Металлотионеин 2A ингибирует активации пути NF-kB и предсказывает клинический исход отделены со стадией TNM в больных раком желудка следующие радикальной resection

Металлотионеин 2A ингибирует активации пути NF-kB и предсказывает клинический исход отделены со стадией TNM в больных раком желудка следующие радикальной резекции
Аннотация
фона
металлотионеинового 2A (MT2A) в качестве стрессового белка, играет защитную роль в слизистой желудка барьер. Его роль в развитии рака желудка (GC) является неясным. Механизм MT2A будет исследован в желудочном онкогенеза.
Методов
MT2A экспрессия была обнаружена в 973 желудочных образцах. Биологическая функция была определена через внематочной, выражающей MT2A в пробирке
и в естественных условиях
. Возможные вниз по течению эффекторов MT2A были исследованы в передаче сигналов NF-kB. Уровни протеина MT2A, IκB-а и п-IκB-a (ser32 /36) выражение анализировали в подгруппе 258 пациентов по IHC окрашивания. Прогнозные эффекты MT2A, статус IκB-альфа и TNM стадии были оценены с помощью метода Каплана-Мейера и сравнивали с помощью лог-рангового теста.
Результаты
сниженную экспрессию MT2A была обнаружена в клеточных линиях и первичных опухолей GC. В клинических данных, потеря MT2A (MT2A + в нормальном (п = 171, 76,0%); Кишечная метаплазия (п = 118, 50,8%); GC (п = 684. 22,4%, P &
л; 0,001)) был связан с плохим прогнозом (P &
л; 0,001), продвинутой стадии TNM (P
= 0,05), и понижающей регуляции α IκB выражения (P &
л; 0,001). Кроме того, MT2A был независимым прогностическим подписи отделены от статуса IκB-альфа и патологических признаков. Кроме того, MT2A ингибирует рост клеток путем апоптоза и G2 /M арест, который негативно регулируется NF-кВ путь через
повышающей регуляции IκB-альфа и понижающей регуляции р-IκB-альфа и экспрессии циклин D1. Выводы
MT2A может играть опухоль подавляющий активность посредством ингибирования сигналов NF-kB и может быть прогностическим биомаркером и потенциальной мишенью для индивидуальной терапии больных GC.
Ключевые слова
металлотионеинового 2A NF-kB сигнализации рак желудка Прогноз TNM стадии фона
Что нового
Обилие металлотионеинового 2A (MT2A) экспонатов в желудочном слизистый барьер, но его роль в прогрессии рака желудка (GC) до сих пор неясно. В этом анализе 171 нормальных тканей желудка, кишечной метаплазии 118 и 684 первичного рака желудка, снижение MT2A достоверно коррелирует с плохим прогнозом. Он ингибирует пролиферацию клеток через GC инактивации сигнализации NF-kB. Эти результаты указывают на то, что MT2A может быть важным прогностическим маркером и терапевтической мишенью для GC.
Рак желудка (GC) является наиболее часто диагностировано злокачественное и остается значительное бремя рака в Азии, особенно в Китае [1, 2]. Большинство пациентов GC перенесших операцию уже на продвинутой стадии и выживание 5-летний разнообразен. Несколько гистологические факторы Сообщалось, что прогностическими факторами GC, включая размер опухоли, классификации ВОЗ, опухоль-узлов метастазы (TNM) системы стадии и дифференциации класса [3, 4]. Тем не менее, прогноз больных GC на той же стадии по-прежнему противоречивы [5]. Таким образом, выявление специфических диагностических маркеров и терапевтической мишени позволит надежно прогнозировать, эффективное расширение послеоперационной выживаемости и качества жизни больных [6].
Клеточного стресса было показано, чтобы играть определенную роль в молекулярной регуляции канцерогенеза [7, 8]. Металлотионеины (МТС) в качестве стресс-белков с низкой молекулярной массой и богатой цистеина обладают способностью высоким сродством к ионам металлов и ROS мусорщиков. MT2A как основной изоформы МЦ играет важную роль в слизистой желудка барьера у пациентов с гастритом и грызунах моделей [9, 10]. Предварительное введение экзогенного MT2A или предварительной индукции эндогенного MT2A может защитить желудок и печень от стресс-индуцированного повреждения и препятствует образованию стресс-индуцированной перекиси липидов, подразумевая защитный эффект MT2A на стресс-индуцированной патогенеза и потенциальной терапевтической мишени применяется для ранней профилактики [11] - [13]. В последнее время MT2A играет важную роль в онкогенеза и прогрессии множественных карцином, включая GC [14]. Потеря мышей гена MT2A предрасположен к диэтилнитрозаминной индуцированных гепатоканцерогенезе путем активации генов-мишеней NF-kB, который демонстрирует, что MT2A защищает мышей от гепатоканцерогена-индуцированного повреждения печени и канцерогенеза, что подчеркивает его потенциальное терапевтическое применение против гепатоцеллюлярной рака [15]. Некоторые исследования сосредоточились на роли MT2A в защите от H.pylori
травмы желудка, индуцированного с помощью MT-нулевых мышей. Himeno, С. обнаружил, что активация NF-kB и экспрессию NF-kB-опосредованной хемокинов в клетках желудка были в MT2A-нулевых мышей значительно выше, чем у мышей, широко типа [9]. Эти данные указывают на то, что MT2A реализует отрицательный контроль фактора транскрипции NF-kB активностью, но его роль в желудочном канцерогенезе по-прежнему неоднозначна [16] - [18].
Аномальным активации NF-kB связана с воспалением клеток, злокачественность и опухоли прогрессии [7, 19]. Функциональная активность NF-kB подавляется посредством связывания с его ингибитором, IκB-альфа. Активация NF-kB является результатом протеасомы-опосредованной деградации IκB-a фосфорилированием ингибитора (п-IκB-a), что свидетельствует о том, что NF-kB путь является потенциальной мишенью для индивидуальной терапии [20] - [23] .
Некоторые доказательства показали, что увеличение экспрессии MT2A имеет важное значение для прогрессии рака, и MT2A первоначально предложен в качестве прото-онкогена в груди, пищевода, простаты и рака яичников, связанные с новообразованиях и плохим прогнозом [24] - [27 ]. В отличие от этого, она подавляется в желудочно-кишечных опухолей и гепатоцеллюлярной карциномой, где MT2A либо в обратной зависимости или не связаны с смертностью [28, 29]. Тем не менее, изменение MT2A и его клиническая оценка остается противоречивым GC [28, 30, 31]. Эти результаты свидетельствуют о том, что нарушение регуляции MT2A участвует в патогенезе опухоли, хотя точная роль до сих пор неясно, в GC.
Следовательно, мы сосредоточили внимание, чтобы выявить коэкспрессии MT2A и гена IκB-альфа коррелирует с клиническими патологических признаков и результатов в крупном масштабе желудочных опухолей с долгосрочными последующих данных. Кроме того, мы систематически проанализировали роль MT2A как стрессового белка и отрицательного регулятора в активации NF-kB, чтобы охарактеризовать свою биологическую роль и молекулярный механизм в пробирке
и в естественных условиях
.
Методов
Характеристики пациентов оценивали
образцы желудочного опухоли от 684 пациентов, проходивших лечение в ГЦ онкологической больницы в Пекине с 1997 по 2007 год. Пациенты, включенные 513 мужчин (75,0%) и 171 женщин (25,0%) со средним возрастом на момент постановки диагноза 54 лет (диапазон от 19 до 81 лет). Период последующего наблюдения составил от 1 до 127,2 месяцев (в среднем 34,2 месяцев). Всем пациентам была выполнена радикальная резекция с лечебной целью. Ни один из пациентов не получал неоадъювантной химиотерапии или лучевой терапии перед хирургическим вмешательством. Критерии включения всех больных: (а) свой собственный диагноз GC основан на шестом издании опухоли-узла-метастаз (TNM) классификации Международного союза против GC, (б) радикальную резекцию, (с) подходит фиксированные в формалине, парафином тканей. Общей сложности 684 ШС имели данные (клинико-называется как "когорты"). Кроме того, набор из 258 приемлемых образцов были собраны из когорты с данными последующих 10-летних (называется как "подмножество"). Клинический исход пациентов регистрировали с даты операции до даты смерти. Кроме того, 118 кишечной метаплазией (IM) и 171 нормальные ткани желудка были собраны из этих больных ГХ. Гистологическое исследование проводили три старших патологи. Демографическая разбивка когорты и подгруппы приведен в дополнительном таблице 1. Кроме того, 36 спаренных желудка опухоли с соседними нормальными тканями измельчали ​​в порошок под жидким азотом для ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени МТ изоформ (Дополнительный файл1). Таблица 1 Логистический регрессионный анализ клинико-патологическими особенностей и прогноза в GC


случайных величин No. случаев (n = 258)

Время выживания (месяц)


P
-value

Пол Мужской

186 <Ьг> 66,4 ± 4,6
Female
72
54,1 ± 4,8
0,604
Возраст на момент постановки диагноза
&л; 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
этап 85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM
I
34
105,5 ± 7,7
I по сравнению с IV
&л; 0,001
II
57
74,0 ± 5,9
II против IV
&лт; 0,001
III
115
49,1 ± 3,4
III по сравнению с IV
0,010
IV
глубина 52
35,8 ± 4,1
опухолевого
pT1
13
87,2 ± 9,9
pT1 против pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 против pT4
&л; 0,001
pT3
157
49,1 ± 2,9
pt3
pT4 выбирается из указанных 0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
лимфоузлов статус
Pn0
78
89,8 ± 6,2
pN0 против pN3
0.001
pN1
115
50,5 ± 3,4
pN1 против pN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
PN2 против pN3
0,326
pN3
16
47,5 ± 12,6
отдаленными метастазами
Pm0
232 <бр> 67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8
&лт; 0,001
Степень дифференциации
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
выражение 204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A
&л; 0,001
низкое
202
53,9 ± 3,4
высокого
56
86,9 ± 9,2
IκB-α выражение
низкое
164
61,6 ± 4,9
высокого
94
64,9 ± 5,1
0,248
п-IκB-α выражение
низкое
126
74,1 ± 5,3
высокий
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: нет отдаленных метастазов; M1: отдаленные метастазы;
D1: хорошо /умеренно дифференцированные ШС; D0: слабо дифференцированной ШС
Иммуногистохимическое анализ
IHC окрашивания в массиве ткани проводили с MT2A антителом. (Разведение 1: 100; 18-0133, Invitrogen, CA, США), п-IκB-α антитела (1 : 200 разбавление; ab47752, Abcam, Кембридж, Великобритания), IκB-α антител (1: 300 разбавление; SC-371, Santa Cruz Biotechnology, Калифорния). Для каждого биомаркера, изображения были забиты визуально тремя патологоанатомов, которые были ослеплены к клиническим исходом. Несоответствия были решены на основе консенсуса. Результаты были назначены как процент от положительного окрашивания внутри каждого цилиндра. Среднее процентное значение из двух ядер было рассчитано, чтобы представить одну опухоль (Дополнительный файл1).
Клеточные линии
желудочной клеточных линий рака BGC823, MGC803, SGC7901 и PAMC82 были созданы в Китае и приобретенные у банка тканей Шанхая (Шанхай, Китай). Особенно BGC823 клетки проявляли высокую tumorigenecity. MKN45, АГС, N87, РЧ-1, РЧ-48, СНУ-1, СНУ-5 и СНУ-16 клеточные линии были приобретены у АТСС (American Type Culture Collection, Manassas, США). ГЭС-1, иммортализованную желудка человека эпителиальных клеток линии, была порождена SV40 вирусной трансфекции в онкологическом госпитале в Пекине и культивировали в DMEM среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Life Technologies, Grand Island, Нью-Йорк, США) при 37 ° с в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2 [32].
МТТ и мягкий агар анализ
клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты и МТТ добавляли к клеткам в 1-5 дней. МТТ (5 мкг /мл) удаляли через 4 ч инкубации, а затем диметилсульфоксид (ДМСО) добавляли к солюбилизации формазанового продукта. Оптическую плотность при 490 нм /570 нм, анализировали с помощью микропланшет-ридера (Bio-rad680 ELISA). Затем клетки инкубировали в течение 4-х недель, окрашивали витальной INT тетразолия красителя (piodonitrotetrazolium, Invitrogen), чтобы документировать наличие или отсутствие жизнеспособных колоний клеток. Мягкая агар фиксировали с помощью 100 мкл смеси метанол-уксусная кислота. (3: 1 объем /объем) и колонии подсчитывали
анализ Туморогенность
BGC823 клеток (5 × 10 5 клеток, суспендированных в 0,1 мл PBS) трансфицировали MT2A сверхвыражен вектор или пустой вектор вводили подкожно в дорсальную фланг пять 4-недельных самок BALB /C голых мышей (MT2A-экспрессирующих клонов на правой и векторным управлением клонов слева. диаметр опухоли измеряли и документально каждые 5 дней вычисляли объем опухоли по формуле AB 2/2 (A > б)... в конце 25 дней все мыши были умерщвлены и измеряли объем опухоли три независимых эксперимента проведены и дали аналогичные результаты. животных содержали в учреждениях, утвержденных ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных в соответствии с действующими нормами и международными стандартами.
Статистический анализ
χ
2 статистика испытаний и Стьюдента
-test были использованы для сравнения предварительной обработки характеристик случаев пациента. Выживание рака, связанных анализировали с использованием метода Каплана-Мейера и сравнивали с помощью логарифмического рангового тестов. Тестовый ранг Спирмена и точный критерий Фишера были использованы для демонстрации корреляции клинико. Пропорциональный опасности регрессионной модели Кокса была использована с соответствующими 95% доверительный интервал (ДИ) и значениями P
. Все статистические тесты были двусторонними, и P
значения менее 0,05 считались статистически значимыми. Статистический анализ проводился с использованием статистического пакета SPSS (версия 16.0, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс).
Исследование утверждения
Все исследования на животных были одобрены Комитетом по этике пекинской онкологической больницы университета путем. Использование человеческих тканей и клинических данных был в соответствии с руководящими принципами больницы и утвержденные локальными этическими комитетом.
Результаты
сниженную экспрессию MT2A является молекулярным событием в клеточных линиях и первичных опухолей GC
Expression из MT2A оценивали с помощью оТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга в панели клеточных линий ГХ и GES1, который служил в качестве "нормального контроля". Как показано на рисунке 1А, MT2A мРНК существенно изменяться с самыми высокими уровнями в GES1. Отсутствие или снижение экспрессии MT2A наблюдалось в BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, СНУ-1, СНУ-5, СНУ-16, RF-1, RF-48 и N87 клеток. Уровень белка экспрессии MT2A дополнительно обнаружены в шести общих используемых клеточных линий GC (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87 и MKN45) по сравнению с GES1. Вестерн-блот-анализ показал, что, в шести наиболее часто используемых ГХ клеточных линий, уровни экспрессии MT2A отсутствовали или низким по сравнению с GES1, что согласуется с экспрессии мРНК обнаруженной выше (рис 1б). Особенно, BGC823, MGC803 и SGC7901 клетки с отсутствием экспрессии MT2A обладают высокой tumorigenecity у голых мышей. Рисунок 1 отсутствует или уменьшение экспрессии MT2A обнаруживается в клеточных линий и первичных опухолей GC. Уровень, MT2A мРНК измеряли с помощью RT-PCR в клеточных линиях, ГХ и нормальной бессмертной клеточной линии GES1. И анализы полу-количественного определения были выполнены с ImageTool 3.0 серой шкалы программного обеспечения сканирования (нормированная к бета-актина уровни). Эксперимент был осуществлен в трех экземплярах. В, уровень белка MT2A определяли с помощью Вестерн-блот-анализа в линиях GC клеток и нормальной бессмертной клеточной линии GES1. Белковые полосы MT2A сканировали (нормированные к бета-актина уровни). C, дифференциальное выражение MT2A транскрипта мРНК в 36 парных тканей GC и прилегающих к ним нормальных тканей. Полосы MT2A мРНК были отсканированы (нормированные к бета-актина уровни). D, уровни белка MT2A были обнаружены в 36 парных тканей GC с помощью Вестерн-блоттинга. Белковые полосы MT2A сканировали (нормированные к бета-актина уровни). E, снижение наблюдалось MT2A во время желудка злокачественной трансформации. (А) интенсивное окрашивание MT2A в нормальных тканях, (б) умеренное окрашивание MT2A в тканях обмена мгновенными сообщениями, (в) слабое окрашивание MT2A в умеренно дифференцированной первичного рака желудка и (г) отрицательное выражение MT2A в слабо дифференцированные GCS (исходное увеличение × 400). (D) По сравнению с образцами нормальных и предраковые-IM, снижение MT2A было общим молекулярным событием в желудочном канцерогенезе (P &
л; 0,001) F: Дифференциальная экспрессия MT2A в GC, обмена мгновенными сообщениями и нормальных тканей с помощью IHC окрашивания. Отрицательный: оценка 0; Слабый: оценка 1-4; Сильный: оценка 5-12. Для получения дополнительной информации см Дополнительный файла1.
36 первичных опухолей GC с соседними нормальными тканями были также исследованы на рисунке 1C и D, чтобы подтвердить результаты, полученные из ГХ клеточных линий, снижение мРНК MT2A была показана в ШС по сравнению с, что в совпадающая нормальный контроль (27/36, 75,0%, P
&л; 0,001, рис 1C). Низкая экспрессия белка MT2A был обнаружен в 29 из 36 случаев GC (80,6%) по сравнению с совпадающими нормальными тканями (Р
&л; 0,001, рис 1D). Уровень мРНК MT2A коррелировала с уровнем белка обнаруженного с помощью Вестерн-блоттинга (R = 0,510, Р
= 0,009). В организме человека МЦ кодируются семейством генов, состоящих из 10 функциональных MT изоформ и кодированные белки условно разделить на четыре группы, МТ1, МТ2, МТ3 и МТ4 белков. Так как кодирующие области МП изоформ высоко консервативны в транскриптов и белковых уровней, MT2A высоко гомологичны MT1G, MT1E и MT1F (дополнительный файл 1: Рисунок s1b). Следовательно, эксперименты по любому отдельному изоформы должны быть тщательно проведены, чтобы гарантировать, что точное изоформы анализируется. В этом исследовании, дифференциальная экспрессия MT1 транскриптов наблюдалась в клеточных линиях GC и первичных опухолей GC с соседними нормальным контролем (п = 36) (Дополнительный файл 1: Цифры S1a и S2). Мы аутентифицирован фактический ген MT2A понижающую регуляцию в GC значительно по сравнению с соседними нормальными тканями (27/36, 75%, рис 1C). Там не было никакой разницы в MT1E и MT1F и мРНК MT1G транскриптов в нормальных и опухолевых образцов, а также MT1B транскрипта мРНК не был обнаружен во всех клетках и тканях (дополнительный файл 1: Цифры S1A и S2).
Исследовать кандидатуру MT2A в желудочном онкогенеза, мы изначально характеризовал статус экспрессии MT2A в 171 нормальных тканях, 118 IM и 684 образцов GC по IHC окрашивания. Антитело для MT2A (Е9 18-0133, Invitrogen), не является специфическим для MT-2A только, и перекрестно реагирует с МТ-1, в некоторой степени, даже если она клонировали по всей длине MT2A. Поскольку не существует никакого конкретного антитела для выявления MT2A, поэтому мы используем общий коммерческое антитело для IHC окрашивания, которое было опубликовано в большинстве соответствующих исследований, экспрессия MT2A классифицируется как низкий и высокий уровень экспрессии в нормальных тканях внешний вид, IM, и первичной ШС. Высокий уровень экспрессии MT2A был обнаружен в 153 из 684 (22,4%) случаях GC, и 60 из 118 (50,8%) случаев IM, а также 130 из 171 (76,0%) обычных случаях внешний вид, соответственно (Дополнительный файл1: Таблица S3 , Р
&л; 0,001), он состоял с MT2A транскриптов мРНК и экспрессию белка с помощью Вестерн-блоттинга. Выражение MT2A было классифицировано как отрицательные, слабых и сильных случаев у 13 (7,6%), 28 (16,4%) и 130 (76,0%) из 171 нормальных тканей, соответственно; В тканях обмена мгновенными сообщениями, 27 (22,9%), 31 (26,3%) и 60 (50,8%) из 118 случаев IM были обнаружены соответственно; В образцах GC, 494 (72,2%), 37 (5,4%) и 153 (22,4%) из 684 случаев GC были обнаружены соответственно (рис 1F, Дополнительный файл1). Был постепенное снижение экспрессии белка MT2A в IM и GC (Р
&л; 0,001, рис 1E и F). Понятно, что MT2A мРНК экспрессируется на высоком уровне в GES1 клетках и нормальных тканей, но была снижена или потеряны в большинстве GC клеток и тканей. Эти результаты свидетельствуют о том, что снижение MT2A является молекулярным событием в онкогенеза и прогрессии.
MT2A экспрессия коррелирует с плохим прогнозом в GC
MT2A был часто вниз регулируется в GC. Для того, чтобы исследовать, был ли выражение MT2A прогностическим фактором в человеческом GC, экспрессия белка MT2A исследовали в подгруппе с помощью IHC окрашивания. Отдельные образцы были отнесены к категории низкого (MT2A-) или высокой экспрессии (MT2A +). MT2A- было связано с плохим общей выживаемости (рис 2А, P
< 0,001). Одномерный анализ показал, что некоторые факторы, в том числе снижение экспрессии MT2A (P &
л; 0,001), TNM стадии (P &
лт; 0,01), глубина опухоли (P &
лт; 0,05), состояние лимфатических узлов (P
&л; 0,05), отдаленных метастазов (Р
&л; 0,001) и степень дифференциации (Р = 0,011
) коррелировали с плохим выживаемости (таблица 1). Кокс многомерный анализ показал, что общая продолжительность жизни была связана с выражением MT2A (MT2A + по сравнению с MT2A- отношение рисков [ОР] 0,429; 95% ДИ, 0.187-0.683; P = 0,002
, таблица 2). Мы оценили потенциальное клиническое значение MT2A путем соотнесения его характер экспрессии с клиническими параметрами (дополнительный файла1: Таблица S4). MT2A выставлены обширную положительную корреляцию с дифференцировки опухоли (P &
л; 0,001) и обратная корреляция со стадией TNM (P
= 0,05). Эти результаты указывают на то, что MT2A коррелирует с клиническими патологических признаков и выживаемости пациентов GC. Рисунок 2 Анализ комбинированной MT2A со стадией TNM предсказать клинический исход в GC. Каплана-Мейера анализ общей выживаемости-для экспрессии MT2A использовалась в соответствии со стадией TNM. A, прогностическое значение экспрессии MT2A у больных ГХ польза для прогнозирования исхода у пациентов низкая экспрессия MT2A была связана с плохим общей выживаемости (P &л;
0,01); B, TNM стадия была польза для прогностической прогноза у больных ГЦ. C D, прогностическое значение MT2A в TNM стадии I-II стадии и III-IV (P = 0,048
, P &л;
0,001, соответственно); E F, прогностическое значение экспрессии MT2A в метастазов в лимфатических узлах или нет (P &
л; 0,001, P = 0,052
, соответственно); Г. прогностическое значение выражения MT2A не в отдаленными метастазами подгруппы (п = 232, P
&л; 0,001); H. прогностическое значение MT2A в PT3-pT4 подгруппы (P &
л; 0,001). Все данные указывают на то, что MT2A может быть эффективным прогностическим подписи.
Таблица 2 Cox регрессионный анализ клинико-патологическими особенностями и молекулярных подписей в GC

Многофакторный анализ

ковариата конечной точкой

коэффициент опасности

95% ДИ

P-
значение

Возраст ≥ 60 лет
1,300
0,840 до 1,934
0,254 <бр> секс
0,823
0,499 до 1,233
0,292
Дифференциация
0,753
0,509 до 1,778
0,875
опухоль инвазивной глубина
1,914
1,389 до 2,638
&л; 0,001
лимфа состояние узла
1,291
1,034 до 1,612
0,024
Отдаленные метастазы
2,595
1,332 до 5,056
0,005
MT2A
0,429 <бр> 0,187 до 0,683
0,002
IκB-α
0,779
0,524 до 1,311
0,423
р-IκB-a
1,857
1,256 до 2.912
0,003
прогностическое значение MT2A в сочетании со стадией TNM у больных ГХ
Для дальнейшего выяснения экспрессии MT2A в прогностической значимости, мы совместили выражение MT2A с клинико-патологическими особенностями в GC. Цель состояла в том, чтобы оценить прогноз GC больных с патологической классификации, и исследовать, следует ли патологическая классификация быть далее подразделены для более точного прогнозирования результата. Как показано в дополнительном файла1: Таблица S4, экспрессия MT2A в GC была связана со стадией TNM и дифференцировки опухоли, подразумевая, что MT2A может быть потенциальным молекулярным биомаркером для предсказания патологическую классификацию в GC. Как дихотомические ковариаты, как MT2A и стадии TNM были независимыми прогностическими факторами для выживаемости (таблица 2, рис 2А и В). Прогностическое значение экспрессии MT2A дополнительно анализировали у больных ГХ в соответствии с системой классификации pTNM. Был существенная разница в общей выживаемости между пациентами с выражением MT2A как в ранних (I и II) и расширенный (III и IV) групп этап (P = 0,048
и P
&л; 0,001, соответственно; рис 2C и D). Кроме того, статус экспрессии MT2A был также эффективен для прогнозирования в одних и тех же стадиях (P = 0,052
, Рисунок 2E; P
&л; 0,001, рис 2F; P
&л; 0,001, рис 2G и P
&л; 0,001, рис 2H). Эти данные представляют, что MT2A представляет собой молекулярную подпись предсказать клинический исход на основе стадии TNM.
Восстановление результатов экспрессии MT2A в подавлении роста GC клеток в пробирке
и в естественных условиях

раскрыть механизм из MT2A в GC, мы стабильно трансфицировали MT2A сверхвыражен плазмиды и пустой вектор на три GC клеточных линий (BGC823, SGC7901 и AGS). Мы исследовали рост, темпы апоптоза и клеточного цикла этих клеточных линий, трансфицированных MT2A плазмиды. Жизнеспособность клеток была уменьшена в GC клетки вновь выражая MT2A с помощью МТТ (BGC823, P
= 0,0038, рис 3B, AGS, P
= 0,0007, Дополнительный file1: Рисунок S3A; SGC7901, P = 0,0004
, Дополнительный file1: Рисунок S3C). Для дальнейшего исследования функции MT2A в ГХ клеточных линий, мы проанализировали влияние экспрессии MT2A на пролиферацию клеток и регуляции клеточного цикла от аннексина-V /PI окрашивания и проточной цитометрии анализа. Более Апоптоз был обнаружен в этих GC клетки повторно экспрессирующих MT2A (Р
≪ 0,01, соответственно, рис 3F; Дополнительный файл1: Рисунок S3A и С). Кроме того, G2 /M арест наблюдался в клетках с помощью GC эктопической экспрессии MT2A. Коэффициенты G2 /M фазы в MT2A группах были в два раза выше, чем в группах вектор сделал (P &
л; 0,01, соответственно, рис и 3E Дополнительные file1: Рисунок S3B и D). Рисунок 3 Эктопическая экспрессия MT2A ингибирует рост клеток GC в пробирке и в естественных условиях. MT2A ингибирует пролиферацию клеток и образование колоний в клетках человека GC. А, Вестерн-блот MT2A был обнаружен в BGC823 клетках, трансфицированных эктопической экспрессии плазмиды MT2A и пустым вектором. Белковые полосы MT2A сканировали (нормированная к бета-актина для контроля нагрузки). Б, пролиферации клеток анализировали с помощью МТТ-анализе в ре-экспрессирующих MT2A из BGC823 клеток или нет. Данные показаны как среднее ± .SD из трех независимых экспериментов. С, рост BGC823 клеток анализировали в полутвердой мягкой агаровой среде. Пустые векторные колонии формируются статистически значимо больше колоний (среднее = 426 больших колоний на пластину 95% ДИ: 387-472.) Колоний, чем MT2A клонов (среднее значение = 136 колоний 95% ДИ:.. 100-164 колонии Цифры представляют собой средние значения количество колоний трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение относительное число было рассчитано в контрольных и BGC823-MT2A клетки, и анализировали с использованием Т Стьюдента
-test (P
= 0,0038). Д, MT2A подавленного туморогенности BGC823 клеток . в голых мышей средний объем опухоли для BGC823-MT2A через 3 недели после инъекции был 112 мм3 (95% ДИ: 93-147 мм 3), по сравнению с 352 мм3 (95% ДИ: 298-423 мм3) для BGC823-Vector. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение объема опухоли, полученной из каждой группы. В каждой группе, размеры опухолей были измерены с помощью штангенциркуля в указанные моменты времени. Данные были показаны как обнаружение среднее ± стандартное отклонение (T-
тест, p
= 0,0027) Е, анализ FACS показывает, что MT2A избыточная экспрессия привела к G2 /M ареста, а отношение G2 /M фазе была выше, чем в пустых контрольных и родительских клеток (P &ЛТ;
0,01). F, Противоопухолевое действие MT2A был обнаружен аннексина V /окрашивания анализа FITC-PI. Процент апоптотических клеток была в группе MT2A 52,9% ± 5,4% по сравнению с таковым в родительских клеток (8,3% ± 2,4%, и клетки, трансфицированные пустым вектором (8,2% ± 3,7%, P &
л;.) 0,001
Кроме того, мы гальваническим BGC823 клетки подавляя MT2A или не в мягком агаре, эктопическая экспрессия MT2A была подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа первого (рис 3, а). Через 3 недели культуры экспрессии MT2A вызывали статистически значимое снижение образования колоний (P
= 0,0053, 3С). Кроме того, наблюдалось резкое торможение роста MT2A-ре-экспрессирующих клеток, по сравнению с отрицательным контролем (P
= 0,0027, рис 3D), в моделях ксенотрансплантатов. Эти данные свидетельствуют о том, что MT2A может играть определенную роль в подавлении пролиферации клеток GC в пробирке
и в естественных условиях
.
MT2A репрессирует активность NF-кВ через IκB-a повышающую регуляцию
было сообщено, что потеря MT2A индуцированных сигнал активации NF-kB в трансгенные модели мышей (MT2A-выбивают) [15]. Но роль MT2A как друга или врага в сигнального пути NF-kB была до сих пор спорным [18, 33]. Для того, чтобы истолковать механизм MT2A опосредованного подавления роста клеток GC в естественных условиях
и в пробирке
, мы попытались исследовать потенциальную связь между MT2A и NF-kB сигнального пути, а внутренний механизм был еще неясного в GC , MT2A и основные гены в передаче сигналов NF-kB, такие как р65, IκB α, п-IκB-альфа и нижестоящим эффектором сигналов NF-kB, циклин D1, были обнаружены в этом исследовании (Дополнительный файл1). Эктопическая экспрессия MT2A индуцированной как мРНК и экспрессию белка IκB-a во всех исследованных клеточных линий GC (BGC823, SGC7901 и AGS), IκB-α мРНК уровни устойчивого состояния были увеличены в 5,5 раза в BGC823 клетках повторно экспрессирующих MT2A за 48 час В AGS и SGC7901 клетках мы наблюдали 7,2-кратное и 4,3-кратное индукции IκB-альфа мРНК (рис 4а) на относительные уровни белка были совместимы с транскриптов мРНК, а п-IκB-α белка уменьшалась в тех GC клетки, трансфицированные MT2A вектор (фиг.4В). Как показано на фигурах 4C и D, нокдаун эндогенных MT2A в клетках GES1 привело к понижающей регуляции α IκB выражения, а также повышающей регуляции р-IκB-альфа и экспрессии циклин D1, что предполагает связь между MT2A активностью и IκB -α выражение. Эти эксперименты показывают, что MT2A индуцирует экспрессию IκB-альфа в мРНК и уровня белка. И MT2A опосредованной повышающей регуляции экспрессии IκB-альфа было дополнительно подтверждено иммунофлюоресценции (рис 5A, Дополнительный файл1). Таблица S2. Рисунок S1. Рисунок S2. Рисунок S3. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Выражения ЦОГ-2 и VEGF-C при раке желудка: корреляции с лимфангиогенез и прогностическое значение
• Подавление экспрессии СПАРК уменьшает клеточный рак желудка вторжения и выживание