Metalotioneiną 2A slopina NF-κB keliu aktyvavimo ir prognozuoja klinikinių rezultatų atskirti su TNM etape skrandžio vėžiu sergantiems pacientams po radikalaus rezekcijos

Metalotioneiną 2A slopina NF-κB keliu aktyvavimo ir prognozuoja klinikinių rezultatų atskirti su TNM etape skrandžio vėžiu sergantiems pacientams po radikalaus rezekcijos pervežimas tezės
Background pervežimas metalotioneiną 2A (MT2A) kaip streso baltymų, vaidina apsauginį vaidmenį skrandžio gleivinės barjeras. Jos vaidmuo skrandžio vėžiu (GC) plėtra yra neaiški. Iš MT2A mechanizmas bus tiriamas skrandžio Tumorigenesis.
Metodai
MT2A išraiška buvo aptikta 973 skrandžio egzempliorių. Biologinis funkcija buvo nustatyta per negimdinio išreiškiant MT2A in vitro, parsisiųsti ir in vivo,
. Galimi tolesni vykdymo iš MT2A buvo tiriama NF-κB signalizacijos. Baltymų lygiai MT2A, IκB-alfa ir p-IκB-alfa (ser32 /36) išraiška buvo analizuojami 258 pacientų pogrupiui IHC dažymo. Prognostinę poveikis MT2A, statusas IκB-alfa ir TNM etape buvo vertinami naudojant Kaplan-Meier metodą ir lyginant naudojant log-rank testą.
Rezultatai
Sumažėjęs MT2A išraiška buvo aptikta ląstelių linijų ir pirminių navikų GC. Klinikinių duomenų praradimo MT2A (MT2A + normaliomis (n = 171, 76,0%); Žarnų metaplazija (n = 118, 50,8%); GC (n = 684. 22,4%, p
< 0,001)) buvo susijęs su blogos prognozės (P
< 0,001), pažangių TNM stadija (p
= 0,05), o žemyn reguliavimo IκB-alfa išraiškos (p
< 0,001). Be to, MT2A buvo nepriklausomas prognozinis parašas atskirti nuo IκB-alfa ir patologinių funkcijų statusą. Be to, MT2A slopino ląstelių augimą per apoptozės ir G2 /M suėmimo, o tai neigiamai reglamentuoja NF-κB kelią per naujausią reguliavimo IκB-alfa ir žemyn reguliavimo p-IκB-alfa ir cikloniniai D1 raiška.
Išvadose
MT2A gali žaisti navikas slopinančią veiklą per slopina NF-κB signalizacijos ir gali būti prognostinė biologinis ir potencialiu individualiam gydymui GC pacientams.
Raktiniai žodžiai
metalotioneiną 2A NF-κB signalizacijos Skrandžio vėžio prognozė TNM etapo Background
Kas naujo
gausa metalotioneiną 2A (MT2A) eksponatų skrandžio gleivinės barjero, tačiau jos vaidmuo skrandžio vėžys (GC) progresavimo vis dar neaišku. Šioje 171 normalios skrandžio audinių, 118 žarnyno metaplazijos ir 684 pradinių skrandžio vėžio analizės, sumažėjo MT2A reikšmingai koreliavo su blogos prognozės. Tai slopino GC ląstelių proliferaciją per NF-κB signalizacijos nukenksminimą. Šie rezultatai rodo, kad MT2A gali būti svarbus prognostinis žymeklį ir terapinis taikinys GC.
Skrandžio vėžio (GC) yra dažniausiai diagnozuojama piktybinis navikas ir išlieka didelė našta vėžio Azijoje, ypač Kinijoje [1, 2]. Dauguma GC pacientai, kuriems atliekama operacija jau gerokai pažengęs, o 5 metų išgyvenamumas yra įvairi. buvo užregistruoti keli histologiniai veiksniai būti prognostiniai veiksniai GC, įskaitant naviko dydis, kuris klasifikavimo, naviko mazgas metastazės (TNM) etapo sistemą ir diferenciacijos laipsnio [3, 4]. Tačiau, prognozė GC pacientams tuo pačiu etape yra vis dar neatitinka [5]. Todėl nustatyti konkrečių diagnostinių žymenų ir terapinį tikslą leistų patikimai numatyti, kaip veiksmingai išplėsti pooperacinis išgyvenamumas ir gyvenimo kokybę pacientams [6].
Mobilieji stresas buvo įrodyta, kad vaidinti vaidmenį molekulinio reguliavimo kancerogenezėje [7, 8]. Metallothioneins (MTS), nes streso baltymų turinčių mažą molekulinę masę ir turtingą-cisteino turėti aukšto afiniteto metalo jonais ir ROS žalingo poveikio galimybę. MT2A kaip pagrindinis izoformos MTS vaidina svarbų vaidmenį skrandžio gleivinės barjero pacientams, sergantiems gastritu ir graužikų modelių [9, 10]. Pasirengimo administravimas egzogeninės MT2A arba išankstinio indukcijos endogeninio MT2A gali apsaugoti skrandį ir kepenis nuo streso sukeltos žalos ir slopina streso sukeltos lipidų peroksidų susidarymą, o tai reiškia apsauginį poveikį MT2A streso sukeltos patogenezės ir galimą terapinį tikslą kreipėsi dėl ankstyvosios prevencijos [11] - [13]. Neseniai MT2A vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis ir progresavimo keliais karcinoma įskaitant GC [14]. Pelėms praradimas MT2A geno linkę susirgti diethylnitrosamine sukeltos hepatocarcinogenesis aktyvuojant NF-κB tikslines genus, kurie rodo, kad MT2A apsaugo peles nuo hepatocarcinogen sukeltas kepenų pažeidimas ir kancerogeninio poveikio, pabrėždamas savo galimą terapinį taikymą nuo kepenų vėžio [15]. Kai kurie tyrimai sutelktas į MT2A vaidmens apsaugos nuo H.pylori
indukuotų skrandžio traumos naudojant MT-neapibrėžtų pelėms. Himeno S. atrado, kad NF-κB aktyvinimą ir išraišką NF-κB-tarpininkaujant chemokinus skrandžio ląstelėse buvo ženkliai didesnis MT2A null pelių nei plataus tipo pelių [9]. Šie duomenys leidžia manyti, kad MT2A supranta neigiamą kontrolę transkripcijos faktorius NF-κB veiklos, tačiau jos vaidmuo skrandžio kancerogenezėje dar dviprasmiškas [16] - [18].
Aberrant aktyvavimo NF-κB yra susijęs su ląstelių uždegimas, piktybinis navikas , ir naviko progresavimas [7, 19]. Funkcinė veikla NF-κB slopina per privalomas jo inhibitorius, IκB-alfa. Aktyvinimas NF-κB yra lėmė proteasomos tarpininkaujant degradacijos IκB-alfa iki fosforilinimo inhibitoriaus (P-IκB-alfa), rodo, kad NF-κB būdas yra potencialus taikinys individuali terapija [20] - [23] .
tikra nurodytą įrodymų, kad padidėję MT2A išraiška yra svarbi vėžio progresavimą, ir MT2A iš pradžių pasiūlė, kaip prokalbės onkogeno krūties, stemplės, prostatos, ir kiaušidžių vėžio, susijęs su piktybiniais navikais ir blogos prognozės [24] - [27 ]. Priešingai, tai žemyn reguliuojama virškinimo trakto navikų ir kepenų ląstelių karcinoma, kur MT2A yra arba atvirkščiai koreliuoja arba nesusiję su mirtingumu [28, 29]. Tačiau MT2A ir jo klinikinės vertinimo variantas lieka prieštaringas GC [28, 30, 31]. Šie rezultatai rodo, kad reguliacijos sutrikimas ir MT2A dalyvauja naviko patogenezės, nors tiksli vaidmuo yra vis dar neaiški GC.
Taigi, mes sutelktas atskleisti bendrą išraišką MT2A ir IκB-alfa geno koreliuojantį su klinikiniais patologinių funkcijų ir rezultatų į didelio masto skrandžio navikų su ilgalaikių stebėjimo duomenys. Be to, mes nuolat analizavo MT2A vaidmenį kaip streso baltymų ir neigiamas reguliatorių NF-κB aktyvavimo, apibūdinant biologinį vaidmenį ir molekulinė mechanizmą in vitro, parsisiųsti ir in vivo,
.
Metodai
Pacientų charakteristikos buvo vertinami
skrandžio naviko mėginiai iš 684 GC pacientams, gydytiems Pekino vėžio ligoninėje nuo 1997 iki 2007 m. Pacientai įtraukiami 513 vyrai (75,0%) ir 171 moterys (25,0%), kurių vidutinis amžius diagnozės 54 metų (diapazonas, nuo 19 iki 81 metų). Tolesnių laikotarpis svyruoja nuo 1 iki 127,2 mėnesių (vidurkis 34,2 mėnesio). Visi pacientai buvo iš esmės rezekcija su gydomuoju ketinimų. Nė vienas iš pacientų gavo indukcinę chemoterapiją ar radioterapija prieš operaciją. Įtraukimo kriterijus visiems ligoniams yra: (a) skiriamasis GC diagnostika pagal šeštojo leidimo naviko-mazgas-metastazių (TNM) klasifikacija Tarptautinės Sąjungos prieš GC, (b) radikalas rezekcija, (c) tinka formalino fiksuoto, parafino įdėta audiniuose. Iš 684 GCS bendras turėjo klinikos duomenis (vadinamo kaip "kohortos"). Be to, 258 tinkamų pavyzdžių rinkinys buvo surinkti iš kohortos su 10 metų stebėjimo duomenys (vadinami kaip "pogrupyje). Klinikinis rezultatas pacientų buvo įrašytas nuo operacijos dienos iki mirties dienos. Be to, 118 žarnyno metaplazija (IM) ir 171 normalus skrandžio audiniai buvo renkami iš šių GC pacientams. Histologinis įvertinimas buvo atliktas trijų vyresniųjų patologai. Demografinė suskirstymas kohortos ir pogrupyje yra įtraukta į papildomą lentelę 1. Be to, 36 suporuoti skrandžio navikai gretimuose normaliuose audiniuose buvo sumalta į miltelius pagal skystu azotu už RT-PGR ir realiojo laiko PGR MT izoformų (Papildoma failas1). 1 lentelė logistinės regresijos analizė klinikos funkcijų ir prognozės GC
Variates
Nr atvejų (n = 258)
išgyvenimo laikas (mėnuo)
P
-Pridėtinės
Lytis
Vyras
186
> 66,4 ± 4,6
Moteris
72
4,8
0,604
54,1 ± Amžius diagnozę
< 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
85
5,6
0,867
59,2 ± TNM stadija
Aš
34
105,5 ± 7,7
Aš vs IV
< 0.001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs IV
< 0.001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs IV
0,010
IV
52
4,1
35,8 ± auglio gylio
PT1
13
87,2 ± 9,9
PT1 vs PT4
0,005
pt2
50
89,1 ± 9,1
pt2 vs PT4
< 0.001
PT3
157
49,1 ± 2,9
PT3 vs PT4
0,159
PT4
38
40,1 ± 5,3
Limfmazgių būklė
pN0
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs pn3
0,001
pN1
115
50,5 3,4
± pN1 vs pn3
0.212 pervežimas pN2
49
46,6 6,0
± pN2 vs pn3
0.326
pn3
16
47,5 ± 12,6
Tolima metastazių
pm0
232
67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8
< 0.001
diferenciacijos laipsnis pervežimas D1
54
76,0 6,0
± d0
204
4,4
0,011
59,8 ± MT2A išraiška
< 0.001
mažas
202
53,9 ± 3,4 Viesbutis High
56
86,9 ± 9,2
IκB-α ekspresijos
mažas
164
61,6 ± 4,9 Viesbutis High
94
64,9 ± 5,1
0,248
p IκB-α ekspresijos
mažas
126
74,1 ± 5,3 Viesbutis High
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: ne tolima metastazių; M1: tolimas metastazių;
D1 gerai /vidutiniškai-diferencijuoti GCS; D0: blogai diferencijuoti GCS
Imunohistocheminis analizė
IHC dažymo audinių masyvo buvo atliktas su MT2A antikūnų. (1: 100 skiedimo; 18-0133, Invitrogen, CA, JAV), p-IκB-α antikūnas (1 200 praskiedimo; ab47752, Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė), IκB-α antikūnas (1: 300 praskiedimo; SC-371, Santa Cruz biotechnologijos, Kalifornija). Už kiekvieną biologinis žymuo, pelnė vaizdų vizualiai trys patologai, kurie buvo apakinti į klinikinę rezultatus. Neatitikimai buvo sprendžiami bendru sutarimu. Rezultatai buvo paskirti kaip teigiamą dažymo procentais per kiekvieną cilindrą. Vidutinė procentinė vertė dviejų branduolių buvo apskaičiuojamas atstovauti vieną auglį (Papildoma failas1).
Mobilaus ryšio linijos
skrandžio vėžio ląstelių linijas BGC823, MGC803, SGC7901 ir PAMC82 buvo įkurta Kinijos ir perkamos iš audinių banko Šanchajuje (Šanchajus, Kinija). Ypač, BGC823 ląstelės eksponuojami aukštos tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1 RF-48, SNU-1, SNU-5 ir SNU-16 ląstelių linijos buvo įsigytas iš ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, JAV). GES-1, įamžinta žmogaus skrandžio epitelio ląstelių linija, buvo sukurtas SV40 virusinės transfekciją Pekino vėžio ligoninėje ir kultūringas DMEM terpėje papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (Gibco, gyvenimas technologijas, Grand Island, NY, JAV) 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje sudėtyje yra 5% CO 2 [32].
MTT ir minkštas agaro tyrimas
ląstelės buvo pasėjamos į 96-šulinėlių auginimo plokščių, ir MTT buvo įtraukta į ląsteles 1-5 dienų. MTT (5 mikrogramai /ml) buvo pašalintas po to 4 h inkubacijos, ir tada dimetilsulfoksido (DMSO) buvo įtraukta į soliubilizuotų formazano. Dengimas esant 490 nm /570 nm buvo tiriami mikroplokštelių skaitytojui (Bio-rad680 ELISA). Ląstelės inkubuojamos 4 savaites, tamsintas su gyvybiškai tetrazolio dažų INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) dokumentuoti buvimą ar nebuvimą gyvybingų ląstelių kolonijų. Minkštas agaro buvo nustatytas su 100 pL metanolio-acto rūgšties. (3: 1 tūris /tūris) ir buvo skaičiuojamas kolonijos
tumorogeniš- tyrimas
BGC823 ląstelių (5 × 10 5 ląstelės suspenduotos 0,1 ml PBS) perkeltų su MT2A per išreiškė vektorius arba tuščias vektorius buvo švirkščiamas po oda nugaros krašto penkerių 4 savaičių amžiaus patelė BALB /c nuogas pelėms (MT2A-klonų Dešinėje ir vektorius kontrolės klonų kairėje. naviko skersmuo buvo matuojamas ir dokumentais kas 5 dienas auglys tūris buvo apskaičiuojamas pagal formulę ab 2/2 (a > b)... Trys Tuo 25 dienų pabaigoje, visos pelės buvo paaukotos ir navikas tūris buvo matuojamas nepriklausomi bandymai buvo atliekamas ir davė panašius rezultatus. gyvūnai buvo prižiūrimi pagal vertinimo ir akreditavimo laboratorinių gyvūnų priežiūrą pagal galiojančius teisės aktus ir tarptautinius standartus asociacijos patvirtintų įrenginių.
Statistinė analizė
χ
2 bandymų statistika ir Stjudento t
-test buvo naudojamas palyginti paruošiamųjų charakteristikas pacientų atvejais. Vėžys susijusių išlikimo buvo analizuojami naudojant Kaplan-Meier metodą ir lyginant naudojant log-rank bandymus. Ietininkas rank testas ir tikslus Fišerio testas buvo taikomas įrodyti klinikos koreliacijas. Cox proporcinės pavojaus regresijos modelis buvo naudojamas su susijusiais 95% patikimumo intervaluose (KĮ), o P
vertybes. Visi statistiniai testai buvo dvipusiai, ir buvo laikomi statistiškai reikšmingas P
vertės mažesnis nei 0,05. Statistinė analizė atlikta naudojant statistinį paketą SPSS (versija 16.0; SPSS Inc, Čikaga, IL).
Studijų patvirtinimo
Visi tyrimai su gyvūnais patvirtino etikos komitetui Pekino universiteto onkologijos ligoninėje. Žmogaus audinių ir klinikinių duomenų naudojimas buvo pagal ligoninės gaires ir vietos etikos komiteto patvirtinti.
Rezultatai
Sumažėjęs MT2A išraiška yra molekulinės renginys ląstelių linijų ir pirminių navikų GC
raiškos iš MT2A buvo įvertintas RT-PGR ir Vakarų dėmė kurį GC ląstelių linijų ir GES1, kuris tarnavo kaip "normalus kontrolė" skydelyje. Kaip parodyta 1a paveiksle, MT2A iRNR esmės skyrėsi aukščiausius lygius GES1. Trūksta arba sumažėjimas MT2A išraiška buvo pastebėtas BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1 RF-48 ir N87 ląsteles. Baltymų lygis MT2A išraiška buvo dar aptikta šešių bendrų naudojamas GC ląstelių linijas (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87 ir MKN45), palyginti su GES1. Vakarų dėmė analizė parodė, kad per šešis dažniausiai naudojamų GC ląstelių linijų, iš MT2A išraiškos lygis buvo išvykęs ar maža, palyginti su GES1, suderinamas su mRNR ekspresijos aukščiau aptikto (1b pav.) Ypač, BGC823, MGC803 ir SGC7901 ląstelių iš MT2A išraiškos trūkumo eksponuoti didelį tumorigenecity nuogas pelių. 1 pav nėra arba sumažėjo išraiška MT2A aptinkama ląstelių linijų ir pirminių navikų GC. A MT2A iRNR lygis buvo matuojamas RT-PCR GC ląstelių linijų ir normaliai nemirtingas ląstelių linijos GES1. Ir pusiau kiekybinio vertinimo analizė buvo atlikta su Imagetool 3.0 pilkosios skalės skenavimo programinę įrangą (normalizuotas į beta-aktino lygį). Eksperimentas buvo atliekamas tris kartus. B MT2A baltymų lygis lėmė Vakarų blot analizė GC ląstelių linijų ir normaliai nemirtingas ląstelių linijos GES1. Į MT2A baltymų juostos buvo nuskaitomi (standartizuoti beta-Aktinis lygiai). C, skirtumas išraiška MT2A iRNR stenograma 36 suporuotų GC audinių ir gretimuose normaliuose audiniuose. Į MT2A iRNR juostos buvo nuskaitomi (standartizuoti beta-Aktinis lygiai). D MT2A baltymo koncentracija buvo aptikta 36 suporuotų GC audinių Imunoblotingo metodu. Į MT2A baltymų juostos buvo nuskaitomi (standartizuoti beta-Aktinis lygiai). E Sumažėjęs buvo pastebėtas MT2A metu skrandžio piktybinę transformaciją. (A) intensyvus dažymo MT2A sveikuose audiniuose, (b) vidutinio dažymo MT2A MP audinių, (c) silpnas dažymo MT2A, vidutiniškai diferencijuotos pirminių skrandžio vėžio ir (d) neigiamas išraiška MT2A prastai diferencijuoti GCS (originalas didinimas × 400). (D), lyginamos su normaliąja ir ikivėžinių pakitimų-MP pavyzdžių, sumažino MT2A buvo bendras molekulinės renginys skrandžio kancerogenezėje (p
< 0,001) F: Diferencialo išraiška MT2A GC, IM ir normaliuose audiniuose IHC dažymo. Neigiamas: rezultatas 0; Silpnas: Rezultatas tapo 1-4; Stiprus: rezultatas 5-12. Dėl išsamesnės informacijos, žr Papildoma failas1.
36 pirminius auglius GC su gretimuose normaliuose audiniuose, taip pat buvo išnagrinėti 1C ir D paveiksle, patvirtinti rezultatus, gautus iš GC ląstelių linijų, sumažėjo MT2A iRNR buvo rodomas GCS palyginti su, kad suderintos įprastos kontrolės (27/36, 75,0%, p
< 0,001, 1C pav.) Žemas išraiška MT2A baltymų buvo aptikta 29 iš 36 GC atvejais (80,6%), palyginti su suderintų normaliuose audiniuose (p
< 0,001, 1D pav.) Lygis mRNR MT2A buvo susijusi su baltymų lygiu Western Blot (R = 0,510, P
= 0,009). Žmonėms, MTS yra užkoduotas genų sudaro 10 funkcinių MT izoformų šeimos ir koduoti baltymai tradiciškai skirstomos į keturias grupes, MT1, MT2, MT3 ir MT4 baltymų. Nuo kodavimo regionai MT izoformų yra labai užkonservuotas stenograma ir baltymų koncentracijos, MT2A yra labai homologiško su MT1G, MT1E ir MT1F (papildomas failą 1: S1B pav). Taigi, eksperimentai su bet kurio atskiro izoformos turėtų būti atidžiai atliekami siekiant užtikrinti, kad tiksli izoforma yra analizuojamas. Šiame tyrime, Diferencialo išraiška MT1 nuorašai buvo pastebėtas GC ląstelių linijų ir pirminių navikų GC su gretimų įprastos kontrolės (n = 36) (papildomas failų 1: Skaičiai S1A ir S2). Mes patvirtintas faktinis MT2A geną žemyn reguliavimą GC žymiai palyginti su gretimų sveikų audinių (27/36, 75%, 1C pav). Nebuvo MT1E ir MT1F ir MT1G mRNR nuorašai įprastiniu ir navikų mėginiuose taip pat MT1B iRNR stenograma skirtumas nebuvo aptinkama visose ląstelėse ir audiniuose (Papildoma failų 1: Skaičiai S1A ir S2).
Ištirti kandidatūrą MT2A skrandžio tumorigenesis, mes iš pradžių apibūdino MT2A išraiškos būklės 171 normaliuose audiniuose, 118 MP ir 684 GC mėginių IHC dažymo. Už MT2A antikūnas (E9 18-0133, Invitrogen) yra nėra specifinis MT-2A tik, ir kryžminio reaguoja su MT-1 tam tikru mastu, net jei ji yra klonuotas į visą ilgį MT2A. Kadangi nėra specifinė antikūnų aptikti MT2A, todėl mes naudojame bendrą komercinę antikūnų IHC dažymo, kuris buvo paskelbtas dauguma susijusių studijų, MT2A išraiška yra klasifikuojama kaip žemo ir aukšto raiškos įprastą išvaizdą audinių, IM, ir pirminės GCS. Aukšto lygio MT2A išraiška buvo aptikta 153 684 (22,4%) GC atvejais ir 60 118 (50,8%) MP bylas, taip pat 130 171 (76,0%) įprastą išvaizdą atvejais, atitinkamai (Papildoma failas1: Lentelė S3 P
< 0,001), ji buvo sudaryta su MT2A mRNR nuorašai ir baltymų raiškos Vakarų dėmė. Iš MT2A išraiška buvo klasifikuojama kaip neigiamas, silpnų ir stiprių atvejais 13 (7,6%), 28 (16,4%) ir 130 (76,0%) iš 171 sveikų audinių, atitinkamai; MP audinių, 27 (22,9%), 31 (26,3%) ir 60 (50,8%) iš Buvo nustatytos atitinkamai 118 MP atvejais; GC mėginių, 494 (72,2%), 37 (5,4%) ir 153 (22,4%) iš 684 GC atvejais buvo aptikta atitinkamai (pav 1F, Papildoma failas1). Ten buvo palaipsniui mažėjo išraišką MT2A baltymų IM ir GC (P
< 0,001 1E ir F pav.) Akivaizdu, kad MT2A iRNR buvo labai išreikštas GES1 ląstelių ir normaliuose audiniuose, bet buvo sumažintas arba prarasti daugeliu GC ląstelių ir audinių. Šie rezultatai rodo, kad sumažėjo MT2A yra molekulinės renginys Tumorigenesis ir progresavimą.
MT2A išraiška koreliuoja su prastos prognozės GC
MT2A dažnai buvo žemyn reguliuojama GC. Ištirti, ar MT2A išraiška buvo prognostinis faktorius žmogaus GC, MT2A baltymo ekspresija buvo nagrinėjamas IHC dažymo pogrupyje. Atskiri mėginiai buvo klasifikuojama kaip mažo (MT2A-) arba aukštos raiškos (MT2A +). MT2A- buvo susijęs su prasta bendro išgyvenamumo (2a pav, p pervežimas < 0,001). Vienmatės analizė parodė, kad kai kurie veiksniai, įskaitant sumažėjo MT2A išraišką (P
< 0,001), TNM pakopų (p
< 0,01), naviko gylis (P
< 0,05), limfmazgių būklę (p
< 0,05), toli metastazių (P
< 0,001) ir diferenciacijos laipsnis (P
= 0,011) buvo susijęs su prastos išlikimo (1 lentelė). Coxas daugiamatis analizė parodė, kad bendras išgyvenamumas buvo susijęs su MT2A išraiškos (MT2A + palyginti MT2A- rizikos santykis [hr], 0.429; 95% NVS, 0.187-0.683; P
= 0,002, 2 lentelė). Mes įvertino galimą klinikinę reikšmę MT2A susiejant savo išraiška modelis su klinikinių parametrų (papildomas failas1: Lentelė S4). MT2A eksponuojami plačiai teigiamą koreliaciją su naviko diferenciacijos (p
< 0,001) ir atvirkštinis ryšys su TNM etape (p
= 0,05). Šie rezultatai rodo, kad MT2A koreliuoja su klinikiniais patologinių funkcijų ir išlikimo GC pacientams. 2 pav analizė kartu MT2A su TNM etape klinikinei baigčiai GC. Kaplan-Meier analizė bendros-išlikimo MT2A išraiška buvo naudojamas pagal TNM etape. A prognozinė vertė MT2A raiškos GC pacientų buvo nauda prognozuoti pacientų rezultatus, žemas išraiška MT2A buvo susijęs su prasta bendro išgyvenamumo (P <
0,01); B TNM stadija buvo nauda prognostinę prognozavimas GC pacientams. C D prognozinė vertė MT2A į TNM I etapo II ir III-IV stadijos (p
= 0,048, p <
0,001, atitinkamai); D E F, prognozinė vertė MT2A raiškos limfmazgių metastazių ar ne (p
< 0,001, p
= 0,052, atitinkamai); G. prognozinė vertė MT2A išraiškos jokiu tolimoje metastazių pogrupyje (n = 232, p
< 0,001); H. prognozinė vertė MT2A į PT3-PT4 pogrupio (p
< 0,001). Visi duomenys leidžia manyti, kad MT2A gali būti veiksminga prognostinė parašas.
2 lentelė Cox regresinė analizė klinikos funkcijų ir molekulinės parašų GC

Dispersinės analizės
kovariantą iki galutinio taško

Rizikos santykis

95% PI
P-
vertė
Amžius ≥ 60 metų
1,300
0,840 iki 1.934
0,254
Lytis
0.823
0.499 iki 1.233
0,292
diferencijavimas
0.753
0.509 iki 1.778
0,875 pervežimas naviko invazinių gylis
1,914
1,389 iki 2,638
< 0.001
Limfmazgių būklė
1,291
1,034-1,612
0,024
Tolima metastazės
2,595
1,332-5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187-0,683
0,002
IκB-α
0,779
0,524 iki 1,311
0,423 pervežimas p-IκB-alfa
1,857
1,256 iki 2.912
0,003
prognostinis reikšmė MT2A kartu su TNM etape GC pacientų
toliau išsiaiškinti MT2A išraišką prognostinės reikšmės, mes kartu MT2A išraišką su klinikos funkcijų GC. Buvo siekiama įvertinti GC pacientams, sergantiems patologinės klasifikavimo prognozę, ir ištirti, ar patologinis klasifikavimas turėtų būti toliau subrangos klasifikuoti tikslesnis prognozavimas rezultatus. Kaip parodyta Papildoma failas1: Lentelė S4, MT2A išraiška GC buvo susijęs su TNM etape ir naviko diferenciacijos, o tai reiškia, kad MT2A gali būti potencialus molekulinės biologinis prognozuoti patologinę klasifikavimo GC. Kaip dichotomiško kintami dydžiai, tiek MT2A ir TNM stadija buvo nepriklausomi faktoriai dėl išlikimo (2 lentelė, 2A ir B pav.) Prognostinė reikšmė MT2A išraiška buvo toliau nagrinėjama GC pacientams pagal pTNM klasifikavimo sistemą. Gerokai bendrajam išgyvenamumui skirtumo tarp pacientų, sergančių MT2A išraiškos tiek anksti (I ir II) ir Advanced (III ir IV) scenos grupių (p
= 0,048 ir p
< 0,001, atitinkamai; 2C pav ir D). Be to, MT2A išraiška statusas taip pat buvo veiksmingas tokiomis pačiomis etapais prognozės (P
= 0,052, 2E pav; P
< 0,001, 2F pav; P
< 0,001, 2G ir P pav
< 0,001, 2H pav). Šie duomenys apima, kad MT2A yra molekulinės parašas klinikinei baigčiai numatyti remiantis TNM etape.
Restauravimas MT2A raiškos rezultatams augimo slopinimo GC ląstelių in vitro ir in vivo

Atskleisti mechanizmą iš MT2A GC, mes stabiliai perkeltų MT2A per išreiškė plazmidės ir tušti vektorių į tris GC ląstelių linijas (BGC823, SGC7901 ir AGS). Mes išnagrinėjo augimą, apoptozę normas ir ląstelių ciklą šių ląstelių linijų transfektuotose MT2A plazmidės. Ląstelių gyvybingumas buvo sumažintas GC ląstelių vėl išreikšti MT2A naudojant MTT (BGC823, p
= 0,0038, pav 3B; AGS, p
= 0,0007, Papildoma failas1: S3A pav; SGC7901 P
= 0,0004 , Papildoma failas1: išsiaiškinti S3C). Toliau tirti MT2A GC ląstelių linijų funkciją, mes analizavo MT2A raiškos poveikį ląstelių proliferaciją ir ląstelės ciklo reglamento aneksinas-V /PI dažymo ir tėkmės citometrijos analizė. Daugiau apoptozę buvo aptikta šių GC ląstelių iš naujo išreiškiančias, iš MT2A (P
< 0,01, atitinkamai, 3F pav; Papildoma failas1: S3A ir C pav). Be to, G2 /M suėmimas buvo pastebėtas GC ląstelių naudojant negimdinis išraišką MT2A. G2 santykis /M etapas MT2A grupių buvo dvigubai didesnis nei vektoriaus grupių padarė (p
< 0,01, atitinkamai, 3E pav ir Papildoma failas1: S3B ir D pav.) 3 pav negimdinis išraiška MT2A slopina GC ląstelių augimą in vitro ir in vivo. MT2A slopina ląstelių proliferaciją ir kolonijų susidarymą žmogaus GC ląsteles. A Vakarų dėmė iš MT2A buvo aptiktas BGC823 ląstelių transfektuotose negimdinio išraiška MT2A plazmidžių ir tušti vektorių. Į MT2A baltymų juostos buvo nuskaitomi (standartizuoti beta-aktino kontroliuoti pakrovimo). B ląstelių proliferacija buvo analizuojamos MTT IN RE ekspresija MT2A iš BGC823 ląstelių, ar ne. Duomenys buvo parodyta kaip vidurkis ± .sd trijų nepriklausomų eksperimentų. C augimas BGC823 ląstelių buvo analizuojamas pusiau kietas minkšta agaro terpėje. Tuščios vektorinės kolonijos susidaro statistiškai reikšmingai daugiau kolonijos (vidurkis = 426 didelių kolonijų vienam 95% KĮ plokštė. 387-472 kolonijų) nei MT2A klonų (vidurkis = 136 kolonijas 95% NVS:.. 100-164 kolonijas Numeriai atstovauti vidurkis kolonijų skaičius iš trijų nepriklausomų eksperimentų ± SD santykinis skaičius buvo apskaičiuotas per kontrolės ir BGC823-MT2A ląstelių ir analizuojami naudojant Stjudento t
-test (p
= 0,0038). d MT2A-slopino tumorogeniškumo iš BGC823 ląstelių . nuogas pelių vidurkis auglio apimtis BGC823-MT2A ne 3 savaites po injekcijos buvo 112 mm3 (95% NVS: 93-147 mm3), lyginant su 352 mm3 (95% NVS: 298-423 mm3), už BGC823-vektorius. duomenų atstovauti vidurkis ± SD naviko tūrio, gautų iš kiekvienos grupės. iš kiekvienos grupės, naviko dydis buvo matuojamas slankmačiu ne nurodytu laiku kiekis. duomenys buvo parodyta, kaip vidurkis ± SD (T-
bandymo aptikti, p
= 0,0027) E FACS analizė parodė, kad MT2A per išraiška lėmė G2 /M suėmimo, ir G2 santykis /M etapas buvo didesnis nei tuščių kontrolės ir tėvų ląstelių (p <
0,01). F priešvėžiniai poveikis MT2A buvo aptikta aneksinu /FITC PI dažymo metodu. Procentas apoptozinių ląstelių buvo 52,9% ± 5,4% MT2A grupėje, palyginti su ta, kurią tėvų ląstelių (8,3% ± 2,4% ir ląstelių perkeltų su tuščiu vektoriaus (8,2% ± 3,7%, p pervežimas. ≪ 0,001)
be to, mes padengtą BGC823 ląsteles represuoti MT2A ar ne į minkštą agaro, negimdinis išraiška MT2A buvo patvirtinta Vakarų dėmė analizės pirmą (3a pav.) Po 3 savaičių kultūra MT2A išraiška sukėlė statistiškai reikšmingai sumažėjo kolonijos formavimo (p
= 0,0053, Fig.3C). Be to, ten buvo dramatiška augimo slopinimas MT2A-RE-išreikšti ląsteles, lyginant su neigiamos kontrolės (P
= 0,0027, 3D paveikslą) ksenografiniuose modelių. Šie duomenys rodo, kad MT2A gali vaidinti svarbų vaidmenį slopinant proliferaciją GC ląstelėse in vitro ir in vivo

.
MT2A malšina NF-κB veiklą per IκB-alfa iki reguliavimą
buvo pranešta, kad MT2A praradimas sukeltų NF-κB signalas aktyvavimo transgenetic peles modelis (MT2A-knock out) [15]. Bet MT2A draugauti ar priešas į NF-κB signalo kelyje vaidmuo vis dar buvo prieštaringa [18, 33]. Siekiant išaiškinti, kad MT2A tarpininkaujant GC ląstelių augimo slopinimo in vivo parsisiųsti ir in vitro
mechanizmą, mes bandėme ištirti galimą ryšį tarp MT2A ir NF-κB signalizacijos kelią, ir vidinis mechanizmas vis dar buvo neaišku GC , MT2A ir pagrindinės genų NF-κB signalizacijos, pavyzdžiui, 65 psl, IκB-alfa, p-IκB-alfa ir tolesnio vykdymo elemento NF-κB signalizacijos, cikloniniai D1 buvo aptikta šiame tyrime (Papildoma failas1). Negimdinis išraiška MT2A sukeltas tiek iRNR ir baltymų ekspresija IκB-alfa visų tirtų GC ląstelių linijas (BGC823, SGC7901 ir AGS), IκB-α iRNR pusiausvyrinė koncentracija padidėjo 5,5 karto ir BGC823 ląstelių pakartotinai išreikšti MT2A 48 val. Be AGS ir SGC7901 ląsteles, mes nustatėme 7,2 karto ir 4,3 karto indukciją IκB-alfa mRNR (4a pav), santykiniai baltymo koncentracija atitiko mRNR nuorašai, o P-IκB-α baltymo sumažėjo tose GC ląstelės perkeltų MT2A vektorių (4b pav.) Kaip parodyta Fig 4C ir D, nokdaunas endogeninio MT2A į GES1 ląstelių lėmė žemyn reguliavimo IκB-alfa išraiška, taip pat iki reguliavimą p-IκB-alfa ir cikloniniai D1 raiškos, rodančių ryšį tarp MT2A veiklos ir IκB -α išraiška. Šie eksperimentai rodo, kad MT2A skatina IκB-alfa išraišką mRNR ir baltymų koncentracijos. Ir MT2A tarpininkaujant iki-reguliavimo IκB-alfa išraiška buvo dar kartą patvirtino imr.rnofluorescencija (pav 5A, Papildoma failas1). Paaiškinti MT2A mechanizmą IκB-alfa išraiška, mes atliekame liuciferazės reporteris tyrimus, atliekamus pagal restruktūrizavimo IκB-alfa promotoriaus regione, 5,6 karto UP-reguliavimą IκB-alfa rengėjas liuciferazės veiklos buvo rastas MT2A grupėje, nei kad vektorių grupės ( Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Išraiškos COX-2 ir VEGF-C skrandžio vėžiu: koreliacijos su limfangiogenezės ir prognostinė implications
• Downregulation SPARC išraiška mažėja skrandžio vėžio ląstelių invazija ir survival