Metalotioneina 2A inhibira aktivaciju NF-kB put i predviđa klinički ishod razvrstavaju s TNM fazi u bolesnika s rakom želuca sljedeće radikalne resekcije

Metalotioneina 2A inhibira aktivaciju NF-kB put i predviđa klinički ishod razvrstavaju s TNM fazi u bolesnika s karcinomom želuca sljedeće radikalne resekcije
apstraktne pregled pozadine
metalotioneina 2A (MT2A) kao proteina stresa, ima zaštitnu ulogu u želučanom za sluznicu barijera. Njegova uloga u razvoju raka želuca (GC) je nejasno. Mehanizam MT2A će se istraživati ​​u želučanom tumorigenezi.
Metode
MT2A izraz je otkrivena u 973 želučane primjeraka. Biološka funkcija određen je putem izvanmaternične izražava MT2A in vitro pregled i in vivo pregled. Mogući silaznih efektora od MT2A ispitivana su u signalizaciju NF-kB. Razine proteina od MT2A, IκB-a i p-IκB-a (Ser32 /36) ekspresija je analizirana u podskupu 258 pacijentima IHC bojanja. Prognostičke učinci MT2A, status IκB-a i TNM stadiju su procijenjeni pomoću Kaplan-Meier metodi i uspoređeni pomoću log-rank testa. Pregled Rezultati pregled Snižene MT2A izraz je otkriven u staničnim linijama i primarni tumori GC. U kliničkim podacima, gubitak MT2A (MT2A + u Normal (n = 171, 76,0%), intestinalne metaplazije (n = 118, 50,8%), GC (n = 684. 22,4%, P izvoznici < 0,001)) bio je povezan s lošom prognozom (P izvoznici < 0,001), napredni TNM stadij (P pregled = 0,05), a dolje reguliranje IκB-a izraz (P izvoznici < 0,001). Nadalje, MT2A bio neovisan prognostički potpis odvojeni od statusa IκB-a i patološke značajke. Osim toga, MT2A potiskivao rast stanica putem apoptoze i G2 /M uhićenja, što je negativno regulirano NF-kB put kroz up-regulaciji IκB-a i down-regulacije p-IκB-a i ciklin D1 izražavanja pregled. Zaključci
MT2A može igrati aktivnost tumor supresijski kroz zabranjivanje signalizaciju NF-kB i može biti prognostički biomarkera i potencijalna meta za individualnu terapiju GC pacijenata.
ključne riječi
metalotioneina 2A signalizaciju NF-kB rak želuca Prognoza TNM stadija Pozadina
Što je novo pregled Obilje metalotioneina 2A (MT2A) izložaka u želučane sluznice barijera, ali njegova uloga u progresiji karcinoma želuca (GC) je još uvijek nejasno. U ovoj analizi 171 normalnih želučanog tkiva, 118 intestinalne metaplazije i 684 primarnih želučanog karcinoma, smanjenje MT2A je značajno koreliraju s lošom prognozom. Ona inhibiraju proliferaciju GC stanicama kroz signalizaciju NF-kB inaktivacije. Ovi rezultati pokazuju da MT2A može biti važan prognostički marker i terapeutski cilj za GC.
Rak želuca (GC) je najčešće dijagnosticirana maligna bolest i dalje značajno opterećenje od raka u Aziji, posebno u Kini [1, 2]. Većina GC pacijenata koji se podvrgavaju operaciji već su u poodmakloj fazi i 5-godišnje preživljenje je raznolika. Nekoliko histološka faktori su izvijestili da se prognostički čimbenici GC, uključujući i veličine tumora, klasifikacija SZO, tumorski čvor-metastaza (TNM) faza, i diferencijaciji razred [3, 4]. Međutim, prognoza GC pacijenata na istoj pozornici je i dalje u suprotnosti [5]. Stoga, identifikacija specifičnih dijagnostičkih biljega i terapijski cilj omogućiti će pouzdano predviđanje, učinkovitu proširenje postoperativne opstanak i kvalitetu života bolesnika [6]. Pregled Cellular stres je pokazala da ima ulogu u molekularnoj regulaciji karcinogeneze [7, 8]. Metalotioneini (MTS) kao proteina stresa s niskom molekularnom težinom i bogate-cisteina imaju sposobnost visokog afiniteta za metalne ione i ROS-sakupljači. MT2A kao glavni izoforme MT igra važnu ulogu u želučane sluznice barijeru u bolesnika s gastritisom i kod modela štakora [9, 10]. Prethodno davanje egzogenog MT2A ili pre-indukcijom endogenog MT2A može zaštititi želuca i jetre od oštećenja izazvanog stresom i inhibiraju stvaranje stresom inducirane lipidne peroksida, što podrazumijeva zaštitni učinak MT2A na uzrokovanom stresom patogeneze i potencijalni terapeutski cilj podnio zahtjev za ranu prevenciju [11] - [13]. Nedavno je MT2A igra važnu ulogu u nastanku tumora i napredovanju više karcinoma uključujući GC [14]. Gubitak Miševi MT2A gena predispozicije za diethylnitrosamine izazvanog hepatocarcinogenesis aktiviranjem NF-kB ciljnih gena, što pokazuje da MT2A štiti miševe od oštećenja jetre hepatocarcinogen inducirane karcinogeneze i, naglašavajući njegovu potencijalnu terapijsku primjenu protiv hepatocelularnog karcinoma [15]. Neka istraživanja usmjerena na ulogu MT2A u zaštiti protiv H. pylori pregled inducira želučane ulazak upotrebom MT-nul miševi. Himeno, S. otkrili da aktivaciju NF-kB i ekspresiju NF-kB posredovanih kemokina u stanicama želuca bile su znatno veće u MT2A-null miša u odnosu na širokim miševa [9]. Ovi podaci upućuju na to da MT2A ostvaruje negativna kontrola za aktivnost transkripcijskog faktora NF-kB, ali je njegova uloga u želučanom karcinogenezi još nejasan [16] -. [18] pregled aberantne aktivacije NF-kB je povezana s upalom stanica, malignost i progresiju tumora [7, 19]. Funkcionalna aktivnost NF-kB je inhibirana putem vezivanja na njegov inhibitora IκB-a. Aktivacija NF-kB je rezultat proteazoma posredovana degradacija IκB-a fosforilacijom inhibitora (p-IκB-a), što sugerira da NF-kB put je potencijalna meta za individualnu terapiju [20] - [23] .
neki dokazi pokazuju da se povećana ekspresija MT2A važna za napredovanje karcinoma i MT2A početku je predložen kao protoonkogen u karcinomu dojke, jednjaka, prostate i jajnika, povezane s malignosti i lošom prognozom [24] - [27 ]. Nasuprot tome, on je podregulirao gastrointestinalnih tumora i hepatocelularnim karcinomima, gdje MT2A bilo je obrnuto koreliraju ili povezana s smrtnosti [28, 29]. Međutim, varijacija MT2A i njegove kliničke procjene i dalje kontradiktorna u GC [28, 30, 31]. Ovi rezultati ukazuju na to da deregulacija MT2A je uključen u patogenezu tumora, premda točan uloga još uvijek je nejasno u GC.
Stoga smo usmjereni da bi se otkrilo koekspresije MT2A i IκB-a gena u korelaciji s kliničkim patološke osobine i ishoda u velikoj mjeri želučanih tumora s dugoročnim follow-up podataka. Nadalje, sustavno analizirao ulogu MT2A vidu proteina stresa i negativni regulator u NF-kB aktivacije se karakterizirala svoju biološku ulogu i molekularni mehanizam in vitro pregled i in vivo pregled. Pregled metoda
pacijenta karakteristike pregled Želučani iz tumorskog tkiva 684 GC bolesnika liječenih u Pekingu Cancer Hospital od 1997. do 2007. godine procjenjuje. Pacijenti uključeni 513 muškaraca (75,0%) i 171 žena (25,0%) s prosječnom dobi pri dijagnozi od 54 godina (raspon od 19 do 81 godina). Follow-up period u rasponu od 1 do 127,2 mjeseci (medijan, 34,2 mjeseci). Svi pacijenti podvrgnuti radikalnu resekcija s namjerom izliječenja. Niti jedan od pacijenata je prethodno primilo neoadjuvansima kemoterapiju ili radijacijsku terapiju prije operacijskog zahvata. Kriteriji za uključivanje svih bolesnika je: (a) prepoznatljiv GC dijagnoza temelji se na šestom izdanju tumora-čvor-metastaza (TNM) klasifikacija Međunarodne unije protiv GC, (b) radikal resekcija, (c) pogodni formalin fiksiran, uklopljeno u parafin tkiva. Ukupno je 684 GCS imali kliničkopatološka podatke (nazvao kao "kohorte"). Osim toga, set 258 povlaštenih Uzorci su sakupljani iz skupine s follow-up podataka od 10 godina (nazvao kao "podskup"). Klinički ishod pacijenata zabilježen je od datuma operacije do datuma smrti. Osim toga, 118 crijevnih metaplazije (IM) i 171 normalnih tkiva želučanih prikupljeni su od tih GC pacijenata. Histološka procjena je provedena tri viši patologa. Demografski slom skupini i podskupini je navedena u dodatnoj tablici 1. Osim toga, 36 paru želučanih tumora sa susjednim normalnim tkivima samljevene u prah u tekućem dušiku na RT-PCR i real-time PCR izoforme (Dodatni file1). Tablica 1 Logistička regresijska analiza kliničkopatološkim značajkama i prognozom u GC pregled Variates pregled
br slučajeva (n = 258)
opstanak vrijeme (mjesec)
P pregled-vrijednost
Sex pregled Muški pregled 186
66.4 ± 4.6 pregled ženskih pregled, 72 pregled, 54,1 ± 4,8 pregled, 0,604 pregled Dob u dijagnozi izvoznici < 60 pregled 173 pregled 65,0 ± 4,9 pregled, ≥60
85 pregled, 59,2 ± 5,6 pregled, 0,867 pregled TNM stadij pregled sam
34 pregled 105,5 ± 7,7 pregled, ja vs. IV izvoznici < 0.001 pregled II
57 pregled, 74,0 ± 5,9 pregled, II vs IV izvoznici < 0.001 pregled, III
115 pregled 49.1 ± 3.4
III vs. IV
0,010
IV pregled dubine 52 pregled, 35,8 ± 4,1 pregled, tumora pregled pT1
13 pregled, 87,2 ± 9,9 pregled, pT1 vs pT4 pregled 0,005 pregled PT2 pregled 50 pregled, 89,1 ± 9,1 pregled, PT2 vs pT4 izvoznici < 0.001 pregled pT3
157 pregled 49,1 ± 2,9 pregled, pT3 vs pT4 pregled 0,159 pregled pT4 pregled, 38 pregled, 40,1 ± 5,3 pregled limfnih čvorova status pregled PN0 pregled, 78 pregled, 89,8 ± 6,2 pregled, PN0 vs PN3 pregled 0.001 pregled pN1 pregled 115 pregled 50,5 ± 3,4 pregled, pN1 vs PN3 pregled 0,212
pN2 pregled, 49 pregled, 46,6 ± 6,0 pregled, pN2 vs PN3 pregled 0,326 pregled PN3 pregled, 16 pregled, 47,5 ± 12,6 pregled udaljenim metastazama pregled pM0 pregled 232
67,5 ± 4,3 pregled PM1
26 pregled, 27.6 ± 5.8 izvoznici < 0.001 pregled, stupanj diferencijacije
D1
54 pregled, 76,0 ± 6,0 pregled, d0 pregled 204 pregled 59,8 ± 4,4 pregled, 0,011 pregled MT2A izraz izvoznici < 0.001 pregled, niska pregled 202 pregled 53,9 ± 3,4 pregled, visoka pregled 56 pregled, 86,9 ± 9,2 pregled, IκB-α izraz pregled niska pregled 164 pregled 61.6 ± 4.9 pregled visoka pregled 94 pregled, 64,9 ± 5,1 pregled, 0,248 pregled p-IκB-α izraz pregled niska pregled 126 pregled 74,1 ± 5,3 pregled, visoka pregled 132
47,7 ± 3,4 pregled, 0,005 pregled M0: bez udaljena metastaza; M1: daleka metastaze;
D1: dobro /umjereno se razlikuju GCS; D0: slabo diferencirane GCS pregled Imunohistokemijska analiza pregled IHC bojanje u nizu tkiva je izvršeno s MT2A antitijela. (Razrjeđenje 1: 100, 18-0133, Invitrogen, CA, SAD), p-IκB-α antitijela (1 : 200 razrjeđenje, ab47752, Abcam, Cambridge, UK), IκB-α antitijela (1: 300 razrjeđenje, SC-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). Za svaku biomarkera, slike su očno u tri patologa koji su bili zaslijepljeni na klinički ishod. Odstupanja su riješeni konsenzusom. Rezultati su postavljeni kao postotak pozitivnim bojanjem u svakom cilindru. Srednja postotak vrijednosti od dvije jezgre je izračunata da predstavlja jedan tumor (Dodatni file1).
Stanične linije
rak želuca stanične linije BGC823, MGC803, SGC7901 i PAMC82 su utvrđene u Kini, a kupljene iz banke tkiva u Šangaju (Shanghai, Kina). Posebno, BGC823 stanice pokazivale visok tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1 RF-48, SNU-1 SNU-5 i SNU-16 stanične linije su kupljene od ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, SAD). GES-1, besmrtne ljudskog želučanog epitela stanična linija, generiran je SV40 virusnih transfekcija na Beijing Cancer bolnici i kultivirane u DMEM mediju uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) na 37 ° C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO 2 [32]. pregled MTT i mekom agaru test pregled stanice su nanesene na ploče za uzgoj kulture s 96 jažica, a MTT se doda stanicama na 1-5 dana. MTT (5 ug /ml) je uklonjen nakon 4 sata inkubacije, a zatim je dodan dimetil sulfoksid (DMSO) da se otopi formazan produkta. Apsorbancija na 490 nm /570 nm je ispitivana pomoću čitača mikroposuda (Bio-rad680 ELISA). Stanice su tada inkubirane kroz 4 tjedna, obojene s vitalnom tetrazolium boje INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) dokumentiranja prisutnost ili odsutnost živih stanica kolonija. Mekani agar je fiksiran s 100 ul metanol-octenom kiselinom. (3: 1 vol /vol) i prebrojane su kolonije pregled Test tumorogenosti pregled BGC823 stanicama (5 × 10 5 stanice su suspendirane u 0.1 ml PBS) transfektirane s MT2A pretjerano izraženi vektor ili prazan vektor je injektirano subkutano u dorzalnu bok pet 4 tjedana stare ženke Balb /c nudo miševa (MT2A-ekspresije klonova na desnoj i kontrole vektor klonova na lijevoj strani. promjer tumora mjerenje i dokumentirani svakih 5 dana volumen tumora je izračunat prema formuli aB 2/2 (a > b).,. na kraju 25 dana, svi miševi su žrtvovani i volumen tumora je mjerena tri neovisna eksperimenta obavlja i dao slične rezultate. životinje su držane u objektima odobrenim od strane udruga za ocjenu i akreditaciju čuvanja laboratorijskih životinja u skladu s važećim propisima i međunarodnim standardima. pregled, Statistička analiza pregled χ pregled 2 test statistike i Studentov t-test pregled su korišteni za usporedbu predtretmana karakteristike slučajeva pacijenata. Opstanak rakom je analiziran pomoću Kaplan-Meier metodom i uspoređene pomoću log-rank testa. Primijenjeni su Spearman rank test i Fisherov egzaktni test pokazati kliničkopatološka korelacije. COX proporcionalna opasnost regresijski model je korišten s pripadajućim 95% intervala pouzdanosti (CIS) i P
vrijednosti. Svi statistički testovi bili obostrani, a p pregled vrijednosti manje od 0,05 smatrane su statistički značajne. Statistička analiza provedena je pomoću statističkog paketa SPSS (verzija 16.0, SPSS Inc, Chicago, IL). Pregled Studija odobrenje
Sve studije na životinjama su odobreni od strane etičkog povjerenstva u Peking University Cancer Hospital. Korištenje ljudskih tkiva i kliničkih podataka je u skladu sa smjernicama u bolnicu i odobren od strane lokalnih Etičkog povjerenstva. Pregled Rezultati pregled Snižene MT2A izraz je molekularna događaj u staničnim linijama i primarnih tumora GC pregled Expression od MT2A je procijenjena pomoću RT-PCR i Western blot u panelu staničnim linijama GC i GES1, koja je služila kao "normalne kontrole". Kao što je prikazano na slici 1A, MT2A mRNA znatno varirati s najvišim razinama u GES1. Nedostatak ili smanjenje MT2A izražavanja zabilježeno je u BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 i N87 stanica. Razina proteina MT2A izražavanja dodatno je otkrivena u šest zajedničkih korištene stanične linije GC (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, a MKN45) u usporedbi s GES1. Western blot analiza je pokazala da je u šest obično koriste GC stanične linije, nivoi ekspresije MT2A odsutna ili niska u usporedbi s GES1, u skladu s gore ekspresije mRNA detektirana (Slika 1B). Posebno, BGC823, MGC803 i SGC7901 stanice s nedostatkom MT2A izražavanja pokazuju visoku tumorigenecity na miševe. Slika 1 nazočan, ili je smanjena ekspresija MT2A se detektirati u staničnim linijama i primarnih tumora GC. Razina, MT2A mRNA je mjerena pomoću RT-PCR u staničnim linijama GC i normalne stanične linije besmrtne GES1. I polu-Kvantifikacija Analize su provedene s Imagetool 3.0 sive skale softver za skeniranje (normalizirana na ß-aktin razine). Pokus je rade po tri puta. B, stupanj MT2A proteina određena je pomoću Western blot analize u staničnim linijama GC i normalno besmrtne stanične linije GES1. U MT2A Proteinske vrpce su skenirani (normalizirane na ß-aktin razinama). C, Diferencijalna ekspresija MT2A mRNA transkripata u 36 uparenih GC tkiva i susjednih normalnog tkiva. U MT2A mRNA bendovi su skenirani (normalizirane na ß-aktin razinama). D MT2A razina proteina je otkriven u 36 uparenim GC tkivima Western blot. U MT2A Proteinske vrpce su skenirani (normalizirane na ß-aktin razinama). E, Smanjena MT2A opažena tijekom želučane maligne transformacije. (A) intenzivna bojenje MT2A u normalnim tkivima, (b) umjerena bojenje MT2A u IM tkiva, (c) slab bojenje MT2A u umjereno diferenciranim primarnim želučanog karcinoma i (d) negativan izraz MT2A u slabo diferencirane GCS (izvorno povećanje × 400). (D) u usporedbi s normalnim i prekancerozne lezije-IM uzoraka, smanjena MT2A bila uobičajena molekularna događaj u želučanom karcinogeneze (P izvoznici < 0,001) F: Diferencijalna ekspresija MT2A u GC, IM i normalnim tkivima IHC bojenja. Negativno: ocjena 0; Slaba: rezultat je 1-4; Jaka: rezultat 5-12. Za detalje pogledajte Dodatni file1.
36 primarnih tumora GC sa susjednim normalnim tkivima također su ispitani na slici 1C i D, koje potvrđuju rezultate dobivene iz GC staničnih linija, smanjenje MT2A mRNA je prikazan u GCS usporedbi s onim u kontrolnoj skupini zdravih (27/36, 75.0%, P pregled < 0,001, Slika 1C). Niska ekspresija MT2A proteina detektirana je u 29 od ukupno 36 slučajeva GC (80,6%) u usporedbi s podudarnim normalnim tkivima (P pregled < 0.001, Slika 1D). MRNK razina MT2A korelirana s razinom proteina određeno 'Western blot (R = 0.510, P = 0,009) pregled. U ljudi, MTS su kodirani pomoću obitelji gena koji se sastoji od 10 funkcionalnih izoforme a kodirani proteini se uobičajeno dijele u četiri grupe, MT1, MT2, MT3 i MT4 proteina. Budući da su kodiranje regije izoforme su visoko konzervirani u transkriptu i proteina razinama, MT2A je visoko homologna s MT1G, MT1E i MT1F (dodatne datotečne 1: Slika S1B). Dakle, eksperimenti na svakom pojedinom izoforme treba pažljivo provedena kako bi se osiguralo da se analizira točan izoforma. U ovom istraživanju, diferencijalna ekspresija MT1 transkripata zabilježeno je u staničnim linijama GC i primarnih tumora GC sa susjednim normalnih kontrola (n = 36) (dodatne datotečne 1: Slike S1A i S2). ovjerena smo stvarni MT2A gen-naniže u GC značajno u usporedbi sa susjednim normalnim tkivima (27/36, 75%, slika 1C). Nije bilo razlika MT1E i MT1F i MT1G mRNA transkripata u normalu i uzoraka tumora, kao i MT1B mRNA transkript nije bio prepoznatljiv u svim stanicama i tkivima (dodatne datotečne 1: Slike S1A i S2).
Ispitati kandidaturu MT2A u želučanom tumorigenezi, mi u početku karakterizira status MT2A izražavanja na 171 normalnih tkiva, 118 IM i 684 uzoraka GC po IHC bojenja. Je antitijelo za MT2A (P9 18-0133, Invitrogen) nije specifično za MT-2A samo i unakrsno reagiraju s MT-1 u nekoj mjeri, čak i ako se kloniraju pune dužine MT2A. Budući da ne postoji specifično antitijelo za otkrivanje MT2A, tako da mi koristimo zajedničku trgovinsku protutijela za IHC bojenja koji je objavljen u većini srodnih studija, MT2A izraz je klasificiran kao niskog i visokog izražavanja u normalan izgled tkiva, IM, i primarne GCS. Visoka razina MT2A izražavanja otkrivena je u 153 od 684 (22,4%) GC slučajeva, a 60 od 118 (50,8%) IM slučajeva, kao i 130 171 (76,0%) normalan izgled predmeta, odnosno (Dodatni file1: Tablica S3 P pregled < 0,001), što je sastojao od MT2A mRNA transkripata i proteina pomoću Western blot. Izraz MT2A je klasificiran kao negativne, slabim i jakim slučajevima u 13 (7,6%), 28 (16,4%) i 130 (76,0%) od 171 normalnih tkiva, odnosno; U IM tkiva, 27 (22,9%), 31 (26,3%) i 60 (50,8%) od 118 IM slučajeva su otkrivene, odnosno; U uzorcima GC, 494 (72,2%), 37 (5,4%) i 153 (22,4%) od 684 GC slučajeva otkrivene su redom (Slika 1F, Dodatni file1). Bilo je postepeno smanjena ekspresija MT2A proteina u IM i GC (p pregled-0,001, slika 1E, i F). Jasno je da MT2A mRNA visoko izražen u GES1 stanicama i normalnim tkivima, smanjen ili izgubljene u većini GC stanica i tkiva. Ovi rezultati sugeriraju da je smanjen MT2A je molekularna događaj u nastanku tumora i napredovanje. Pregled MT2A izraz je povezana s lošom prognozom u GC pregled MT2A je često dolje regulirano u GC. Kako bi istražili da li MT2A izraz bio je prognostički čimbenik u ljudskom GC, MT2A ekspresija proteina je ispitan u podskupini od strane IHC bojenja. Pojedinačni uzorci su kategorizirani kao niska (MT2A-) ili visoku ekspresiju (MT2A +). MT2A- je povezana s lošim ukupno preživljavanje (slika 2a, P izvoznici < 0,001). Jednosmjerna analiza pokazala je da su neki faktori, uključujući smanjen MT2A izraz (P izvoznici < 0,001), TNM stadija (P izvoznici < 0,01), dubine tumora (P izvoznici < 0,05), status limfnog čvora (P
< 0,05), udaljena metastaza (P izvoznici < 0,001) i stupanj diferencijacije (P pregled = 0,011) bili povezani sa slabom preživljavanje (Tablica 1). Cox multivarijatna analiza pokazala je da je sveukupno preživljenje bilo je povezano s MT2A izraza (MT2A + odnosu MT2A- opasnost omjer [HR], 0,429; 95% CI, 0.187-0.683; P = 0,002 pregled, tablica 2). Procijenili smo potencijalnu kliničku važnost MT2A povezivanjem svoj izraz uzorak s kliničkim parametrima (Dodatni file1: Tablica S4). MT2A izlagao veliku pozitivnu korelaciju s diferencijacijom tumora (P izvoznici < 0,001) i obrnuto korelacija s TNM fazi (P pregled = 0,05). Ovi rezultati pokazuju da MT2A korelaciji s kliničkim patoloških obilježja i preživljavanja u GC pacijenata. Slika 2 Analiza kombinaciji MT2A s TNM fazi predvidjeti klinički ishod u GC. Kaplan-Meier analiza sveukupnog-opstanka MT2A izražavanja je korišten prema TNM fazi. A, Prognostička vrijednost MT2A izražavanja u GC bolesnika bila korist za predviđanje ishoda bolesnika, niska ekspresija MT2A je povezana s lošim ukupno preživljavanje (P < pregled, 0,01); B, TNM stadij je korist za prognostički predviđanja u GC pacijenata. C D, Prognostička vrijednost MT2A u TNM stadija I-II i III faza-IV (P Netlogu = 0.048, P < pregled 0,001); E F, prognostičke vrijednosti MT2A ekspresiju u limfni čvor metastazama ili ne (P pregled < 0.001, P = 0,052 pregled, redom); G. Prognostička vrijednost MT2A izraza ni u udaljenim metastazama podskupine (n = 232, P izvoznici < 0,001); H. Prognostička vrijednost MT2A u pT3-pT4 podskupini (P izvoznici < 0,001). Svi podaci upućuju na to da MT2A mogao biti učinkovit prognostički potpis. Pregled Tablica 2. Cox regresijska analiza kliničkopatološkim mogućnosti i molekularnih potpisa u GC
Multivarijatna analiza
kovarijan do kraja točke pregled
omjer rizika
95% CI
P- pregled vrijednost
Starost ≥ 60 godina
1,300 pregled 0.840 do 1.934
0.254
Sex
0,823
0,499 do 1.233 pregled 0.292 pregled Diferencijacija
0.753
0.509 do 1.778 pregled 0.875
tumora invazivni dubina pregled 1,914 pregled 1,389 do 2,638 izvoznici < 0.001 pregled limfnih čvorova status pregled 1,291 pregled 1,034-1,612 pregled 0,024 pregled udaljene metastaze pregled 2,595 pregled 1,332-5,056 pregled 0,005 pregled MT2A pregled 0,429
0,187-0,683 pregled 0,002 pregled IκB-α pregled 0,779 pregled 0,524-1,311 pregled 0.423
p-IκB-a pregled 1,857 pregled 1,256 do 2.912 pregled 0,003 pregled prognostički značaj MT2A kombinaciji s TNM pozornici u GC pacijenata pregled za daljnje tumačenje izraza MT2A u prognostičkog značenja, u kombinaciji smo MT2A izraz sa kliničkopatološkim značajke u GC. Cilj je bio procijeniti prognozu GC bolesnika s patološkim klasifikaciji, te ispitati da li patološka klasifikacija treba dodatno supklasificirala za točnije predviđanje ishoda. Kao što je prikazano u dodatnim file1: Tablica S4, MT2A izraz u GC je bio povezan s TNM stadiju i diferencijacije tumora, što znači da MT2A može biti potencijalni molekularni biomarker za predviđanje patološkog klasifikaciju u GC. Kao dihotomna kovarijable, i MT2A i TNM stadij bili neovisni prediktori za preživljavanje (Tablica 2, Slika 2A i B). Prognostički značaj MT2A izražavanja dodatno je analiziran u GC bolesnika prema klasifikacijskom sustavu pTNM. Postoji značajna razlika u ukupnom preživljavanju između bolesnika s MT2A izražavanja iu ranom (I i II) i napredni (III i IV) scenskih skupina (P pregled = 0,048 i P izvoznici < 0,001; Slika 2C i D). Osim toga, status MT2A izraz lica bio je također na snazi ​​za prognozu u istim fazama (P Netlogu = 0.052, slika 2E P izvoznici < 0,001, Slika 2F P izvoznici < 0,001, Slika 2G i P
< 0.001, Slika 2H). Ovi podaci predstavljaju da MT2A je molekularni potpis predvidjeti klinički ishod na temelju TNM stadiju.
Obnova MT2A izražavanja rezultata u suzbijanju rasta GC stanicama in vitro pregled i in vivo
Kako otkriti mehanizam od MT2A u GC, mi stabilno transfektirane MT2A prekomjerno izražen plazmida i prazan vektor u tri GC staničnih linija (BGC823, SGC7901 i AGS). ispitan rast, apoptoze cijene i staničnog ciklusa od ovih staničnih linija koje su transfektirane s MT2A plazmida. Sposobnost stanica za život je smanjen u GC stanicama ponovno izrazio MT2A pomoću MTT testom (BGC823, P
= 0,0038, slika 3B, AGS, P pregled = 0.0007, Dodatna file1: Slika S3A, SGC7901, P
= 0,0004 , Dodatna file1: Slika S3C). Kako bi se dodatno istražiti funkciju MT2A u GC staničnim linijama, analizirali smo učinke MT2A izražavanja na proliferaciju stanica i regulaciji staničnog ciklusa Aneksin-V /PI bojanjem i protočnom citometrijom analize. Više apoptoza je otkriven u ovim GC stanicama ponovno eksprimiraju MT2A (P pregled < 0,01, odnosno Slika 3F, Dodatna file1: Slika S3A i C). Nadalje, G2 /M prijelazu zabilježeno je u GC stanicama pomoću izvanmaterničnu izraz MT2A. Omjeri G2 /M fazi u MT2A skupine bile su dvostruko veće od onih u vektorskim skupinama učinio (P izvoznici < 0,01, odnosno, Slika 3E i dodatno file1: Slika S3B i D). Slika 3 ektopijska ekspresija MT2A inhibira GC stanični rast in vitro i in vivo. MT2A inhibirana proliferaciju stanica i nastanak kolonija u ljudskim GC stanicama. A, Western blot MT2A je otkriven u BGC823 stanicama zaraženim s ektopične ekspresije MT2A plazmida i prazan vektor. U MT2A Proteinske vrpce su skenirani (normalizirani na ß-aktin za kontrolu za utovar). B, proliferacija stanica je analizirana pomoću MTT ispitivanja za ponovno eksprimiraju MT2A od BGC823 stanica ili ne. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± .SD tri neovisna pokusa. C, Rast BGC823 stanica je analizirana polukrutom mekom agar medija. Prazne vektorske kolonije formirane su statistički značajno više kolonije (srednja vrijednost = 426 velike kolonije po ploči od 95% CI. 387-472 kolonija) od MT2A klonova (srednja vrijednost = 136 kolonija 95% CI:.. 100-164 kolonije Brojevi predstavljaju prosječnu broj kolonija tri neovisna pokusa ± SD je izračunat relativni broj u kontroli i BGC823-MT2A stanica, te analizirani pomoću Student t-test pregled (P
= 0,0038). D, MT2A-inhibiran torn smjeru od BGC823 stanica , u golim miševima srednja volumen tumora za BGC823-MT2A 3 tjedna nakon injekcije bila 112 mm3 (95% CI: 93-147 mm3), u usporedbi sa 352 mm3 (95% CI: 298-423 mm3) za BGC823-vektora. podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD zapremine tumora izvedene iz svake skupine. U svakoj skupini, veličine tumora su mjerene koristeći šestar na naznačenim vremenskim točkama. podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD (t pregled testiranju, P
= 0,0027) E, FACS analiza je pokazala da MT2A prekomjerna ekspresija dovela do G2 /M uhićenja, a omjer G2 /M fazi bila je veća nego u praznim kontrole i matičnih stanica (P < pregled, 0,01). F, Antitumorni učinak MT2A se detektira aneksin V /FITC PI bojanja testu. Postotak apoptotičnih stanica bio je 52,9% ± 5,4% u MT2A skupini u usporedbi s onim u matičnim stanicama (8,3% ± 2,4% i stanica transficiranih s praznim vektorom (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Nadalje, mi pozlaćen BGC823 stanice potiskuju MT2A ili ne u mekom agaru, izvanmaternične izraz MT2A je potvrđeno Western blot analizom prvog (slika 3A). Nakon 3 tjedna kulture MT2A izražavanja izazvao je statistički značajno smanjenje tvorbe kolonija (P
= 0,0053, slika 3C). Nadalje, došlo je do dramatičnog inhibicija rasta MT2A-re eksprimirajuće stanice u usporedbi s negativnom kontrolom (P = 0,0027
Slika 3d), u modelima ksenografta. Ovi podaci pokazuju da MT2A može igrati ulogu u suzbijanju širenja GC stanicama in vitro pregled i in vivo pregled. pregled MT2A potiskuje aktivnost NF-kB kroz IκB-a na regulaciju
je izvijestio da je gubitak MT2A inducirana aktivacija NF-kB signala u genetski manipulirani modelu miševa (MT2A-knock out) [15]. No, uloga MT2A kao prijatelj ili neprijatelj u signalnom putu NF-kB je još uvijek kontroverzna [18, 33]. Kako bi se interpretirati mehanizam MT2A posredovana GC suzbijanje rasta stanica in vivo pregled i in vitro pregled, pokušali smo istražiti potencijalni odnos između MT2A i NF-kB signalnog puta, a unutarnji mehanizam je još uvijek nejasno GC , MT2A a glavni gena u signalizaciju NF-kB, kao p65, IκB-a, p-IκB-a i nizvodnog efektora signalizaciju NF-kB, ciklin D1 otkrivene su u ovoj studiji (Dodatni file1). Ektopično izraz MT2A inducirane i mRNA i proteina izraz od IκB-a u svim ispitivanim GC staničnim linijama (BGC823, SGC7901 i AGS), IκB-α mRNA ravnotcžnc nivoi su povećani za 5,5 puta u BGC823 stanice ponovno izrazio MT2A za 48 h. U AGS i SGC7901 stanica, bilježimo 7,2 puta i 4,3 puta indukciju IκB-a mRNA (slika 4a), relativna razina proteina bili su u skladu s mRNA transkripata, a p-IκB-α protein je smanjena u tim GC stanice transfektirane MT2A vektor (slika 4b). Kao što je prikazano na slikama 4C i D, obaranje endogenog MT2A u GES1 stanica dovela je do down-regulacije IκB-a izražavanja, kao i up-regulaciji p-IκB-a i ciklin D1 izražavanja, što ukazuje na vezu između MT2A aktivnosti i IκB -α izraz. Ovi eksperimenti pokazuju da MT2A inducira ekspresiju IκB-a u mRNA i proteina. I MT2A posredovanih doreguliranjem IκB-a ekspresija je dalje potvrđena imunofluorescencije (Slika 5A, Dodatni file1). Pojasniti mehanizam MT2A na IκB-a ekspresije, izveli smo reporter analize luciferaze restrukturiranjem IκB-a promotorske regije, 5,6-struko doreguliranje aktivnosti promotora luciferaze IκB-a nađen je u MT2A skupini od one u vektor skupini ( Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Iskazi COX-2 i VEGF-C u rak želuca: korelacija s limfangiogeneze i prognostički implications
• Silazni SPARC izražavanja smanjuje rak želuca staničnu invaziju i survival