potilaalla on patologinen luokittelu, ja tutkia patologinen luokittelu olisi edelleen osa-luokiteltu tarkemman ennusteen tuloksiin. Kuten esitetään Additional file1: Taulukko S4, MT2A ilmentyminen GC liittyi TNM ja kasvaimen erilaistumiseen, mikä tarkoittaa, että MT2A voi olla mahdollinen molekyyli biomerkkiaine ennustaa patologinen luokittelu GC. Kuten Dikotominen covariates, sekä MT2A ja TNM ovat riippumattomia ennustajia hengissä (taulukko 2, kuva 2A ja B). Prognostic merkitys MT2A-ilmentyminen analysoitiin lisäksi GC potilaiden mukaan pTNM luokittelujärjestelmän. Oli merkittävä ero kokonaiselossaoloaikaa sairastavien potilaiden välillä MT2A ilme sekä varhaisen (I ja II) ja kehittyneiden (III ja IV) vaiheen ryhmät (P
= 0,048 ja P
< 0,001, tässä järjestyksessä; kuvio 2C ja D). Lisäksi MT2A ilmentymisen tila oli myös tehokas ennusteen samat vaiheet (P
= 0,052, kuvio 2E; P
< 0,001, kuvio 2F; P
< 0,001, kuvio 2G ja P
< 0,001, kuva 2 H). Nämä tiedot vastaavat, että MT2A on molekyyli allekirjoitus ennustaa kliiniseen tulokseen perustuen TNM.
Palauttaminen MT2A ilmaisun johtaa kasvun tukahduttaminen GC-solujen in vitro
ja in vivo
paljastaa mekanismin of MT2A GC, olemme vakaasti transfektoitu MT2A yliekspressoitujen plasmidia ja tyhjän vektorin kolmeen GC solulinjoihin (BGC823, SGC7901 ja AGS). Olemme tutkineet kasvua, apoptoosin hinnat ja solusyklin näistä solulinjoista, jotka on transfektoitu MT2A plasmidi. Solujen elinkelpoisuus vähennetty GC soluissa uudelleen ilmentävät MT2A käyttäen MTT-määritystä (BGC823, P
= 0,0038, kuvio 3B, AGS, P
= 0,0007, Additional file1: Kuva S3A; SGC7901, P
= 0,0004 , Additional tiedosto1: Kuva S3C). Jotta voitaisiin edelleen tutkia funktio MT2A GC solulinjoissa, olemme analysoineet vaikutuksia MT2A ilmentymisen solujen lisääntymisen ja solusyklin sääntelyn anneksiini-V /PI-värjäyksen ja virtaussytometria-analyysi. Muita apoptoosi havaittiin näiden GC-solujen uudelleen ilmentävät MT2A (P
< 0,01, vastaavasti, kuviossa 3F; Muihin file1: Kuvio S3A ja C). Lisäksi G2 /M pidätys havaittiin GC soluissa käyttäen ektooppinen ilmentyminen MT2A. Suhteet G2 /M vaihe MT2A ryhmät olivat kaksi kertaa korkeammat kuin vektorin ryhmissä teki (P
< 0,01, vastaavasti, kuvio 3E ja Additional file1: Kuva S3B ja D). Kuvio 3 ektooppinen ekspressoituminen MT2A estää GC-solujen kasvua in vitro ja in vivo. MT2A estivät solujen proliferaatiota ja pesäkkeiden muodostuminen ihmisen GC soluissa. A, Western blot MT2A havaittiin BGC823 transfektoiduissa soluissa ektooppinen ilmentyminen MT2A plasmidin ja tyhjän vektorin. MT2A Proteiinivyöhykkeet skannattu (normalisoitiin p-aktiini ohjaamaan lastaus). B, Soluproliferaatio analysoitiin MTT-määritystä re-ilmentävät MT2A on BGC823 soluja vai ei. Data on esitetty keskiarvona ± .SD kolmen riippumattoman kokeen. C, kasvu BGC823 solujen analysoitiin puolikiinteä pehmeän agaralustalla. Tyhjän vektorin muodostuneiden pesäkkeiden tilastollisesti merkitsevästi enemmän pesäkkeitä (keskiarvo = 426 suuria pesäkkeitä maljaa kohti. 95% CI: 387-472 pesäkettä) kuin MT2A klooneja (keskiarvo = 136 pesäkettä. 95% CI: 100-164 pesäkkeitä. Numerot edustavat keskiarvoa pesäkkeiden lukumäärä kolmen itsenäisen kokeen ± SD suhteellinen määrä laskettiin kontrolli- ja BGC823-MT2A soluja, ja analysoitiin käyttäen Studentin t
-testi (P ​​
= 0,0038). D, MT2A-inhiboi tuumorigeenisyyden BGC823 solujen nude-hiirissä. keskimääräinen kasvaimen tilavuus BGC823-MT2A on 3 viikkoa injektion jälkeen oli 112 mm3 (95% CI: 93-147 mm3), verrattuna 352 mm3 (95% CI: 298-423 mm3) ja BGC823-vektori. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kasvaimen tilavuuden peräisin kustakin ryhmästä. kussakin ryhmässä, kasvainten koot mitattiin käyttäen paksuus on ilmoitettuina ajankohtina. Aineisto on esitetty keskiarvona ± SD (t-
testi havaita, P
= 0,0027). E, FACS-analyysi osoitti, että MT2A yli-ilmentyminen johti G2 /M pidätys, ja suhde G2 /M vaiheessa oli korkeampi kuin tyhjissä ohjaus ja vanhemman soluja (P <
0,01). F, antituumorivaikutus on MT2A havaittiin anneksiini V /FITC-PI-värjäyksellä määrityksessä. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen oli 52,9% ± 5,4% vuonna MT2A ryhmässä verrattuna emo soluissa (8,3% ± 2,4% ja solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (8,2% ± 3,7%, P
< 0,001).
Edelleen, me päällystetty BGC823 solujen tukahduttamiseen MT2A tai pehmeään agar, ektooppinen ilmentyminen MT2A varmistettiin western blot-analyysi ensimmäisen (kuvio 3A). sen jälkeen kun 3 viikkoa viljelyn MT2A ilmaisu aiheutti tilastollisesti merkittävä väheneminen pesäkemuodostusta (P
= 0,0053, kuvio 3C). Lisäksi oli dramaattinen kasvu inhibition MT2A-re-ilmentäviä soluja verrattuna negatiiviseen kontrolliin (P
= 0,0027, kuvio 3D) on ksenograftimalleissa. Nämä tiedot osoittavat, että MT2A saattaa olla merkitystä tukahduttamaan leviämisen GC-solujen in vitro
ja in vivo
.
MT2A tukahduttaa NF-KB aktiivisuuden kautta IKB-α ylössäätöä
kerrottiin, että menetys MT2A aiheuttamaa NF-KB: n signaali aktivaation transgenetic hiirimallissa (MT2A-knock out) [15]. Mutta rooli MT2A kuin ystävä vai vihollinen NF-KB signaalireitin oli yhä kiistanalainen [18, 33]. Jotta tulkita mekanismi MT2A välittämän GC solujen kasvua vaimentava in vivo
ja in vitro
, yritimme tutkia mahdollisuuksia suhdetta MT2A ja NF-KB-signalointireitin ja sisempi mekanismi oli edelleen epäselvä GC . MT2A ja tärkeimmät geenien NF-KB signalointi, kuten p65, IKB-α, p-IKB-α ja alavirtavaikuttajainhibiittorit NF-KB: n signalointia, sykliini D1 havaittiin tässä tutkimuksessa (Additional file1). Kohdunulkoinen ilmentyminen MT2A indusoi sekä mRNA ja proteiini ilmentymistä IKB-α kaikissa tutkimuksen kohteena GC solulinjoissa (BGC823, SGC7901 ja AGS), IKB-α-mRNA vakaan tilan kohoamiseen 5,5-kertaiseksi BGC823 soluissa uudelleen ilmentävät MT2A 48 h. In AGS ja SGC7901 soluja, havaitsimme 7,2-kertainen ja 4,3-kertainen induktio lKB-α-mRNA: n (kuvio 4A), suhteellinen proteiinin tasot olivat yhdenmukaisia ​​mRNA-transkriptien ja p-IKB-α-proteiinin väheni näiden GC transfektoiduissa soluissa MT2A vektori (kuvio 4B). Kuten kuvioissa 4C ja D, knockdown endogeenisen MT2A vuonna GES1 soluissa johti alas-säätely IKB-α ilmentymisen sekä säätely ylöspäin p-IKB-α ja sykliini D1 ilmentyminen, mikä viittaa yhteyden MT2A aktiivisuutta ja IKB -α ilme. Nämä kokeet osoittavat, että MT2A indusoi IKB-α ilmentymistä mRNA ja proteiini tasoilla. Ja MT2A välittämä säätely ylöspäin IKB-α ilmentyminen varmistettiin lisäksi immunofluoresenssilla (kuvio 5A, Additional file1). Selventää mekanismia MT2A on IKB-α ilme, suoritimme lusiferaasireportterista määrityksissä rakennemuutos IKB-α promoottorialueen, 5,6-kertaisesti säätely IKB-α promoottorin lusiferaasiaktiivisuus havaittiin MT2A ryhmässä kuin vektori ryhmässä ( Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Ilmauksia COX-2: n ja VEGF-C mahasyövän: korrelaatiot lymfangiogeneesiä sekä varoituksia implications
• Downregulation SPARC ilmaisun pienenee mahasyövässä solujen invaasiota ja selviytymisen