Metallothionein 2A hæmmer NF-KB-aktivering og forudsiger kliniske resultat adskilt med TNM stadie i mavecancerpatienter efter radikal resection

metallothionein 2A hæmmer NF-KB-aktivering og forudsiger kliniske resultat adskilt med TNM stadie i mavecancerpatienter efter radikal resektion
Abstrakt
Baggrund
Metallothionein 2A (MT2A) som en stress protein, spiller en beskyttende rolle i maveslimhinden barriere. Dens rolle i udviklingen af ​​gastrisk cancer (GC) er uklar. Mekanismen for MT2A vil blive undersøgt i gastrisk tumorigenese.
Metoder
MT2A udtryk blev påvist i 973 gastriske prøver. Den biologiske funktion blev bestemt ved ektopisk udtrykke MT2A in vitro
og in vivo
. De mulige nedstrømseffektorer af MT2A blev undersøgt i NF-KB-signalering. Protein- niveauerne af MT2A, IKB-α og p-IkB-α (ser32 /36) ekspression blev analyseret i en undergruppe af 258 patienter ved IHC-farvning. De prognostiske virkninger af MT2A blev status for IKB-α og TNM stadie evalueret ved brug af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af log-rank test.
Resultater
Nedsat MT2A ekspression blev detekteret i cellelinier og primære tumorer i GC. I kliniske data, tab af MT2A (MT2A + i normal (n = 171, 76,0%); Intestinal metaplasi (n = 118, 50,8%); GC (n = 684. 22,4%, P
< 0,001)) var forbundet med dårlig prognose (P
< 0,001), avanceret TNM stadie (P
= 0,05), og nedregulering af IKB-α udtryk (P
< 0,001). Desuden MT2A var den uafhængige prognostiske signatur adskilt fra status IKB-α og patologiske funktioner. Desuden MT2A inhiberede cellevækst gennem apoptose og G2 /M arrest, som reguleres negativt NF-KB-vejen gennem opregulering af IKB-α og nedregulering af p-IKB-α og cyclin D1-ekspression.
Konklusioner
MT2A kan spille en svulst undertrykkende aktivitet gennem hæmme NF-KB-signalering og kan være en prognostisk biomarkør og potentielt mål for individuel terapi af GC patienter.
Nøgleord
Metallothionein 2A NF-KB-signalering mavekræft Prognose TNM stadie Baggrund
Nyheder
overflod af Metallothionein 2A (MT2A) udstillinger i maveslimhinden barriere, men dens rolle i udviklingen af ​​mavekræft (GC) er stadig uklart. I denne analyse af 171 normale gastriske væv, 118 intestinal metaplasi og 684 primære gastriske cancere, nedsat MT2A var signifikant korreleret med dårlig prognose. Det inhiberede proliferationen af ​​GC celler gennem NF-KB-signalering inaktivering. Disse resultater indikerer, at MT2A kan være en vigtig prognostisk markør og terapeutisk mål for GC.
Mavekræft (GC) er den mest almindeligt diagnosticeret malignitet og er stadig en betydelig byrde for kræft i Asien, især i Kina [1, 2]. De fleste GC patienter, der gennemgår kirurgi er allerede langt fremme, og 5-års overlevelsen er varieret. Adskillige histologiske faktorer er blevet rapporteret at være prognostiske faktorer af GC, herunder tumorstørrelse, WHO klassificering, tumor-knude-metastaser (TNM) trins system, og differentiering klasse [3, 4]. Imidlertid prognose af GC patienter på samme stadium er stadig inkonsekvent [5]. Derfor ville identifikation af specifikke diagnostiske markører og terapeutisk mål tillader pålidelig forudsigelse, effektiv udvidelse af postoperativ overlevelse og livskvalitet af patienter [6].
Cellular stress har vist sig at spille en rolle i den molekylære regulering af carcinogenese [7, 8]. Metallothioneiner (MTS) som stressproteinerne med lav molekylvægt og rig-cystein har evnen til en høj affinitet for metalioner og ROS-scavengers. MT2A som den vigtigste isoform af MT'er spiller en vigtig rolle i maveslimhinden barriere hos patienter med gastritis og gnavermodeller [9, 10]. Pre-indgivelse af exogent MT2A eller præ-induktion af endogen MT2A kan beskytte mave og lever mod stress-induceret beskadigelse og inhibere dannelsen af ​​stress-induceret lipid peroxid, hvilket indebærer en beskyttende virkning af MT2A på stressinduceret patogenese og et potentielt terapeutisk mål ansøgte om tidlig forebyggelse [11] - [13]. For nylig MT2A spiller en vigtig rolle i tumorigenese og progression af flere carcinomer herunder GC [14]. Musene tab af MT2A gen disponerede for diethylnitrosamin-induceret hepatocarcinogenese ved at aktivere NF-KB målgener, hvilket viser, at MT2A beskytter mus mod hepatocarcinogen-induceret leverskade og carcinogenese, hvilket understreger den potentielle terapeutiske anvendelse mod hepatocellulær cancer [15]. Nogle undersøgelser fokuserede på den rolle, MT2A i beskyttelsen mod H. pylori
induceret gastrisk skade hjælp MT-null mus. Himeno, opdagede S., at aktivering af NF-KB og ekspression af NF-KB-medierede chemokiner i gastriske celler var markant højere i MT2A-null mus end i wide-type mus [9]. Disse data indebærer, at MT2A indser negativ kontrol af transkriptionsfaktoren NF-KB-aktivitet, men dens rolle i gastrisk carcinogenese er stadig tvetydig [16] - [18].
Aberrant aktivering af NF-KB er forbundet med celle inflammation, malignitet og tumorprogression [7, 19]. Den funktionelle aktivitet af NF-KB inhiberes ved binding til dets inhibitor, IKB-α. Aktivering af NF-KB er et resultat af proteasom-medieret nedbrydning af IkB-α ved phosphorylering af inhibitoren (p-IkB-α), hvilket antyder, at NF-KB-vejen er et potentielt mål for individuel terapi [20] - [23] .
nogle beviser vist, at øget MT2A udtryk er vigtigt for kræft progression, og MT2A er oprindeligt foreslået som en proto-onkogen i bryst, esophageal, prostata, og ovariecancer, der er forbundet med malignitet og dårlig prognose [24] - [27 ]. I modsætning hertil er det nedreguleres i gastrointestinale tumorer og hepatocellulære carcinomer, hvor MT2A enten omvendt korreleret eller relateret til dødelighed [28, 29]. Men variationen af ​​MT2A og den kliniske evaluering forbliver selvmodsigende GC [28, 30, 31]. Disse resultater antyder, at dysregulering af MT2A er involveret i tumor patogenese, selv om den nøjagtige rolle er stadig uklart i GC.
Derfor fokuserede vi at afsløre co-ekspression af MT2A og IKB-α-genet korreleret med klinisk patologiske træk og resultater i stor skala af gastriske tumorer med langsigtede opfølgende data. Derudover analyserede vi systematisk rolle MT2A som en stress protein og negativ regulator i NF-KB-aktivering, som beskriver den biologiske rolle og molekylære mekanisme in vitro
og in vivo
.
Metoder
Patient karakteristika
gastrisk tumor prøver fra 684 GC patienter behandlet på Beijing Cancer Hospital 1997-2007 blev vurderet. Patienterne omfattede 513 mænd (75,0%) og 171 kvinder (25,0%) med en gennemsnitsalder på diagnose af 54 år (i intervallet 19 til 81 år). Den opfølgningsperioden varierede fra 1 til 127,2 måneder (median, 34,2 måneder). Alle patienter undergik radikale resektion med helbredende hensigt. Ingen af ​​patienterne havde fået neoadjuverende kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. Inklusionskriterierne for alle patienter, er: (a) en karakteristisk GC diagnose baseret på den sjette udgave af tumor-node-metastaser (TNM) klassifikation af Den Internationale Union mod GC, (b) en radikal resektion, (c) passer formalinfikserede, paraffinindlejrede væv. De i alt 684 GCS havde klinisk-patologiske data (betegnes som "kohorte"). Desuden blev et sæt af 258 støtteberettigede prøver indsamlet fra kohorten med 10-årige opfølgende data (betegnes som "delmængde"). Den kliniske resultat af patienterne blev registreret fra datoen for kirurgi til dødsdagen. Desuden blev 118 intestinale metaplasi (IM) og 171 normale gastriske væv opsamlet fra disse GC patienter. Histologisk evaluering blev udført af tre ledende patologer. Den demografiske fordeling af kohorten og delmængde er opført i supplerende tabel 1. Desuden blev 36 parrede gastriske tumorer med tilstødende normale væv formalet til et pulver under flydende nitrogen til RT-PCR og Real-Time PCR af MT isoformer (Ekstra file1). tabel 1 Logistisk regressionsanalyse af klinisk-patologiske funktioner og prognose i GC
variates
No. af tilfældene (n = 258)
Survival tid (måneder)
P
-værdi
Sex
Mand
186
66,4 ± 4,6
Female
72
54,1 ± 4,8
0,604
Alder ved diagnose
< 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM stadie
jeg
34
105,5 ± 7,7
jeg vs. IV
< 0.001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs. IV
< 0.001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs. IV
0,010
IV
52
35,8 ± 4,1
Tumor dybde
PT1
13
87,2 ± 9,9
PT1 vs. pT4
0,005
pT2
50
89,1 ± 9,1
pT2 vs. pT4
< 0.001
pT3
157
49,1 ± 2,9
pT3 vs. pT4
0,159
pT4
38
40,1 ± 5,3
Lymfeknude status
PN0
78
89,8 ± 6,2
PN0 vs. pN3
0,001
PN1
115
50,5 ± 3,4
PN1 vs. pN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
pN2 vs. pN3
0,326
pN3
16
47,5 ± 12,6
Distant metastaser
pM0
232
67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8
< 0,001
Grad af differentiering
D1
54
76,0 ± 6,0
D0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A udtryk
< 0.001
lav
202
53,9 ± 3,4
høj
56
86,9 ± 9,2
IKB-α udtryk
lav
164
61,6 ± 4,9
høj
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-IKB-α udtryk
lav
126
74,1 ± 5,3
høj
132
47,7 ± 3,4
0,005
M0: ingen fjernmetastaser; M1: fjernmetastaser;
D1: godt /moderat-opdelte GCS; D0: dårligt differentierede GCS
Immunohistokemisk analyse
IHC-farvning i vævsarray blev udført med MT2A antistof. (1: 100 fortynding; 18-0133, Invitrogen, CA, USA), p-IkB-α-antistof (1 : 200 fortynding ab47752, Abcam, Cambridge, UK), IKB-α-antistof (1: 300 fortynding; sc-371, Santa Cruz Biotechnology, CA). For hver biomarkør, blev billeder scoret visuelt ved tre patologer, der var blindet til kliniske resultat. Uoverensstemmelser blev løst ved konsensus. Scores blev tildelt som en procentdel af positiv farvning i hver cylinder. Den gennemsnitlige procentvise værdi af de to kerner blev beregnet til at repræsentere en tumor (Ekstra file1).
Cellelinjer
mavekræft cellelinjer BGC823, MGC803, SGC7901 og PAMC82 blev etableret i Kina og købt fra vævsbank af Shanghai (Shanghai, Kina). Især BGC823 celler udviste høj tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, blev RF-1, RF-48, SNU-1, SNU-5 og SNU-16 cellelinjer købt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA). GES-1, en immortaliseret human gastrisk epitelcellelinje, blev genereret med SV40 viral transfektion ved Beijing Cancer Hospital og dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO 2 [32].
MTT og blød agar-assay
cellerne blev podet i 96-brønds dyrkningsplader, og MTT blev tilsat til cellerne ved 1-5 dage. MTT (5 ug /ml) blev fjernet efter 4 timers inkubation, og derefter dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat for at opløseliggøre formazanprodukt. Absorbansen ved 490 nm /570 nm blev analyseret ved en mikropladelæser (Bio-rad680 ELISA). Celler blev derefter inkuberet i 4 uger, farvet med vital tetrazoliumfarvestof INT (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) at dokumentere tilstedeværelsen eller fraværet af levedygtige cellekolonier. Den bløde agar blev fikseret med 100 pi methanol-eddikesyre. (3: 1 volumen /volumen), og kolonier blev talt
Tumorigenicitet assay
BGC823 celler (5 x 10 5 celler suspenderet i 0,1 ml PBS) transficeret med MT2A overudtrykt vektor eller tom vektor blev injiceret subkutant i den dorsale flanke af fem 4 uger gamle Balb /C nøgne mus (MT2A-udtryk kloner på de rigtige og vektor kontrol kloner til venstre. Tumor diameter blev målt og dokumenteret hver 5 dage tumorvolumen blev beregnet ifølge formlen ab 2/2 (a > b)... Ved slutningen af ​​25 dage blev alle musene aflivet, og tumoren volumen blev målt tre uafhængige forsøg var udføres, og gav lignende resultater. dyrene blev holdt i anlæg, der er godkendt af foreningen for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care i overensstemmelse med de gældende regler og internationale standarder.
Statistisk analyse
χ
2 test statistik og Students t
-test blev anvendt til sammenligning forbehandling karakteristika patient sager. Den cancerrelateret overlevelse blev analyseret under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af log-rank test. The Spearman rank test og Fishers eksakte test blev anvendt for at demonstrere klinisk-patologiske korrelationer. En Cox proportional hazard regressionsmodel blev brugt med tilhørende 95% konfidensintervaller (CIS) og P
værdier. Alle statistiske tests var to-sidede, og P
værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af den statistiske pakke SPSS (Version 16,0, SPSS Inc, Chicago, IL).
Undersøgelse godkendelse
Alle dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité i Peking University Cancer Hospital. Brugen af ​​humane væv og kliniske data var i overensstemmelse med retningslinjerne fra hospitalet og er godkendt af den lokale etiske komité.
Resultater
Nedsat MT2A udtryk er en molekylær begivenhed i cellelinjer og primære tumorer i GC
Expression af MT2A blev evalueret med RT-PCR og Western blot i et panel af GC cellelinjer og GES1, som serveres som "normal kontrol". Som vist i figur 1A, MT2A mRNA varierede betydeligt med de højeste niveauer i GES1. Manglende eller nedsættelse af MT2A ekspression blev observeret i BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, SNU-1, SNU-5, SNU-16, RF-1, RF-48 og N87 celler. Proteinet niveau MT2A ekspression blev yderligere påvist i de seks almindelige anvendte GC cellelinier (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, og MKN45) sammenlignet med GES1. Western blot analyse viste, at de seks almindeligt anvendte GC cellelinier, niveauerne af MT2A ekspression var fraværende eller lave i forhold til GES1 overensstemmelse med mRNA-ekspression påvist ovenfor (figur 1B). Især BGC823, MGC803 og SGC7901 celler med manglende MT2A ekspression udviser høj tumorigenecity i nøgne mus. Figur 1 manglende eller nedsat ekspression af MT2A detekteres i cellelinjer og primære tumorer af GC. A, MT2A mRNA-niveau blev målt ved RT-PCR i GC-cellelinjer og normale udødelige cellelinje-GES1. Og semi-kvantificering blev udført med Imagetool 3.0 grå skala scanning software (normaliseret til p-actin niveauer). Eksperimentet blev udført tre gange. B, blev MT2A proteinniveau bestemt ved Western blot-analyse i GC cellelinier og den normale udødelig cellelinje-GES1. De MT2A proteinbånd blev scannet (normaliseret til p-actin niveauer). C, Den differentielle udtryk for MT2A mRNA udskrift i 36 parrede GC væv og tilstødende normale væv. De MT2A mRNA bånd blev scannet (normaliseret til p-actin niveauer). D, MT2A proteinniveauer blev påvist i de 36 parrede GC væv ved Western blotting. De MT2A proteinbånd blev scannet (normaliseret til p-actin niveauer). E, Nedsat MT2A blev observeret under gastrisk malign transformation. (A) intens farvning af MT2A i normale væv, (b) moderat farvning af MT2A i IM væv, (c) svag farvning af MT2A i moderat differentierede primære gastriske cancere og (d) negativ ekspression af MT2A i dårligt differentierede GCS (oprindelig forstørrelse × 400). (D) I forhold til de normale og forstadier til kræft-IM prøver, reduceret MT2A var en fælles molekylær begivenhed i gastrisk carcinogenese (P
< 0,001) F: Differentiel udtryk for MT2A i GC, IM og normale væv ved IHC farvning. Negativ: score 0; Svag: score 1-4; Stærk: score 5-12. Yderligere oplysninger findes Yderligere file1.
36 primære tumorer i GC med tilstødende normale væv blev også undersøgt i figur 1C og D, for at bekræfte resultaterne stammer fra GC-cellelinjer, nedsat MT2A mRNA blev vist i GC'er sammenlignet med i matchede normale kontroller (27/36, 75,0%, P
< 0.001, figur 1C). Lav udtryk for MT2A protein blev påvist i 29 af 36 GC sager (80,6%) sammenlignet med de matchede normale væv (P
< 0,001, figur 1D). MRNA-niveauet af MT2A var korreleret til proteinniveauet detekteret ved Western blot (R = 0.510, P
= 0,009). Hos mennesker er MTS kodes af en familie af gener, der består af 10 funktionelle MT isoformer og de kodede proteiner konventionelt opdelt i fire grupper, MT1, MT2, MT3, og MT4-proteiner. Eftersom de kodende regioner af MT isoformer er højt konserveret i transkript og proteinniveauer, MT2A er meget homologe med MT1G, MT1E og MT1F (Yderligere fil 1: Figur S1B). Derfor bør eksperimenter på en individuel isoform udføres omhyggeligt for at sikre, at den nøjagtige isoform analyseres. I denne undersøgelse, differential udtryk for MT1 udskrifter blev observeret i GC cellelinjer og primære tumorer i GC med tilstødende normale kontroller (n = 36) (Ekstra fil 1: Tallene S1A og S2). Vi autentificeret faktiske MT2A gen nedregulering i GC væsentligt i forhold til tilstødende normale væv (27/36, 75%, figur 1C). Der var ingen forskel på MT1E og MT1F og MT1G mRNA-transkripter i normale og tumor prøver samt MT1B mRNA udskrift var ikke påvises i alle celler og væv (Yderligere fil 1: Tallene S1A og S2).
At undersøge kandidatur MT2A i gastrisk tumorigenese, vi oprindeligt karakteriseret status MT2A udtryk i 171 normale væv, 118 IM og 684 GC prøver ved IHC farvning. Antistoffet for MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) ikke er specifik for MT-2A kun vejledende, og krydsreagerer med MT-1 til en vis grad, selvom den er klonet ved den fulde længde af MT2A. Da der ikke er noget specifikt antistof til at påvise MT2A, så bruger vi den fælles handelspolitik antistof til IHC farvning, som blev offentliggjort i de fleste relaterede studier, er MT2A udtryk klassificeret som lav og høj ekspression i normale udseende væv, IM, og primær GC'er. Højt MT2A ekspression blev påvist i 153 af 684 (22,4%) GC sager, og 60 af 118 (50,8%) IM sager, samt 130 af 171 (76,0%) normale udseende tilfælde henholdsvis (Ekstra file1: Tabel S3 , P
< 0,001), blev det bestod med MT2A mRNA-transkripter og protein-ekspression ved Western blot. Ekspressionen af ​​MT2A blev klassificeret som negative, svage og stærke tilfælde i 13 (7,6%), 28 (16,4%) og 130 (76,0%) ud af 171 normale væv, henholdsvis; I IM væv, 27 (22,9%), 31 (26,3%) og 60 (50,8%) ud af 118 IM sager blev opdaget henholdsvis; I GC-prøver, 494 (72,2%), 37 (5,4%) og 153 (22,4%) ud af 684 GC tilfælde blev påvist (figur 1F, Yderligere file1). Der var en gradvist faldet udtryk for MT2A protein i IM og GC (P
< 0,001, figur 1E og F). Det er klart, at MT2A mRNA blev højt udtrykt i GES1 celler og normale væv, men blev reduceret eller tabt i de fleste GC celler og væv. Disse resultater antyder, at faldet MT2A er en molekylær begivenhed i tumorgenese og progression.
MT2A ekspression er korreleret med dårlig prognose i GC
MT2A var ofte nedreguleret i GC. At undersøge, om MT2A udtryk var en prognostisk faktor i menneskelig GC blev MT2A proteinekspression undersøges i delmængde af IHC farvning. De enkelte prøver blev kategoriseret som lav (MT2A-) eller høj ekspression (MT2A +). MT2A- var forbundet med dårlig samlet overlevelse (figur 2A, P
< 0,001). Univariate analyse viste, at nogle faktorer, herunder faldet MT2A udtryk (P
< 0,001), TNM stadie (P
< 0,01), tumor dybde (P
< 0,05), lymfeknude status (P
< 0,05), fjernmetastaser (P
< 0,001) og graden af ​​differentiering (P
= 0,011) blev korreleret med dårlig overlevelse (tabel 1). Cox multivariat analyse viste, at den samlede overlevelse var forbundet med MT2A udtryk (MT2A + versus MT2A- hazard ratio [HR], 0,429, 95% SNG, 0,187-0,683; P
= 0,002, tabel 2). Vi anslået den potentielle kliniske betydning af MT2A ved at korrelere sit udtryk mønster med de kliniske parametre (Ekstra file1: Tabel S4). MT2A udviste en omfattende positiv korrelation med tumor differentiering (P
< 0,001) og omvendt korrelation med TNM stadie (P
= 0,05). Disse resultater indikerer, at MT2A er korreleret med klinisk patologiske træk og overlevelse i GC patienter. Figur 2 Analyse af kombineret MT2A med TNM stadie at forudsige det kliniske resultat i GC. Kaplan-Meier-analyse af samlet overlevelse for MT2A ekspression blev anvendt ifølge TNM fase. A, Prognostisk værdi af MT2A udtryk i GC patienter fordel til at forudsige udfaldet af patienter blev lav udtryk for MT2A forbundet med dårlig samlet overlevelse (P <
0,01); B, TNM stadie var til gavn for den prognostiske forudsigelse i GC patienter. C D, prognostiske værdi af MT2A i TNM stadie I-II og fase III-IV (P
= 0,048, P <
0,001 henholdsvis); E F, prognostiske værdi af MT2A udtryk i lymfeknude metastaser eller ej (P
< 0,001, P
= 0,052, henholdsvis); G. Prognostisk værdi MT2A udtryk på ingen fjernmetastaser undergruppe (n = 232, P
< 0,001); H. Prognostisk værdi MT2A i pT3-pT4 undergruppe (P
< 0,001). Alle data indebærer, at MT2A kunne være en effektiv prognostisk signatur.
Tabel 2 Cox regressionsanalyse af klinisk-patologiske funktioner og molekylære signaturer i GC
Multivariat analyse
kovariat ved slutpunktet

Hazard ratio
95% CI
P- Drømmeholdet værdi
Alder ≥ 60 år
1,300
0,840-1,934
0,254
Sex
0,823
0,499-1,233
0,292
Differentiering
0,753
0,509-1,778
0,875
Tumor invasiv dybde
1,914
1,389 til 2,638
< 0.001
Lymfeknude status
1,291
1,034-1,612
0,024
fjernmetastaser
2,595
1,332-5,056
0,005
MT2A
0,429
0,187-0,683
0,002
IKB-α
0,779
0,524-1,311
0,423
p-IKB-α
1,857
1,256-2,912
0.003
prognostisk betydning af MT2A kombineret med TNM stadie i GC patienter
for yderligere at belyse MT2A udtryk i prognostisk betydning, kombineret vi MT2A udtryk med de klinisk-patologiske funktioner i GC. Formålet var at vurdere prognosen for GC patienter med patologisk klassificering, og at undersøge, om patologisk klassificering bør være yderligere sub-klassificeret for mere præcis forudsigelse af udfaldet. Som vist i supplerende file1: Tabel S4, MT2A ekspression i GC var forbundet med TNM stadie og tumor differentiering, hvilket betyder, at MT2A kan være en potentiel biomarkør molekylær at forudsige patologisk klassifikation i GC. Som dikotome kovariater, både MT2A og TNM stadie var uafhængige prædiktorer for overlevelse (tabel 2, figur 2A og B). Prognostisk betydning af MT2A ekspression blev yderligere analyseret i GC patienter i henhold til klassifikationssystemet for pTNM. Der var en signifikant forskel i den samlede overlevelse mellem patienter med MT2A udtryk i både tidlige (I og II) og avancerede (III og IV) fase grupper (P
= 0,048 og P
< 0,001, henholdsvis; Figur 2C og D). Desuden MT2A udtryk status var også effektiv til prognosen i de samme trin (P
= 0,052, figur 2E; P
< 0,001, figur 2F; P
< 0,001, figur 2G og P
< 0,001, figur 2H). Disse data repræsenterer at MT2A er en molekylær signatur til at forudsige det kliniske resultat baseret på TNM stadie.
Restaurering af MT2A ekspression resulterer i vækst undertrykkelse af GC celler in vitro
og in vivo
at afsløre mekanismen af MT2A i GC, vi stabilt transficeret MT2A overudtrykt plasmid og tom vektor i tre GC cellelinier (BGC823, SGC7901 og AGS). Vi undersøgte vækst, apoptose satser og cellecyklus af disse cellelinier transficeret med MT2A plasmid. Cellernes levedygtighed blev reduceret i GC celler igen udtrykker MT2A hjælp MTT assay (BGC823, P
= 0,0038, Figur 3B, AGS, P
= 0,0007, Ekstra file1: Figur S3A, SGC7901, P
= 0,0004 , Yderligere file1: Figur S3C). For yderligere at undersøge funktionen af ​​MT2A i GC cellelinjer, vi analyserede virkningerne af MT2A udtryk for celledeling og cellecyklus regulering af Annexin-V /PI farvning og flowcytometri analyse. Mere apoptose blev påvist i disse GC celler re-udtrykkende MT2A (P
< 0,01 henholdsvis figur 3F; Yderligere file1: Figur S3A og C). Endvidere blev G2 /M arrest observeret i GC-celler under anvendelse af ektopisk ekspression af MT2A. Forholdene mellem G2 /M-fasen i MT2A grupper var dobbelt højere end i vektoren grupperne gjorde (P
< 0,01, henholdsvis figur 3E og Ekstra file1: Figur S3B og D). Figur 3 Ektopisk ekspression af MT2A inhiberer GC celler vækst in vitro og in vivo. MT2A hæmmede celledeling og kolonidannelse i humane GC celler. A, Western blot af MT2A blev detekteret i BGC823 celler transficeret med ektopisk ekspression af MT2A plasmid og tom vektor. De MT2A proteinbånd blev scannet (normaliseret til p-actin til at styre til lastning). B, blev Celleproliferation analyseret ved MTT-assayet i re-udtrykkende MT2A af BGC823 celler eller ej. Data blev vist som middelværdi ± .SD af tre uafhængige forsøg. C, Vækst af BGC823 celler blev analyseret i en halvfast blød agar medium. De tomme vektor kolonier dannet statistisk signifikant flere kolonier (middelværdi = 426 store kolonier per plade 95% kreditinstitutters:. 387-472 kolonier) end MT2A kloner (middelværdi = 136 kolonier 95% kreditinstitutters:.. 100-164 kolonier Tallene repræsenterer middelværdien antal kolonier af tre uafhængige forsøg ± SD Det relative antal blev beregnet i kontrol- og BGC823-MT2A celler, og analyseret ved hjælp af Students t
-test (P
= 0,0038). D, MT2A-hæmmede tumorgenicitet af BGC823 celler . i nøgne mus Det gennemsnitlige tumorvolumen for BGC823-MT2A på 3 uger efter injektion var 112 mm3 (95% cis: 93-147 mm3), sammenlignet med 352 mm3 (95% cis: 298-423 mm3) for BGC823-vektor. dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af tumorvolumen afledt fra hver gruppe. i hver gruppe blev tumorstørrelser målt med en skydelære i de angivne tidspunkter. data blev vist som middelværdi ± SD (T-
test opdagelse, P
= 0,0027) E viste FACS-analyse, at MT2A overekspression førte til G2 /M anholdelse, og forholdet mellem G2 /M fase var højere end i tomme kontrol- og forælder celler (P <
0,01). F, antitumorvirkningen af ​​MT2A blev påvist ved annexin V /FITC-PI-farvning-assay. Procentdelen af ​​apoptotiske celler var 52,9% ± 5,4% i MT2A gruppe sammenlignet med i forælder celler (8,3% ± 2,4% og celler transficeret med den tomme vektor (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Endvidere vi udpladet BGC823 celler undertrykkende MT2A eller ikke i blød agar, blev ektopisk ekspression af MT2A bekræftet ved Western blot-analyse først (figur 3A). efter 3 ugers dyrkning MT2A ekspression forårsagede en statistisk signifikant reduktion i kolonidannelse (P
= 0,0053, figur 3C). Endvidere var der en dramatisk vækstinhibering af MT2A-re-udtrykkende celler sammenlignet med den negative kontrol (P
= 0,0027, figur 3D) i xenograftmodeller. Disse data viser, MT2A kan spille en rolle i at undertrykke proliferation af GC celler in vitro
og in vivo
.
MT2A undertrykker NF-KB-aktivitet gennem IkB-α opregulering
det blev rapporteret, at tabet af MT2A induceret NF-KB-signal aktivering i transgene mus model (MT2A-knock out) [15]. Men rollen som MT2A som en ven eller fjende i NF-KB-signal pathway stadig kontroversiel [18, 33]. Ved fortolkningen mekanismen for MT2A medieret GC cellevækst undertrykkelse in vivo
og in vitro
, forsøgte vi at udforske det potentielle forhold mellem MT2A og NF-KB signalvejen, og den indre mekanisme var stadig uklar GC . MT2A og de vigtigste gener i NF-KB-signalering, såsom p65, IkB-α, p-IKB-α og den nedstrøms effektor af NF-KB-signalering, cyclin D1 blev påvist i denne undersøgelse (Supplerende file1). Ektopisk udtryk for MT2A induceret både mRNA og protein udtryk for IKB-α i alle undersøgte GC cellelinjer (BGC823, SGC7901 og AGS), blev IKB-α mRNA steady state-niveauerne steg 5,5 gange i BGC823 celler re-udtrykkende MT2A for 48 h. I AGS og SGC7901 celler, observerede vi en 7,2-fold og 4,3-fold induktion af IkB-α-mRNA (figur 4A), de relative proteinniveauer stemte overens med mRNA-transkripter, og p-IkB-α-protein blev reduceret i de GC celler transficeret MT2A vektor (figur 4B). Som vist i figur 4C og D, knockdown af endogen MT2A i GES1 celler førte til nedregulering af IKB-α udtryk samt opregulering af p-IKB-α og cyklin D1 udtryk, hvilket tyder på en forbindelse mellem MT2A aktivitet og IKB -α ekspression. Disse forsøg viser, at MT2A inducerer IkB-α ekspression i mRNA og protein niveauer. Og MT2A-medieret opregulering af IKB-α udtryk blev yderligere bekræftet ved immunfluorescens (figur 5A, Ekstra file1). Figur S1. Figur S2. Figur S3. Figur S4. Figur S5. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Udtryk af COX-2 og VEGF-C i mavekræft: korrelationer med lymphangiogenese og prognostiske implikationer
• Nedregulering af SPARC udtryk falder mavekræft cellulære invasion og overlevelse