Metalotionein 2A zavira NF-κB pot aktivacije in napoveduje klinični izid ločene s stopnjo TNM pri bolnikih z rakom želodca po radikalni resection

metalotionein 2A zavira NF-κB pot aktivacije in napoveduje klinični izid ločene s stopnjo TNM pri bolnikih z rakom želodca po radikalni resekciji
Povzetek
Ozadje
metalotioneina 2A (MT2A) kot stres beljakovin, ima zaščitno vlogo pri želodčne sluznice pregrado. Njena vloga pri razvoju raka želodca (GC) je nejasna. Mehanizem MT2A bodo raziskovali v želodcu tumorigeneze.
Metod
MT2A izraz je bila odkrita v 973 želodčnih osebkov. Biološka funkcija je bila določena s zunajmaternične izraža MT2A vitro
in vivo
. Možne nižji stopnji efektorji za MT2A so raziskovali pri NF-κB signalizacijo. Ravni proteinske MT2A, IκB-a in p-IκB-a (ser32 /36) izraz so bili analizirani v podskupini 258 bolnikov, ki jih IHC barvanjem. V prognostične učinki MT2A je bilo stanje IκB-a in fazo TNM ocenili po metodi Kaplan-Meier, in v primerjavi s testom log-rang.
Rezultati
Zmanjšanja MT2A izraz je bila odkrita v celičnih linijah in primarni tumorji GC. V kliničnih podatkov, izguba MT2A (MT2A + v Normal (n = 171, 76,0%); intestinalno metaplazijo (n = 118, 50,8%), GC (n = 684. 22,4%, P
< 0,001)) je bilo povezano s slabo prognozo (P
< 0,001), napredna faza TNM (P
= 0,05), in navzdol ureditev IκB-alfa izražanja (P
< 0,001). Poleg tega je MT2A neodvisni napovedni podpis ločeno od statusa IκB-a in patoloških funkcije. Poleg tega MT2A zaviral rast celic z apoptozo in G2 /M aretacijo, ki negativno urejeno NF-κB pot skozi up-regulacijo IκB-a in dol ureditev p-IκB-a in ciklin D1 izražanja.
Sklepov
MT2A lahko igrajo tumor omejevalno dejavnost z zaviranjem NF-κB signalizacijo in lahko prognostični biomarkerjev in potencialna tarča za individualno zdravljenje bolnikov GC.
Ključne besede
metalotioneina 2A NF-κB signalizacijo rak želodca Prognoza TNM odrsko ozadje
Kaj je novega
Obilje metalotioneina 2A (MT2A) eksponatov v želodcu sluznice oviro, vendar je njegova vloga pri napredovanju raka želodca (GC) je še vedno nejasno. V tej analizi 171 normalnih želodčnih tkiv, 118 intestinalno metaplazijo in 684 osnovnih želodca raka, zmanjšala MT2A je pomembno povezana s slabo prognozo. To inhibira proliferacijo GC celic z NF-κB signalizacije deaktivacijo. Ti rezultati kažejo, da je lahko MT2A pomemben napovedni marker in terapevtski cilj za GC.
Raka želodca (GC) je najpogosteje diagnosticiran malignost in ostaja velika bremena raka v Aziji, predvsem na Kitajskem [1, 2]. Večina bolnikov GC predvideno operacijo so že v zaključni fazi in 5-letno preživetje je raznolika. Poročali so, da so napovedni dejavniki GC, vključno z velikostjo tumorja, klasifikacijo Svetovne zdravstvene organizacije, odrski sistem tumor-node-metastaze (TNM) in diferenciacijo razred več histoloških dejavnikov [3, 4]. Vendar prognoza pacientov GC na isti stopnji še vedno skladen [5]. Zato bi bila identifikacija posebnih diagnostičnih označevalcev in terapevtske tarče omogočajo zanesljivo napoved, učinkovito razširitev pooperativnem preživetje in kakovost življenja bolnikov. [6] je bila
Cellular stres je vidno vlogo v molekularno ureditev rakotvornosti [7, 8]. Metalotioneini (MTS), kot stresnih proteinov z nizko molekulsko maso in bogato-cistein imajo sposobnost visoko afiniteto do kovinskih ionov in ROS lovilca. MT2A kot glavni izooblika MTS igra pomembno vlogo pri želodčne sluznice oviro pri bolnikih z gastritis in glodalcev modelov [9, 10]. Predhodno dajanje eksogenega MT2A ali pre-indukcijo endogenih MT2A lahko zaščitimo želodec in jetra pred poškodbami stresom povzročene in zavirajo nastajanje stresom povzročene lipidov peroksida, kar pomeni zaščitni učinek MT2A na stres povzroča patogenezo in potencialnega terapevtskega cilja uporablja za zgodnje preprečevanje [11] - [13]. V zadnjem času, MT2A igra pomembno vlogo pri tumorigeneze in napredovanje več karcinomov, vključno z GC [14]. Izguba miši MT2A gena nagnjenih k diethylnitrosamine inducirane hepatocarcinogenesis z aktivacijo NF-κB ciljnih genov, ki dokazuje, da MT2A ščiti miši iz-hepatocarcinogen povzroča poškodbe jeter in rakotvornosti, kar potrjuje njegovo potencialno terapevtsko uporabo proti raku jetrnih celic [15]. Nekatere študije so se osredotočili na vlogo MT2A za zaščito proti H. pylori
inducirano poškodbe želodčne uporabo MT-null miši. Himeno, S. ugotovili, da aktivacije NF-κB in izražanje NF-κB posredovanih Kemokini v želodčnih celic je bilo v MT2A-null miši občutno višja kot v široko miši [9]. Ti podatki kažejo, da MT2A spozna negativno kontrolo aktivnosti NF-κB prepisovanje faktor, vendar je njegova vloga v želodčni rakotvornosti je še vedno nejasen [16] - [18].
Aberrant aktivacije NF-κB je povezana z vnetjem celic, malignost in tumor napredovanje [7, 19]. Funkcionalna aktivnost NF-κB inhibirana z vezavo na svojem inhibitor, IκB-a. Aktiviranje NF-κB je nastala-proteazomske posredovano degradacijo IκB-a s fosforilacijo zaviralca (p-IκB-alfa), kar kaže, da je NF-κB pot potencialna tarča za individualno terapijo [20] - [23] .
Nekateri dokazi pokazali, da povečana MT2A izraz je pomembno za napredovanje raka, in MT2A je prvotno predlagala, kot proto-onkogena v dojke, požiralnika, prostate in raka na jajčnikih, povezana z maligne bolezni in slabo prognozo [24] - [27 ]. V nasprotju s tem pa je navzdol urejena v gastrointestinalnih tumorjev in hepatocelularnih karcinomov, kjer je MT2A ali obratno povezana ali nepovezana z umrljivostjo [28, 29]. Vendar pa je sprememba MT2A in njegovo klinično oceno ostaja protislovna GC [28, 30, 31]. Ti rezultati kažejo, da se slabe regulacije MT2A vključeni v tumorja patogenezi, čeprav je točna vloga še vedno ni jasno, v GC.
Zato smo se osredotočili razkriti sodelovanje izražanje MT2A in IκB-alfa gena v korelaciji s kliničnimi patoloških značilnosti in rezultatov v velikem obsegu želodčnih tumorjev z dolgoročnimi nadaljnjih podatkov. Poleg tega smo sistematično analizirali vlogo MT2A kot stres beljakovin in negativni regulator v aktivacije NF-κB karakterizacijo svojo biološko vlogo in molekularni mehanizem in vitro
in vivo
.
Metod
značilnosti bolnika so bili ocenjeni
tumorja želodca vzorci iz 684 bolnikov, GC, zdravljenih v Pekingu Cancer Hospital od leta 1997 do leta 2007. Bolniki 513 moških (75,0%) in 171 žensk (25,0%) s povprečno starostjo ob diagnozi 54 let (razpon od 19 do 81 let). Obdobje nadaljevanje v razponu od 1 do 127,2 mesecev (mediana 34,2 meseca). Vsi bolniki doživel radikalno resekcijo z kurativno nameri. Nobeden od teh bolnikov so bili novi dopolnilni kemoterapijo ali radioterapijo pred operacijo. Merila za vključitev vseh bolnikov je: (a) razvrstitev izrazit GC diagnoza temelji na šesti izdaji tumorja-node-metastaz (TNM) Mednarodne zveze proti GC, (b) radikalno resekcijo, (c) primerno formalinom fiksna, parafinske vgrajene tkiva. Skupna vsota 684 GK imeli clinicopathological podatke (označilo kot "kohorta"). Poleg tega so niz 258 upravičenih zbranih vzorcev iz kohorte z nadaljnjimi podatki 10 let (označimo kot "podskupini"). Klinični izid bolnikov je imela od datuma operacije do dneva smrti. Poleg tega je bilo 118 črevesne metaplazijo (IM) in 171 običajnih želodčnih tkiva zbirajo od teh bolnikov GC. Histološka preiskava je bila izvedena v treh visokih patologi. Demografska struktura kohorte in podskupini je navedena v dopolnilnem tabeli 1. Poleg tega je bila 36 paru želodčnih tumorjev s sosednjimi normalnih tkivih zmlete v prah pod tekočim dušikom za RT-PCR in PCR v realnem času za MT izooblik (Dodatni datoteka1). Tabela 1 logistične regresije analiza clinicopathological funkcij in prognozo na GC
različna glede
No. primerov (n = 258)
Survival čas (mesec)
P
-vrednost
Sex
Moški
186
66,4 ± 4.6
ženska
72
54,1 ± 4,8
0,604
Starost ob diagnozi
< 60
173
65,0 ± 4,9
≥60
stage 85
59,2 ± 5,6
0,867
TNM
sem
34
105,5 ± 7,7
I vs. IV
< 0,001
II
57
74,0 ± 5,9
II vs IV
< 0,001
III
115
49,1 ± 3,4
III vs. IV
0,010
IV
globini 52
35,8 ± 4,1
tumor
PT1
13
87,2 ± 9,9
PT1 vs. PT4
0.005
PT2
50
89,1 ± 9,1
PT2 vs. PT4
< 0,001
PT3
157
49,1 ± 2,9
PT3 vs PT4
0.159
PT4
38
40,1 ± 5,3
limfnega vozla stanje
pN0
78
89,8 ± 6,2
pN0 vs. pN3
0.001
pN1
115
50,5 ± 3,4
pN1 primerjavi pN3
0,212
pN2
49
46,6 ± 6,0
pN2 vs. pN3
0,326
pN3
16
47,5 ± 12,6
daljnih metastaz
pM0
232
67,5 ± 4,3
PM1
26
27,6 ± 5,8
< 0,001
Stopnja diferenciacije
D1
54
76,0 ± 6,0
d0
204
59,8 ± 4,4
0,011
MT2A izraz
< 0,001
nizko
202
53,9 ± 3,4
visoko
56
86,9 ± 9,2
IκB-α izraz
nizko
164
61,6 ± 4,9
visoko
94
64,9 ± 5,1
0,248
p-IκB-α izraz
nizko
126
74,1 ± 5,3
visoko
132
47,7 ± 3,4
0.005
M0: ni daleč metastaze; M1: oddaljene metastaze,
D1: dobro /zmerno diferencirane GK; D0: slabo diferencirane GK
Imunohistokemično analiza
IHK obarvanje v tkivni izbira je bila opravljena z MT2A protitelesa. (1: 100 redčenje 18-0133, Invitrogen, CA, ZDA), p-IκB-α protitelesa (1 : 200 redčenje, ab47752, Abcam, Cambridge, Velika Britanija), IκB-α protitelesa (1: 300 redčenje, sc-371, santa Cruz Biotechnology, CA). Za vsako biomarker, so bile slike vizualno ekipo trije patologi, ki so slepo na klinični izid. Razlike so bile odpravljene s soglasjem. Rezultati so bili dodeljeni kot odstotek pozitivni obarvanjem znotraj vsakega valja. Povprečni odstotek vrednosti dveh jeder je bil izračunan tako, da predstavljajo eno tumor (Dodatni datoteka1).
Celične linije
želodčni rak celičnih linij BGC823, MGC803, SGC7901 in PAMC82 so bile ugotovljene na Kitajskem in kupljene iz banke tkiva v Šanghaju (Shanghai, Kitajska). Še posebej, BGC823 celice razstavljena visoko tumorigenecity. MKN45, AGS, N87, smo RF-1, RF-48, snu-1, snu-5 in snu-16 celične linije kupljene iz ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, ZDA). GES-1, imortalizirana človeška želodca epitelijsko celično linijo, je nastalo z SV40 virusno transfekcijo ob Beijing Cancer Hospital in gojimo v DMEM mediju, dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (Gipco, Life Technologies, Grand Island, NY, ZDA) pri 37 ° C v navlaženi atmosferi, ki vsebuje 5% CO 2 [32].
MTT in mehkega agarja vsebnosti
smo celice zasejali v kulturi ploščah s 96 vdolbinami ter MTT dodamo k celicam pri 1-5 dnevi. MTT (5 ug /ml) smo odstranili po 4 h inkubacije, nato pa dodamo dimetil sulfoksid (DMSO), da solubiliziramo formazana. Absorbanca pri 490 nm /570 nm smo analizirali s čitalcem mikrotitrskih (Bio-rad680 ELISA). Celice smo nato inkubirali 4 tedne, obarvane z življenjsko INT tetrazolijevega barvila (piodonitrotetrazolium, Invitrogen) dokumentiranja prisotnost ali odsotnost kolonij živih celic. Mehko agar je bil določen s 100 ul metanol-ocetna kislina. (3: 1 vol /vol) in preštejemo kolonije
tumorogenosti vsebnosti
BGC823 celice (5 x 10 5 celicah, suspendirane v 0,1 ml PBS) transfekciji s MT2A prekomerno izražen vektor ali prazen vektor so subkutano injicirali v hrbtnem bok petih 4 tednov starih ženski Balb /C nude miši (MT2A-klonov na klonov pravimi in nadzor prenašalcev na levi strani. premer tumorja je bila izmerjena in dokumentira vsakih 5 dni tumorski volumen smo izračunali po formuli ab 2/2 (a >b)... na koncu 25 dni, smo vse miši žrtvovali in volumen tumorja smo izmerili tri neodvisne poskuse bili izvedena in je dal podobne rezultate. živali so se ohranila v objektih, ki jih združenje za ocenjevanje in akreditacijo skrbi za laboratorijske živali v skladu z veljavnimi predpisi in mednarodnimi standardi odobrenih.
Statistična analiza
χ
2 testne statistike in študentov je t
-test so bili uporabljeni za primerjavo predhodno zdravljenje značilnosti primerov bolnikov. preživetja je v zvezi z rakom smo analizirali po metodi Kaplan-Meier in je v primerjavi s testi log ranga. Test rang Spearman in Fisherjev test, so bili uporabljeni za dokazovanje clinicopathological korelacije. COX sorazmerna nevarnosti regresijski model smo uporabili s pripadajočimi 95% intervali zaupanja (CIS) in P
vrednosti. Vsi statistični testi so bili dvostranski in so bile upoštevane p
vrednosti manj kot 0,05 statistično značilne. Statistična analiza je bila izvedena s pomočjo statističnega paketa SPSS (različica 16.0, SPSS Inc, Chicago, IL).
Študija odobritev
Vse študije na živalih so bili potrjeni Odbor za etiko Peking University Cancer Hospital. Uporaba človeških tkiv in kliničnih podatkov, ki so v skladu s smernicami iz bolnišnice in ga je lokalni etični odbor odobri.
Rezultati
Zmanjšanja MT2A izraz je molekularna dogodek v celičnih linij in primarnih tumorjev GC
izražanja od MT2A je bila ocenjena z RT-PCR in Western blot v senatu celičnih linij GC in GES1, ki je služil kot "običajni nadzor". Kot je prikazano na sliki 1A, MT2A mRNA bistveno spreminjala z najvišjimi v GES1. Pomanjkanje ali zmanjšanje MT2A izražanja so opazili pri BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, snu-1, snu-5, snu-16, RF-1, RF-48 in N87 celic. Raven beljakovin MT2A izražanja se je še odkriti v šestih skupnih uporabljenih celičnih linij GC (BGC823, MGC803, SGC7901, AGS, N87, in MKN45) v primerjavi z GES1. Western blot analiza je pokazala, da je bilo v šestih pogosto uporabljenih GC celičnih linij ravni MT2A izražanja odsoten ali nizka v primerjavi s GES1 skladna z ekspresijo mRNA nad zaznano (slika 1B). Še posebej, BGC823, MGC803 in SGC7901 celice s pomanjkanjem MT2A izražanja kažejo visoko tumorigenecity v golih miših. Slika 1 Ni ali zmanjšano izražanje MT2A zazna v celičnih linij in primarnih tumorjev GC. Stopnja, MT2A mRNA je bila merjena z RT-PCR v celičnih linijah GC in normalno nesmrtne celične linije-GES1. In analize semi-količinsko bile izvedene Imagetool 3,0 sivo programske opreme obsega skeniranja (normalizirane na beta-aktina ravni). Poskus smo izvedli v treh izvodih. B, je bila stopnja MT2A protein določi blot analizo Western v celičnih linijah GC in normalno nesmrtne celične linije-GES1. Beljakovinsko trakovi MT2A so skenirani (normirane na beta-aktin ravni). C, The razlika izraz MT2A mRNA prepisa v 36 parnih GC tkiva in sosednjih normalnih tkivih. V MT2A mRNA trakovi so skenirani (normirane na beta-aktin ravni). D, so bile ugotovljene stopnje MT2A beljakovin v 36 parnih GC tkiva z metodo Western blot. Beljakovinsko trakovi MT2A so skenirani (normirane na beta-aktin ravni). E, zmanjšana MT2A je v želodcu maligno transformacijo opazili. (A) intenzivno obarvanje MT2A v normalnih tkivih, (b) zmerno obarvanje MT2A v IM tkivih, (c) šibko obarvanje MT2A pri zmerno diferenciranih primarnih želodčnega raka in (d) negativni izraz MT2A v slabo diferencirana GCS (prvotna povečava × 400). (D) v primerjavi z vzorci normalne in predrakave lezije-IM, je bila zmanjšana MT2A skupna molekulska dogodek v želodčni rakotvornosti (P ​​
< 0,001) F: Diferencialni izraz MT2A v GC, IM in normalnih tkivih IHC barvanjem. Negativno: ocena 0; Slab: rezultat 1-4; Močna: rezultat 5-12. Za podrobnosti glej Dodatne datoteka1.
36 primarne tumorje GC s sosednjimi normalnih tkivih so bile preverjene tudi na sliki 1C in D, za potrditev rezultatov, pridobljenih iz GC celičnih linij, zmanjšano MT2A mRNA je bila prikazana v GK v primerjavi s tistimi v ujema običajni nadzor (27/36, 75,0%, P
< 0,001, slika 1C). Nizka izraz MT2A beljakovin je bila odkrita v 29 od 36 primerov GC (80,6%) v primerjavi z izravnanih normalnih tkivih (P
< 0,001, slika 1D). Raven mRNA MT2A je povezana s stopnjo proteinov z Western blot (R = 0,510, P
= 0,009) odkrita. Pri ljudeh, so MTS kodiran z družino genov, ki so sestavljeni iz 10 funkcionalnih MT izoform in kodirane proteini so konvencionalno razdeljene v štiri skupine, MT1, MT2, MT3 in MT4 proteinov. Ker so kodiranje regije MT izooblik zelo ohranjena v ravni zapisnika in beljakovin, MT2A je zelo homologna z MT1G, MT1E in MT1F (Dodatni datoteka 1: Slika S1B). Zato mora biti poskusi na vsakem posameznem izooblike skrbno izvaja, da se zagotovi, da se natančno izoforma analizirati. V tej študiji, diferencialna ekspresija MT1 transkriptov opazili v celičnih linijah GC in primarnih tumorjev GC s sosednjimi običajnih kontrol (n = 36) (Dodatni datotek 1: Številke S1A in S2). overjeni smo dejansko MT2A gen navzdol ureditev v GC bistveno v primerjavi s sosednjimi normalnih tkivih (27/36, 75%, slika 1C). Ni bilo razlike v MT1E in MT1F in MT1G mRNA transkriptov v normalno in vzorcev tumorjev, kot tudi MT1B mRNK prepis ni bilo zaznati v vseh celicah in tkivih (Dodatni datotek 1: Številke S1A in S2).
Da bi raziskali kandidaturo MT2A želodčnega tumorigeneze, smo sprva označen status MT2A izražanja v 171 normalnih tkivih, 118 IM in 684 GC vzorcev z IHC barvanjem. Protitelo za MT2A (E9 18-0133, Invitrogen) ni specifičen za MT-2A samo in navzkrižno reagira z MT-1 do neke mere, čeprav je kloniran s polno dolžino MT2A. Ker ni protitelo, specifično za odkrivanje MT2A, zato smo uporabili skupne trgovinske protitelesa za IHC barvanjem, ki je bila objavljena v najbolj sorodnih študij, je MT2A izraz opredeliti kot nizko in visoko ekspresijo v normalnih videz tkiv, IM, in primarne GK. Visoka stopnja MT2A izražanja je bila odkrita v 153 od 684 (22,4%) primerih GC, in 60 od 118 (50,8%) primerih, IM, kot tudi 130 171 (76,0%) normalnih primerih videz, v tem zaporedju (Dodatni datoteka1: Tabela S3 , P
< 0,001), je bil sestavljen z MT2A mRNA transkriptov in beljakovin izražanja, ki ga Western blot. Izraz MT2A je bil razvrščen kot negativne, šibkih in močnih primerih, v 13 (7,6%), 28 (16,4%) in 130 (76,0%) od 171 normalnih tkivih, v tem zaporedju; V IM tkiv, 27 (22,9%), 31 (26,3%) in 60 (50,8%) od 118 primerov IM sta bila odkrita; V vzorcih GC, 494 (72,2%), 37 (5,4%) in 153 (22,4%) od 684 primerov GC so bile ugotovljene v tem zaporedju (slika 1F, Dodatna datoteka1). Prišlo je postopno zmanjšal ekspresijo MT2A beljakovin v UI in GC (P
< 0,001, slika 1E in F). Jasno je, da je MT2A mRNA močno izražena v GES1 celic in normalnih tkiv, vendar je bil zmanjšan ali izgubljena v večini GC celicah in tkivih. Ti rezultati kažejo, da je zmanjšala MT2A je molekularna dogodek v tumorigeneze in napredovanje.
MT2A izraz je v korelaciji s slabo prognozo v GC
MT2A je pogosto navzdol urejena v GC. Raziskati, ali je MT2A izražanja napovedni dejavnik v človeški GC, je MT2A protein izraz preučiti v podskupini, ki ga IHC barvanjem. Posamezni vzorci so bili opredeljeni kot nizko (MT2A-) ali visoko izražanja (MT2A +). MT2A- je bila povezana s slabim celokupno preživetje (slika 2A, P
< 0,001). Univariatna analiza je pokazala, da nekateri dejavniki, vključno z zmanjšano MT2A izraz (P
< 0,001), TNM fazi (P
< 0,01), globina tumorja (P
< 0,05), stanje limfnih vozlov (P
< 0,05), oddaljenih metastaz (P
< 0,001) in stopnja diferenciacije (P
= 0,011) so povezana s slabim preživetja (tabela 1). Cox multivariatna analiza je pokazala, da je bilo celotno preživetje povezano z MT2A izražanja (MT2A + primerjavi MT2A- razmerja ogroženosti [HR], 0,429; 95% CIS 0.187-0.683; P
= 0.002, Tabela 2). Ocenili smo potencialno klinični pomen MT2A s korelacijo svoj izraz vzorec s kliničnimi parametri (Dodatni datoteki1: Tabela S4). MT2A razstavljen obsežen pozitivno korelacijo z diferenciacijo tumorja (P
< 0,001) in inverzna korelacija s stopnjo TNM (P
= 0,05). Ti rezultati kažejo, da je MT2A korelaciji s kliničnimi patološkimi lastnostmi in preživetje pri bolnikih GC. Slika 2: Analiza kombiniranih MT2A s stopnjo TNM napovedati rezultatov kliničnih raziskav v GC. Kaplan-Meier Analiza celokupnega-preživetje MT2A izraz je bil uporabljen v skladu s stopnjo TNM. A, prognostični vrednost MT2A izraza pri bolnikih GC je koristi za napovedovanje izida bolnikov, je bila nizka izraz MT2A povezana s slabim skupnega preživetja (P <
0.01); B, TNM faza je bila korist za prognostično napoved pri bolnikih GC. C D, prognostični vrednost MT2A v TNM fazi I-II in stadijem III-IV (P
= 0,048, P <
0.001, v tem zaporedju); E F, prognostični vrednost MT2A izražanja v bezgavkah metastaz ali ne (P
< 0,001, P
= 0,052, v tem zaporedju); G. prognostični vrednost MT2A izražanja v nobenem oddaljenih zasevkov podskupini (n = 232, P
< 0,001); H. prognostični vrednost MT2A v PT3-PT4 podskupine (P
< 0,001). Vsi podatki kažejo, da bi lahko MT2A učinkovit prognostični podpis.
Tabela 2 Cox regresijska analiza clinicopathological značilnosti in molekularne podpisov v GC
multivariatne analize
kovariablo s končno točko

razmerje tveganj
95% CI
P-
vrednost
starost ≥ 60 let
1.300
0,840 do 1.934
0,254
Sex
0.823
0,499 do 1.233
0,292
Diferenciacija
0,753
0.509 do 1.778
0,875
tumorje invazivno globino
1,914
1,389 do 2,638
< 0,001
limfnih stanje vozlišča
1,291
1,034-1,612
0.024
Distant metastaze
2,595
1,332-5,056
0.005
MT2A
0,429
0,187-0,683
0.002
IκB-α
0,779
0,524-1,311
0,423
p-IκB-a
1,857
1,256 do 2.912
0,003
prognostični pomen MT2A kombinaciji s stopnjo TNM pri bolnikih GC
za dodatno pojasnitev MT2A izraza v prognostičnega pomena, smo združili MT2A izraz z clinicopathological funkcije v GC. Cilj je bil oceniti prognozo bolnikov GC s patološko klasifikacijo, in raziskati, ali bi bilo patološko klasifikacijo se dalje razvrščajo bolj natančno napovedovanje rezultata. Kot je prikazano v dodatni datoteki1: Tabela S4, MT2A izraz v GC je bila povezana s stopnjo TNM in diferenciacijo tumorja, kar pomeni, da lahko MT2A potencialni molekularno biomarker napovedati patološko klasifikacijo v GC. Kot dihotomno spremenljivki, so bili tako MT2A in stopnja TNM neodvisni napovednika za preživetje (Tabela 2, Slika 2A in B). Prognostični pomen MT2A izražanja je nadalje analizirani pri bolnikih GC v skladu s sistemom razvrščanja pTNM. Tam je bila velika razlika v celotnem preživetju med bolniki z MT2A izražanja tako v začetku leta (I in II) in napredni (III in IV) skupin fazi (P
= 0,048 in P
< 0.001, v tem zaporedju; 2C in D). Poleg tega je učinkovit za prognozo na istih stopnjah (P
= 0,052, slika 2E tudi stanje MT2A izraz; P
< 0,001, slika 2F; P
< 0,001, slika 2G in P
< 0,001, slika 2H). Ti podatki predstavljajo, da je MT2A molekularni podpis napovedati rezultatov kliničnih raziskav, ki temelji na odru TNM.
Obnova MT2A rezultatov izražanja pri zatiranju rasti GC celic in vitro
in vivo
Za prikaz mehanizma od MT2A v PK, imamo stabilno transfektirali MT2A prekomerno izražen plazmida in prazen vektor v tri GC celičnih linijah (BGC823, SGC7901 in AGS). Proučili smo rast, stopnjo apoptoze in celic cikel teh celičnih linijah transfekciji s MT2A plazmida. preživetja celic se je zmanjšala v GC celice ponovno izraža MT2A uporabo MTT testom (BGC823, P
= 0,0038, slika 3B; AGS, P
= 0,0007, Dodatna datoteka1: Slika S3A, SGC7901, P
= 0,0004 , Dodatne datoteka1: Slika S3C). Za nadaljnjo preiskavo funkcijo MT2A v GC celičnih linijah, smo analizirali učinke MT2A izražanja na celično proliferacijo in regulacijo celičnega ciklusa po aneksin-V /PI barvanja in pretočno citometrijo analize. Več apoptoza je bila odkrita v teh GC celice ponovno izraža MT2A (P
< 0,01, oziroma Slika 3F; Dodatna datoteka1: Slika S3A in C). Poleg tega je G2 /M aretacija opazili GC celicah z uporabo zunajmaternično ekspresijo MT2A. Razmerja G2 /M faza MT2A skupinah so bile dvakrat višje od tistih v vektorski skupine storil (P
< 0,01, oziroma, Slika 3E in dodatna datoteka1: Slika S3B in D). Slika 3 zunajmaternična izraz MT2A zavira GC rast celic in vitro in in vivo. MT2A zaviral proliferacijo celic in tvorbo kolonij v GC celic. A, Western blot za MT2A je bila odkrita v BGC823 celicah transfekciji s zunajmaternične izražanje MT2A plazmida in prazen vektor. so bili skenirani beljakovinsko trakovi MT2A (normalizirana na beta-aktin za nadzor za nakladanje). B, je Cell širjenje analizirajo z MTT testom v ponovno izraža MT2A od BGC823 celic ali ne. Podatki so prikazani kot povprečje ± .SD treh neodvisnih poskusov. C, je bila rast BGC823 celic analizirali v poltrdnega mehko gojišča. Prazne vektorske kolonije nastala statistično značilno več kolonij (pomeni = 426 velike kolonije na krožnik 95% CI:. 387-472 kolonije) kot MT2A klonov (pomeni = 136 kolonij 95% čujejo:.. 100-164 kolonije številke predstavljajo povprečje število kolonij treh neodvisnih poskusov ± SD je relativno število, izračunano v nadzornih in BGC823-MT2A celic in analizirana z Studentov t
-test (P
= 0,0038). D, MT2A zaviral tumorogenosti od BGC823 celic . v golih miših povprečni volumen tumorja za BGC823-MT2A na 3 tedne po injiciranju je bila 112 mm3 (95% KI: 93-147 mm3), v primerjavi z 352 mm3 (95% CI: 298-423 mm3) za BGC823-Vector. podatki predstavljajo povprečje ± SD volumna tumorja, ki izhaja iz vsake skupine. V vsaki skupini je bilo velikosti tumor meri z uporabo čeljusti na označenih časovnih točkah. podatki so prikazani kot povprečje ± SD (t
testni odkrivanje, P
= 0,0027) E FACS analize so pokazale, da MT2A prekomerno ekspresijo privedlo do G2 /M prijetje in razmerje G2 /M faza je bila višja kot v prazne celice kontrolnih in matičnim (P <
0.01). F protitumorskega učinka MT2A bila odkrita aneksin V /FITC-PI barvanja testu. Odstotek apoptotskih celic je bilo v skupini MT2A 52,9% ± 5,4% v primerjavi s tistimi v matičnih celic (8,3% ± 2,4% in celic, transfektiranih s praznim vektorjem (8,2% ± 3,7%, P
. ≪ 0,001)
Poleg tega smo prevlečeni BGC823 celice zatiranje MT2A ali ne v mehko agar je zunajmaternične izraz MT2A potrjuje zahodni blot analizo prvi (slika 3A). Po 3 tednih kultura MT2A izražanja povzročil statistično značilno zmanjšanje tvorbe kolonij (p
= 0,0053, slika 3C). Poleg tega se je dramatično zaviranje rasti MT2A ponovno izražajo celic v primerjavi z negativno kontrolo (P
= 0,0027, slika 3D) v modelih ksenotransplantskih. Ti podatki kažejo, da MT2A lahko igrajo pomembno vlogo pri preprečevanju širjenja GC celic in vitro
in vivo
.
MT2A zatira NF-κB aktivnosti skozi IκB-a do regulacije PODJETJA
poročali je bilo, da je izguba MT2A inducirane NF-κB aktivacijski signal v transgenetic miši modelu (MT2A-knock out) [15]. Toda vloga MT2A kot prijatelja ali sovražnika v NF-κB signala pot je še vedno sporen [18, 33]. Za razlago mehanizem MT2A posredovane GC zatiranje rasti celic in vivo
in vitro
, smo poskušali raziskati morebitno povezavo med MT2A in NF-κB signalne poti, in notranji mehanizem, je še vedno nejasno, v GC . MT2A in glavni geni v NF-κB signalizacijo, kot p65, IκB-a, p-IκB-a in efektor na nižji stopnji od NF-κB signalizacijo, ciklin D1 bili odkriti v tej študiji (Dodatni datoteka1). Zunajmaternična izraz MT2A inducirane tako mRNA in proteina izraz IκB-a v vseh preiskovanih GC celičnih linijah (BGC823, SGC7901 in AGS), so IκB-α mRNA v stanju dinamičnega ravnovesja v BGC823 celic povečala za 5,5-krat ponovno izražajo MT2A za 48 h. V letnem pregledu rasti in SGC7901 celicah, smo opazili 7,2-krat in 4,3-kratno indukcijo IκB-alfa mRNA (slika 4A), so relativne vsebnosti beljakovin v skladu z mRNA transkriptov in p-IκB-α beljakovin se je zmanjšala v tistih GC celice transfektiramo MT2A vektor (slika 4B). Kot je prikazano na slikah 4C in D, rasklapanje endogenega MT2A v GES1 celicah prišlo do zmanjšanjem števila IκB-alfa izražanja kot tudi up-regulacijo p-IκB-a in ciklin D1 izražanja, ki kažejo na povezavo med MT2A dejavnosti in IκB -α izraz. Ti poskusi kažejo, da MT2A inducira IκB-alfa izraz v mRNA in koncentracije proteina. In MT2A posredovano up-regulacijo IκB-alfa izražanja je nadalje potrdila imunofluorescenco (slika 5A, Dodatna datoteka1). Slika S1. Slika S2. Slika S3. Slika S4. Slika S5. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Izrazi COX-2 in VEGF-C pri raku želodca: korelacije z limfangiogenezo in prognostičnih posledice
• Downregulation za SPARC izražanja zmanjšuje raka želodca celično invazijo in preživetje