Metallotionein 2A gátolja az NF-kB útvonal aktiválása és megjósolja a klinikai eredmény szegregált a TNM a gyomorrákos betegek következő radikális resection

metallotionein 2A gátolja az NF-kB útvonal aktiválása és megjósolja a klinikai eredmény szegregált a TNM a gyomorrákos betegek következő reszekcióra katalógusa Abstract
alapon
metallotionein 2A (MT2A), mint a stressz protein, játszik védő szerepet gyomornyálkahártya gáton. Szerepe a fejlesztés a gyomorrák (GC) nem világos. A mechanizmus a MT2A fogják vizsgálni a gyomor tumorigenezis.
Módszerek
MT2A expresszió kimutatható volt a 973 gyomor példányok. A biológiai funkciót meghatározni méhen kívüli kifejező MT2A in vitro és in vivo katalógusa katalógusa. Az esetleges későbbi effektorait MT2A vizsgálták NF-kB jelátvitel. A fehérje szintje MT2A, IκB-α és p-IκB-α (ser32 /36) expressziós analizáltunk egy részhalmaza 258 betegek IHC festést. A prognosztikai hatását MT2A, állapotát IκB-α és TNM értékeltük a Kaplan-Meier-módszerrel, és összehasonlítottuk a log-rank teszt. Katalógusa Eredmények katalógusa Csökkent MT2A expressziót detektáltunk sejtvonalak és primer daganatai GC. A klinikai adatok elvesztése MT2A (MT2A + Normal (n = 171, 76,0%); intestinalis metaplasia (n = 118, 50,8%); GC (n = 684. 22.4%, P katalógusa < 0,001)) társult rossz prognózissal (P katalógusa < 0,001), a fejlett TNM (P katalógusa = 0,05), és a down-regulációja IκB-α expressziója (P katalógusa < 0,001). Továbbá MT2A volt a független prognosztikai aláírás elkülönítették a státuszát IκB-α és patológiai jellemzői. Ezen túlmenően, MT2A gátolta a sejtnövekedést keresztül apoptózis és G2 /M roham, amely negatívan szabályozott NF-kB út keresztül up-regulációját IκB-α és down-regulációja p-IκB-α és a ciklin D1 expressziója.
Következtetések
MT2A játszhat tumor elnyomó aktivitás gátlása útján NF-kB jelátvitel és lehet prognosztikai biomarker és potenciális célpontja egyéni terápia GC betegek. katalógusa Kulcsszavak katalógusa metallotionein 2A NF-kB jelző Gyomorrák prognózisa TNM háttér
újdonságai katalógusa rengeteg metallotionein 2A (MT2A) kiállítása a gyomor nyálkahártyán, de a szerepe a progresszió gyomorrák (GC) még nem tisztázott. Ebben az elemzésben a 171 normál gyomor szövetek, 118 intestinalis metaplasia, és 684 primer gyomorrák, csökkent MT2A szignifikáns korrelációt mutatott rossz prognózisú. Ez gátolja a szaporodását GC sejtek az NF-kB jelátvitel inaktiválása. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy MT2A lehet fontos prognosztikai és terápiás célpont GC.
Gyomorrák (GC) a leggyakrabban diagnosztizált rosszindulatú daganat, és továbbra is jelentős a rák Ázsiában, különösen Kínában [1, 2]. A legtöbb GC műtéten átesett betegek már előrehaladott stádiumban, és az 5 éves túlélés változatos. Számos hisztológiai faktorok számoltak hogy prognosztikai tényezők GC, beleértve a tumor mérete, a WHO besorolása, a tumor-node-metasztázis (TNM) szakaszban rendszer, és a differenciálódás grade [3, 4]. Azonban prognózisa GC betegek ugyanabban a fázisban még mindig ellentmondásos [5]. Ezért, az azonosítás a specifikus diagnosztikai markerek és terápiás célpont lehetővé tenné megbízható előrejelzését, hatékony kiterjesztése posztoperatív túlélés és az élet minőségének a betegek [6].
Celluláris stressz kimutatták, hogy szerepet játszik a molekuláris szabályozásában karcinogenezis [7, 8]. A metallotioneinek (MT-k), mint a stressz fehérjék alacsony molekulasúlyú és gazdag-cisztein képesek a nagy affinitást mutatnak a fémionok és a ROS gyökfogók. MT2A, mint a fő izoforma metallothionein fontos szerepet játszik a gyomor nyálkahártya barrier betegeknél gastritis és rágcsáló modellek [9, 10]. Pre-exogén MT2A vagy előre indukcióját endogén MT2A tudja védeni a gyomor és a máj ellen stressz által kiváltott károsodás és gátolja a kialakulását a stressz által kiváltott lipid-peroxid, ami egy védő hatását MT2A a stressz által kiváltott patogenezisében és potenciális terápiás célpont alkalmazott korai megelőzés [11] - [13]. Nemrégiben MT2A fontos szerepet játszik a tumorigenezisben és progressziójában többszörös karcinómák beleértve GC [14]. Az egerek elvesztése MT2A gén hajlamos diethylnitrosamine indukált hepatocarcinogenesis aktiválásával NF-kB célgének, ami azt bizonyítja, hogy MT2A megvédi az egereket az hepatocarcinogen-indukált máj károsodás és karcinogenezis, kiemelve annak potenciális terápiás alkalmazását ellen hepatocelluláris rák [15]. Egyes vizsgálatok középpontjában a szerepe MT2A elleni védelemben H. pylori katalógusa indukált gyomor sérülés segítségével MT-null egerekben. Himeno, S. felfedezték, hogy a NF-kB és kifejezése az NF-kB-mediált kemokinek gyomor sejtek jelentősen magasabb MT2A-null egerekben, mint a széles-típusú egerekben [9]. Ezek az adatok arra utalnak, hogy MT2A valósítja negatív kontrollként a transzkripciós faktor NF-kB aktivitását, de a szerepe a gyomor karcinogenezis egyelőre bizonytalan [16] - [18].
Aberráns NF-kB kapcsolatban áll a sejt gyulladás, malignitás , és a tumor progresszióját [7, 19]. A funkcionális aktivitását az NF-kB gátolt keresztül való kötődését gátló, IκB-α. NF-kB is eredményezett proteaszóma által közvetített lebomlási IκB-α által foszforilációja az inhibitort (p-IκB-α), amely azt sugallja, hogy az NF-kB útvonal egy potenciális célpontja egyéni terápia [20] - [23] .
néhány bizonyíték jelzi, hogy a megnövekedett MT2A expressziója fontos a rák progressziójának, és MT2A kezdetben javasolt egy proto-onkogén az emlő, a nyelőcső, a prosztata és a petefészek rákos megbetegedések, társított rosszindulatúság és rossz prognózissal [24] - [27 ]. Ezzel szemben ez a lefelé szabályozni a gastrointestinalis tumorok és hepatocellularis carcinoma, ahol MT2A van vagy fordítottan arányos vagy nem kapcsolódó mortalitás [28, 29]. Azonban a variációs MT2A és annak klinikai értékelés marad ellentmondásos GC [28, 30, 31]. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy szabályozási zavarának MT2A részt vesz a tumor patogenezisében, bár a pontos szerepe még nem tisztázott GC.
Ezért, mi koncentrált, hogy felfedje a ko-expressziója MT2A és IκB-α gén korrelált a klinikai patológiai jellemzői és eredmények egy nagy léptékű gasztrikus tumorok hosszú távú utánkövetés adatokat. Továbbá szisztematikusan elemezte a szerepe MT2A mint stressz fehérjék és negatív szabályozója NF-kB aktiválás jellemzése érdekében a biológiai szerepe és molekuláris mechanizmusa in vitro és in vivo katalógusa katalógusa.
Módszerek katalógusa Betegjellemzők
Gyomor tumor mintákban 684 GC kezelt betegek Peking Cancer Kórház 1997-2007 értékelték. A beteget vontak 513 férfi (75,0%) és 171 nő (25,0%), az átlagos életkor a diagnózis 54 éves (tartomány 19-81 év). A követési idő alatt mozgott 1-127,2 hónap (medián 34,2 hónap). Minden betegnél reszekcióra kuratív. Egyik beteg kapott neoadjuváns kemoterápia vagy sugárkezelés a műtét előtt. A felvétel kritériumai összes beteg: (a) a megkülönböztető GC diagnózis alapján a hatodik alkalommal a tumor-node-metasztázis (TNM) besorolását a Nemzetközi Unió ellen GC, (b) a radikális reszekció, (c) megfelelő formalin fixált, paraffinba ágyazott szövetekben. Az összesen 684 GC volt klinikopatológiai adatok (nevezik a "kohorsz"). Sőt, egy sor 258 támogatható gyűjtöttünk a kohorsz 10 éves követési adatokat (nevezik a "részhalmaza"). A klinikai eredmény a beteg került rögzítésre napjától műtét a halál időpontját. Ezen túlmenően, a 118 intesztinális metaplázia (IM), és 171 normál gyomor szöveteket gyűjtöttünk ezeket GC betegeknél. A szövettani vizsgálatot végeztünk három vezető patológusok. A demográfiai megoszlása ​​kohorsz és részhalmaza szerepel Kiegészítő 1. táblázatban mellett, 36 párosított gyomor tumorok szomszédos normál szövetekben porrá folyékony nitrogénben RT-PCR és valós idejű PCR MT izoformák (Plusz áll_1). 1. táblázat a logisztikus regressziós analízis a klinikopatológiai jellemzők és a prognózis GC katalógusa Variates Matton No. Az esetek (n = 258) Matton Túlélési idő (hónap)
P katalógusa -érték Matton szex katalógusa Férfi katalógusa 186
66,4 ± 4,6 fiatal női katalógusa 72 katalógusa 54,1 ± 4,8 katalógusa 0.604 katalógusa életkor diagnózis katalógusa < 60 katalógusa 173 katalógusa 65,0 ± 4,9 katalógusa ≥60
85 katalógusa 59,2 ± 5,6 katalógusa 0,867 katalógusa TNM katalógusa I
34 katalógusa 105,5 ± 7,7 katalógusa I vs. IV katalógusa < 0.001 katalógusa II
57 katalógusa 74,0 ± 5,9 katalógusa II vs. IV katalógusa < 0.001 katalógusa III
115 katalógusa 49,1 ± 3,4 katalógusa III vs. IV
0.010 katalógusa IV katalógusa 52 katalógusa 35,8 ± 4,1 katalógusa tumor mélységi katalógusa pT1
13 katalógusa 87,2 ± 9,9 katalógusa pT1 vs. pT4 katalógusa 0.005 katalógusa pT2 katalógusa 50 katalógusa 89,1 ± 9,1 katalógusa pT2 vs. pT4 katalógusa < 0.001 katalógusa pT3
157 katalógusa 49,1 ± 2,9 katalógusa pT3 vs. pT4 katalógusa 0,159 katalógusa pT4 katalógusa 38 katalógusa 40,1 ± 5,3 katalógusa nyirokcsomóstátus katalógusa pN0 katalógusa 78
89,8 ± 6,2 katalógusa pN0 vs. PN3 katalógusa 0.001 katalógusa pN1 katalógusa 115 katalógusa 50,5 ± 3,4 katalógusa pN1 vs. PN3 katalógusa 0,212 katalógusa pN2 katalógusa 49
46,6 ± 6,0 katalógusa pN2 vs. PN3 katalógusa 0,326 katalógusa PN3 katalógusa 16 katalógusa 47,5 ± 12,6 katalógusa távoli áttét katalógusa pM0 katalógusa 232
67,5 ± 4,3 katalógusa PM1
26 katalógusa 27,6 ± 5,8 katalógusa < 0.001 katalógusa mértékű megkülönböztetést katalógusa D1
54 katalógusa 76,0 ± 6,0 katalógusa D0 katalógusa 204 katalógusa 59,8 ± 4,4 katalógusa 0.011 katalógusa MT2A kifejezés katalógusa < 0.001 katalógusa alacsony katalógusa 202 katalógusa 53,9 ± 3,4 katalógusa magas katalógusa 56 katalógusa 86,9 ± 9,2 katalógusa IκB-α kifejezés katalógusa alacsony katalógusa 164 katalógusa 61,6 ± 4,9
magas katalógusa 94 katalógusa 64,9 ± 5,1 katalógusa 0.248 katalógusa p-IκB-α kifejezés katalógusa alacsony katalógusa 126 katalógusa 74,1 ± 5,3 katalógusa magas katalógusa 132
47,7 ± 3,4 katalógusa 0,005 katalógusa M0: nincs távoli áttét; M1: távoli metasztázis katalógusa D1: jól /közepesen differenciált GCS; D0: rosszul differenciált GC.
Immunhisztokémiai analízis
IHC festést szöveti tömb végeztünk MT2A antitesttel (1: 100 hígításban; 18-0133, Invitrogen, CA, US), p-IκB-α antitesttel (1 : 200 hígítás; ab47752, ABCAM, Cambridge, Egyesült Királyság), IκB-α antitesttel (1: 300 hígításban; SC-371, santa Cruz Biotechnology, CA). Minden biomarker, képek vizuálisan három patológusok, akik nem ismerték a klinikai kimenetelt. Eltérések voltak megoldani konszenzus. A pontszámokat rendelt százalékában pozitív festődés belül minden henger. Az átlagos százalékos értéket a két mag számítottuk, hogy képviselje egy daganat (További áll_1). Katalógusa sejtvonalak
Gyomorrák sejtvonalak BGC823, MGC803, SGC7901 és PAMC82 alakult Kínában és vásárolt a szöveti partján Shanghai (Sanghaj, Kína). Különösen, BGC823 sejteknél magas tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 és SNU-16 sejtvonalakat vásárolt ATCC-től (American Type Culture Collection, Manassas, US). GES-1, egy immortalizált humán gyomornyálkahártya sejtvonal által generált SV40 virális transzfekció pekingi Rák Kórház és tenyésztjük DMEM táptalajban, amely 10% magzati borjúszérummal (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 37 ° C hőmérsékleten, párásított atmoszférában, amely 5% CO 2 [32].
MTT és lágy agar vizsgálat katalógusa a sejteket oltottunk 96 lyukú lemezeken, és MTT-t adtunk a sejtekhez 1-5 napok. MTT-t (5 ng /ml) után eltávolítjuk 4 óra inkubálás, majd a dimetil-szulfoxid (DMSO) adunk a szolubilizáljuk a formazán termék. Az abszorpcióképességet 490 nm-nél /570 nm-en mértük egy mikrotiterlemez-leolvasó (Bio-rad680 ELISA). A sejteket ezután 4 héten, megfestettük vitális tetrazolium festék INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen), hogy dokumentálja a jelenléte vagy hiánya az életképes sejt kolóniákat. A lágy agar rögzítették 100 ul metanol-ecetsav (3: 1 térfogat /térfogat), és a telepeket megszámoltuk.
Tumorképző assay
BGC823 sejteket (5 x 10 5 sejt szuszpendáljuk 0,1 ml PBS-ben) transzfektált MT2A túlexpresszált vektort vagy üres vektorral szubkután fecskendeztünk a dorzális horpasz öt 4-hetes nőstény Balb /c csupasz egereket (MT2A-expressziós klónok a jobb és a vektor kontroll klónok a bal oldalon. a tumor átmérőjét mértük és dokumentált minden 5. napon. a tumor térfogatát kiszámítottuk az alábbi képlet szerint AB 2/2 (a > b). végén a 25 nap, az egereket leöljük, és a tumor térfogatát mérjük. Három független kísérletet végezni, és adta a hasonló eredményt. az állatokat tartani létesítmények által jóváhagyott szövetség és akkreditációs Laboratóriumi Animal Care szerint a jelenlegi szabályozás és a nemzetközi szabványoknak. katalógusa Statisztikai analízis katalógusa χ katalógusa 2 teszt statisztika és Student-féle t katalógusa -teszt is összehasonlítására használják előkezelés jellemzőit beteg esetek. A rákkal kapcsolatos túlélési elemeztük a Kaplan-Meier-módszerrel, és összehasonlítottuk a log-rank teszt. A Spearman rank teszt és Fisher-féle egzakt tesztet alkalmaztunk bizonyítani klinikopatológiai összefüggéseket. A Cox regressziós modellt alkalmaztunk a kapcsolódó 95% -os konfidencia intervallum (CI) és P katalógusa értékeket. Minden statisztikai tesztek kétoldalas, és a P katalógusa értéke kisebb, mint 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. A statisztikai analízist az SPSS statisztikai programcsomag (Version 16.0; SPSS Inc., Chicago, IL). Katalógusa Study jóváhagyás
Összes állatkísérletek hagyta jóvá az etikai bizottság a pekingi egyetem Cancer Kórház. Az emberi szövetek és klinikai adatok szerint az iránymutatások a kórházba, és jóváhagyta a helyi etikai bizottság. Katalógusa Eredmények katalógusa Csökkent MT2A kifejezés egy molekuláris esemény sejtvonalak és primer tumorok GC katalógusa Expression a MT2A értékeltük RT-PCR és Western blot egy panel GC sejtvonalak és GES1, amely szolgált "normál kontroll". Amint az 1A ábrán látható, MT2A mRNS lényegesen változik, a legmagasabb szintek GES1. Hiánya vagy csökkenése MT2A expresszió volt megfigyelhető BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 és N87 sejteket. A fehérje szintje MT2A kifejeződését kimutatható a hat közös használt GC sejtvonalak (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, és MKN45) képest GES1. Western-blot analízis azt mutatta, hogy a hat általánosan használt GC sejtvonalak, a szintek MT2A expresszió volt jelen, vagy alacsony összehasonlítva GES1, összhangban mRNS expressziója kimutatható fenti (1b ábra). Különösen, BGC823, MGC803 és SGC7901 sejtek hiánya MT2A kifejezés nagyhozzáadott tumorigenecity csupasz egerekben. Az 1. ábra a csökkent vagy hiányzó expresszióját MT2A észlelt sejtvonalakban és primer tumorokban a GC. A, MT2A mRNS szintje mértük RT-PCR GC sejtvonalakban, és a szokásos halhatatlan sejtvonal-GES1. És félig számszerűsítésére elemzéseket végeztünk ImageTool 3,0 szürkeárnyalatos beolvasás szoftver (normalizált p-aktin szint). A kísérletet három párhuzamossal végzünk. B, MT2A fehérje szinten határoztuk meg Western-blot-analízis GC sejtvonalakban, és a szokásos halhatatlan sejtvonal-GES1. A MT2A fehérje sávokat szkennelt (normalizált béta-aktin szint). C, A differenciális expressziója MT2A mRNS transzkriptum 36 párosított GC szövetek és szomszédos normál szövetekben. A MT2A mRNS sávokat szkennelt (normalizált béta-aktin szint). D, MT2A protein szinteket detektáltunk a 36 párosított GC szövetekben Western-blottal. A MT2A fehérje sávokat szkennelt (normalizált béta-aktin szint). E Csökkent MT2A során megfigyelt gyomor malignus transzformáció. (A) intenzív festése MT2A a normál szövetekben, (b) közepesen festése MT2A IM szövetekben, (c) gyenge festése MT2A mérsékelten differenciált primer gyomor rák és (d) a negatív kifejezése MT2A gyengén differenciált GC (eredeti nagyítás × 400). (D), mint a normál és rákmegelőző elváltozások-IM minták csökkent MT2A volt közös molekuláris esemény gyomor karcinogenezis (P katalógusa < 0,001) F: Differential kifejezése MT2A GC, IM és a normális szövetek IHC-festéssel. Negatív: 0 pont; Gyenge: pontszám 1-4; Erős: pontszám 5-12. A részleteket lásd az Egyéb áll_1. Katalógusa 36 primer tumorok GC szomszédos normális szövetek is vizsgálták 1C és D, az eredmények megerősítésére származó GC sejtvonalak csökkent MT2A mRNS volt látható GC azokhoz képest, illesztett normál kontrollok (27/36, 75,0%, P katalógusa < 0,001, 1C). Alacsony expresszióját MT2A detektáltunk fehérjét 29 36-ból GC esetben (80,6%), mint az egyező normális szövetekben (p
< 0,001, 1D ábra). Az mRNS szintje MT2A korrelált a fehérje szinten detektáltuk Western-blot (R = 0,510, p
= 0,009). Emberben az MTS által kódolt gének családját, amely 10 funkcionális MT izoformák és a kódolt fehérjék hagyományosan négy alcsoportból, MT1, MT2, MT3 és MT4 fehérjéket. Mivel a kódoló régiói MT izoformok nagymértékben konzerváltak a transzkriptum és fehérje szinten, MT2A nagymértékben homológ MT1G, MT1E és MT1F (Plusz fájl 1: ábra S1B). Ezért kísérletek bármely egyedi izoforma gondosan kell végezni annak biztosítására, hogy a pontos izoforma elemezzük. Ebben a vizsgálatban, differenciális expressziója MT1 transzkriptumok volt megfigyelhető GC sejtvonalakban és primer tumorokban a GC a szomszédos normál kontrollok (n = 36) (Plusz fájl 1: ábrákon S1A és S2). Mi hitelesített tényleges MT2A gén leszabályozza a GC képest jelentősen szomszédos normál szövetben (27/36, 75%, 1C). Nem volt különbség a MT1E és MT1F és MT1G mRNS normál és tumoros mintákban, valamint MT1B mRNS nem volt kimutatható az összes sejtek és szövetek (Plusz fájl 1: ábrák S1A és S2).
Vizsgálni jelölését a MT2A a gyomor tumorogenezisben, kezdetben jellemezte a helyzetét MT2A expresszió 171 normál szövetekben, 118 IM 684 GC minták IHC-festéssel. Az antitest MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) nem specifikus MT-2A csak, és keresztreakcióba lép az MT-1 bizonyos mértékben, akkor is, ha a klónozott, amit a teljes hosszúságú MT2A. Mivel nincs specifikus ellenanyag kimutatására MT2A, így használjuk a közös kereskedelmi antitest IHC-festéssel, amely megjelent a legtöbb kapcsolódó tanulmányok, MT2A kifejezés besorolása alacsony és magas expressziót normális megjelenés szövetekben, IM, és az elsődleges GC. Magas szintű MT2A expresszió kimutatható volt a 153 684 (22,4%) GC esetek, és 60 118 (50,8%) IM esetek, valamint a 130 171 (76,0%) normális megjelenés esetben volt (Plusz fájl1: Táblázat S3 , p
< 0,001), ez volt állt a MT2A mRNS és fehérje expresszióját Western-blottal. A kifejezés a MT2A minősítették negatív, gyenge és erős esetek 13 (7,6%), 28 (16,4%) és 130 (76,0%) ki 171 normál szövetekben, illetve; IM szövetekben, 27 (22,9%), 31 (26,3%) és 60 (50,8%) 118-ból IM esetet derítettek volt; GC minták, 494 (72,2%), 37 (5,4%) és 153 (22,4%) ki 684 GC esetet derítettek volt (ábra 1F További áll_1). Volt egy fokozatosan csökkent expressziója MT2A fehérje IM és GC (P katalógusa < 0,001, ábra 1E és F). Egyértelmű, hogy a MT2A mRNS-t erősen kifejezett GES1 sejtekben és a normál szövetek, de csökken vagy elvész a legtöbb GC sejteket és szöveteket. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a csökkent MT2A egy molekuláris esemény tumorigenezis és progresszióját.
MT2A expresszió korrelációban van rossz prognózissal GC
MT2A volt gyakran alulszabályozott GC. Ahhoz, hogy vizsgálja meg, hogy MT2A expresszió prognosztikai tényező az emberi GC, MT2A fehérje expresszióját vizsgáltuk a részhalmaza az IHC-festéssel. Az egyes mintákat minősíteni alacsony (MT2A-) vagy magas kifejezés (MT2A +). MT2A- társult az általában gyenge túléléssel (2A ábra, p
< 0,001). Egyváltozós elemzés azt mutatta, hogy bizonyos tényezők, köztük csökkent MT2A kifejezés (P katalógusa < 0,001), TNM (P katalógusa < 0,01), a tumor mélységi (P katalógusa < 0,05), nyirokcsomó státusz (P
< 0,05), a távoli áttétek (P katalógusa < 0,001) és mértékű megkülönböztetést (P = 0,011 katalógusa) korrelált a rossz túlélést (1. táblázat). Cox többváltozós elemzés azt mutatta, hogy a teljes túlélés társult MT2A kifejezés (MT2A + versus MT2A- hazárd [HR] 0,429; 95% CI, 0,187-0,683; p = 0,002 katalógusa, 2. táblázat). Megbecsültük a potenciális klinikai jelentősége MT2A összekapcsolásával az expressziós mintázat a klinikai paraméterek (Plusz áll_1 táblázat S4). MT2A mutatott kiterjedt pozitív korrelációt tumor differenciálás (P katalógusa < 0,001) és inverz korrelációt TNM (P katalógusa = 0,05). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy MT2A korrelál a klinikai patológiai jellemzői és a túlélés GC betegeknél. 2. ábra elemzése kombinált MT2A a TNM megjósolni klinikai kimenetellel GC. Kaplan-Meier analízis A teljes-túlélés MT2A expresszió szerint alkalmazott TNM-beosztása. Egy, prognosztikai értéke MT2A expresszió GC betegek javára előrejelzésére terápiás eredményeit, alacsony kifejeződése MT2A járt szegény teljes túlélést (p < katalógusa 0,01); B, TNM volt előny a prognosztikus becslés GC betegeknél. C D, prognosztikai értéke MT2A a TNM I-II és III-IV stádium (P = 0.048 katalógusa, P < katalógusa 0,001); E F, prognosztikai MT2A expresszió nyirokcsomó-metasztázis, vagy nem (p
< 0,001, p
= 0,052, sorrendben); G. prognosztikai értéke MT2A kifejezés nincs távoli áttét alcsoportban (n = 232, P katalógusa < 0,001); H. prognosztikai értéke MT2A a pT3-pT4 alcsoport (P katalógusa < 0,001). Minden adat azt jelenti, hogy MT2A lehet hatékony prognosztikai aláírás. Katalógusa 2. táblázat Cox regressziós elemzést klinikopatológiai jellemzők és molekuláris aláírások GC
többváltozós elemzés Matton kovariáns által végpont katalógusa
hazárd
95% CI Matton P- katalógusa érték Matton Kor ≥ 60 év katalógusa 1,300 katalógusa 0,840-1,934 katalógusa 0,254
Sex
0.823 katalógusa 0,499-1,233 katalógusa 0.292 katalógusa differenciálás
0.753 katalógusa 0,509-1,778 katalógusa 0.875 katalógusa tumor invazív mélység katalógusa 1,914 katalógusa 1.389 hogy 2,638 katalógusa < 0.001 katalógusa nyirokcsomóstátusz katalógusa 1,291 katalógusa 1,034-1,612 katalógusa 0,024 katalógusa távoli áttét katalógusa 2,595 katalógusa 1,332-5,056 katalógusa 0,005 katalógusa MT2A katalógusa 0,429
0,187-0,683 katalógusa 0,002 katalógusa IκB-α katalógusa 0,779 katalógusa 0,524-1,311 katalógusa 0,423 katalógusa p-IκB-α katalógusa 1.857 katalógusa 1,256-2,912 katalógusa 0,003
prognosztikai jelentősége MT2A együtt TNM GC betegek katalógusa további tisztázására MT2A kifejezést prognosztikai, ötvöztük MT2A kifejezés a klinikopatológiai jellemzők GC. A cél az volt, hogy értékelje a prognózist GC betegek kóros besorolását, valamint annak vizsgálatára, hogy a kóros besorolás tovább kell al-besorolás pontosabb előrejelzése kimenetelét. Amint azt a kiegészítő fájl1: Táblázat S4, MT2A kifejezést GC járt TNM és tumor differenciálás, utalva arra, hogy MT2A lehet potenciális molekuláris biomarker megjósolni kóros besorolás GC. Ahogy dichotóm változót, mind MT2A és TNM voltak befolyásoló független túlélés (2. táblázat, ábra a 2A és B). Prognosztikai jelentősége MT2A expresszióját tovább elemeztük GC betegek szerint a pTNM osztályozási rendszert. Szignifikáns különbség a teljes túlélés közötti betegek MT2A kifejezést mind a korai (I és II) és haladó (III és IV) szakasz csoportban (p = 0.048 katalógusa és P katalógusa < 0,001; 2C ábra és D). Sőt, MT2A expressziós státus hatásos volt a prognózis ugyanazon szakaszában (P = 0,052 katalógusa ábra 2E; P katalógusa < 0,001, ábra 2F; P katalógusa < 0,001, ábra 2G és P
< 0,001, 2H ábra). Ezek az adatok azt jelentik, hogy MT2A egy molekuláris aláírás megjósolni a klinikai eredmény alapján TNM. Katalógusa helyreállítása MT2A kifejezés eredménye a növekedés elnyomása GC sejtek in vitro és in vivo katalógusa Matton feltárásához mechanizmus a MT2A GC, azt stabilan transzfektált MT2A overexpresszált plazmid és az üres vektor három GC sejtvonal (BGC823, SGC7901 és AGS). Megvizsgáltuk a növekedés, az apoptózis aránya és a sejtciklus ezen sejtvonalak transzfektált MT2A plazmidba. A sejtek életképességét csökkent GC sejtek újra kifejező MT2A MTT assay (BGC823, P katalógusa = 0,0038, 3B, AGS, P katalógusa = 0,0007, További áll_1 ábra S3A; SGC7901, P katalógusa = 0,0004 , További áll_1: ábra S3C). Ahhoz, hogy tovább vizsgáljuk a funkciója MT2A GC sejtvonalakban, elemeztük a hatását MT2A kifejezés a sejtproliferációra és sejtciklus-szabályozás által Annexin-V /PI festéssel és áramlási citometriás analízis. Több apoptózist detektáltunk ezeket GC sejteket újra expresszáló MT2A (p
< 0,01, illetve ábra 3F, további fájl1: ábra S3A és C). Továbbá, a G2 /M letartóztatás volt megfigyelhető GC sejtekben ektópiás expressziója MT2A. Az arányok G2 /M fázisban MT2A csoportban kétszer magasabb, mint az a vektor csoportok is (P katalógusa < 0,01, illetve ábra 3E és további áll_1 ábra S3B és D). 3. ábra Méhen kívüli expressziója MT2A gátolja GC-sejtek növekedésére in vitro és in vivo. MT2A gátolta a sejtek szaporodását és kolónia képződését emberi GC sejtekben. A, Western-blotot, MT2A volt kimutatható BGC823 transzfektált sejtekben ektopikus expressziója MT2A plazmid és az üres vektor. A MT2A fehérje sávokat szkennelt (normalizált béta-aktin, hogy ellenőrizzék a terhelés). B, sejtproliferációt analizáltuk az MTT assay-re-expresszáló MT2A a BGC823 sejtek, vagy sem. Az adatok kimutatták, mint átlag ± .SD három független kísérlet során. C, a növekedés BGC823 sejtek vizsgáltuk egy félszilárd lágy-agar táptalajon. Az üres vektor képződött telepek statisztikailag szignifikánsan több telep van (átlag = 426 nagy telepeket lemezenként. 95% -os CI: 387-472 kolónia), mint MT2A klónt (átlag = 136 telepet. 95% -os CI: 100-164 telepet. A megadott értékek az átlag telepek számát három független kísérlet ± SD A relatív száma kiszámítottuk a kontroll és BGC823-MT2A sejtek, és elemeztük a Student-féle T
-próba (p
= 0,0038). D, MT2A gátolt tumorképzését BGC823 sejtek csupasz egerekben. A tumor átlagos térfogata BGC823-MT2A 3 hetes injekció után 112 mm3 (95% -os CI: 93-147 mm3), szemben az 352 mm3 (95% -os CI: 298-423 mm3) BGC823-Vector. az adatok középértékek ± SD tumor térfogatának származó minden csoport. minden egyes csoportban, tumorméret mértük féknyereg a jelzett időpontokban. az adatokat mutatja átlag ± SD (T-
teszt kimutatási, P
= 0,0027). E, FACS-analízis azt mutatta, hogy MT2A túlzott expresszió eredményeként G2 /M letartóztatás, és az arány a G2 /M fázisban volt magasabb, mint az üres kontroll és a szülői sejtekben (P <
0,01). F, tumorellenes hatásának MT2A detektáltuk annexin V /FITC-PI festés vizsgálattal. Százalékos aránya apoptotikus sejtek 52,9% ± 5,4% MT2A csoportban, mint hogy a szülő sejteket (8,3% ± 2,4% és transzfektált sejtek az üres vektorral (8,2% ± 3,7%, p
< 0,001).
Továbbá, mi bevont BGC823 sejtek represszáló MT2A vagy nem a lágy agar, ektopikus expresszióját MT2A megerősítette a Western blot analízis első (3A ábra). 3 hét után a kultúra MT2A kifejezés okozott statisztikailag szignifikáns csökkenését kolónia képződését (P
= 0,0053, 3C, ábra). Továbbá, nem volt egy drámai növekedés gátlását MT2A-rE-t expresszáló sejteket, mint a negatív kontroll (p
= 0,0027, ábra 3D) a xenograft modellekben. Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy MT2A játszhat szerepet elnyomja elterjedése GC sejtek in vitro és in vivo katalógusa katalógusa.
MT2A elfojtja NF-kB aktivitása révén IκB-α up-reguláció
Azt jelentették, hogy a veszteség MT2A indukált NF-kB jel aktiváció transzgénikus egerek modell (MT2A-knock out) [15]. De a szerepe MT2A mint egy barát vagy ellenség az NF-kB jelátviteli út még ellentmondásos volt [18, 33]. Annak érdekében, hogy értelmezze a mechanizmus MT2A közvetített GC sejtnövekedést elnyomás in vivo és in vitro katalógusa katalógusa, igyekeztünk feltárni a lehetséges kapcsolatát MT2A és NF-kB jelátviteli útvonal, valamint a belső mechanizmus még nem tisztázott GC . MT2A és a fő gének NF-kB jelátvitel, mint például a p65, IκB-α, p-IκB-α és a downstream effektor az NF-kB jelátvitel, ciklin D1 detektáltunk ebben a vizsgálatban (Plusz file1). Méhen kívüli kifejezése MT2A indukált mRNS és fehérje expressziója IκB-α az összes vizsgált GC sejtvonal (BGC823, SGC7901 és AGS), IκB-α mRNS steady-state emelkedtek 5,5-szorosára BGC823 sejtek újra kifejező MT2A 48 h. AGS és SGC7901 sejteket megfigyeltük, 7,2-szeres és 4,3-szeres indukcióját IκB-α mRNS (4a ábra), a relatív fehérje szintje összhangban voltak mRNS-transzkriptumok, és a p-IκB-α fehérje csökkent azokban a GC transzfektált sejtek MT2A vektorba (4B ábra). Amint az ábrákon 4C és D kiütése endogén MT2A a GES1 sejtekben vezetett down-regulációja IκB-α expresszió, valamint a fel-szabályozás p-IκB-α és ciklin D1 expressziója, ami arra utal közötti kapcsolatot MT2A aktivitás és IκB -α kifejezés. Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy MT2A indukál IκB-α expressziója mRNS és fehérje szinten. És MT2A közvetített up-regulációja IκB-α expressziója alátámasztotta immunofluoreszcens (5A, kiegészítő áll_1). Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Kifejezések a COX-2 és a VEGF-C gyomorrák: korrelációt lymphangiogenesis és prognosztikai jelentősége
• Downregulációját SPARC kifejezés csökkenti a gyomorrák sejt invázió és a túlélés