Epidermal tillväxtfaktorreceptor strukturella förändringar i magcancer

Epidermal tillväxtfaktorreceptor strukturella förändringar i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
EGFR överuttryck har beskrivits i många humana tumörer inklusive magcancer. I NSCLC patienter somatiska EGFR-mutationer, inom kinasdomänen av proteinet, samt genförstärkning var associerade med en god klinisk respons på EGFR-hämmare. I gastric tumörer uppgifter om strukturella förändringar av EGFR är fortfarande kontroversiell. Med tanke på dess möjliga terapeutiska relevans, syftar vi att bestämma frekvensen och typen av strukturella förändringar av EGFR
genen i en serie av primära gastriska karcinom.
Metoder
Direkt sekvensering av kinasdomänen i EGFR
genen utfördes i en serie av 77 primära gastriska karcinom. FISH-analys utfördes i 30 fall. Associationsstudier mellan EGFR
förändringar och de kliniska patologiska egenskaperna hos tumörerna utfördes.
Resultat
Inom 77 primära gastriska karcinom vi hittade två EGFR
somatiska mutationer och flera EGFR
polymorphisms i exon 20. Sex olika intronsekvensvarianter av EGFR
konstaterades också. Fyra gastriska karcinom visade balanserad polysomy eller EGFR
genamplifiering. Vi kontrollerade att magcancer med förändringar av EGFR
(somatiska mutationer eller antalet exemplar variation) visade en signifikant ökning av tumörstorlek (p
= 0,0094) i jämförelse med vild-typ EGFR
karcinom.
slutsats
Vi visar att EGFR
strukturella förändringar är sällsynta i gastrisk karcinom, men närhelst närvarande, leder det till tumörtillväxt. Vi ansåg att söka efter EGFR
förändringar i magcancer är sannolikt att vara kliniskt viktiga för att identifiera patienter som är mottagliga för svara på tyrosinkinashämmare.
Bakgrund
Gastric cancer fortfarande den näst vanligaste orsaken till cancerdöd worldwide [1] ett scenario som belyser behovet av mer specifika och effektiva behandlingar. De exakta mekanismerna bakom gastric cancer är ännu inte helt klarlagt, men det finns tecken pekar på en förening med involverade i utvecklingsprocesser [2]. Nyckel molekyler av dessa vägar är de receptortyrosinkinaser (RTK), som finns att onormalt aktiverade eller överuttrycks i ett antal olika tumörer och därför representera lovande mål för terapeutisk intervention.
Medlemmarna i RTK superfamiljen av eröB-receptorer är glykoproteiner som består av en extracellulär domän där bindningen av ligander sker, en kort lipofil transmembrandomän och en intracellulär domän som bär tyrosinkinasaktiviteten [3, 4]. De uttrycks i flera vävnader av epitel, mesenkymala och neuronal ursprung, där de spelar avgörande roller i utveckling, proliferation och differentiering. Avreglerad expression av erbB-molekyler, nämligen erbB2, har varit inblandad i utvecklingen av många typer av tumörer, inklusive gastriska tumörer. I magkarcinom det har visats att erbB2-överuttryck drivs av genförstärkning och är associerad till karcinom med hög invasiv potential [5]. ErbB1, mer känd som epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), har överuttryck beskrivits i många humana tumörer, innefattande lunga, kolon, bröst, prostata, hjärna, huvud och nacke, sköldkörteln, äggstockar, urinblåsa, njure och även magcancer [6 -11], och har satts i samband med avancerad tumörstadium och dåligt kliniskt utfall. Helt nyligen visade vi att EGFR-aktivering är associerad med förlust av funktion av E-cadherin, in vitro
[12].
Mekanismerna för onkogena omvandling av EGFR i cancer inkluderar amplifierade kopietal, strukturella omlagringar av receptorn och aktiverande mutationer [13]. EGFR-mutationer kluster i kinasdomänen av EGFR (exoner 18-21), och orsaka ligandoberoende aktivering av receptorn, representerande möjliga mål för terapeutisk intervention. I detta avseende, somatiska EGFR-mutationer samt genamplifiering hos patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) korrelerar starkt med det kliniska svaret på tyrosinkinashämmare [14, 15].
I gastric tumörer, uppgifter om strukturella förändringar av EGFR är fortfarande kontroversiell. Med tanke på dess möjliga terapeutiska betydelse i denna studie vi syftar till att klargöra betydelsen av EGFR strukturella förändringar i gastric cancer genom att analysera en serie av primära gastriska karcinom för antal kopior och mutationer i tyrosinkinasdomänen (exoner 18-21) av EGFR Metoder
genen. Bild Case val och histopatologisk klassificering av tumörerna
Representativa block av 77 formalinfixerade, paraffininbäddade humana gastriska primära tumörer hämtas från Department of Pathology sjukhuset S. João efter informerat samtycke av patienterna. Patienterna informerades om att tumörmaterial skulle endast användas för forskningsändamål. Ingen av patienterna som ingår i den nuvarande serien hade en familjehistoria av magcancer. H & E- färgade sektioner användes för att kategorisera tumörer enligt klassificeringen av Lauren och Ming. Penetration av magväggen och närvaron och lokaliseringen av lymfkörtelmetastaser har noterats för alla patienter som använder standardkriterier för patologisk iscensättning. Orcein-färgade snitt användes för detektion av vaskulär invasion.
EGFR Mutation Screening
Genomiskt DNA extraherades från 10 ^ m sektionen efter microdissection av tumör områden för att säkerställa en renhet av minst 70% av neoplastiska celler. DNA-extraktion utfördes med användning av genomiskt DNA Purification Kit (Gentra System) i enlighet med tillverkarens protokoll. Exon-specifika primrar designades och DNA underkastades PCR-amplifiering av exoner 18, 19, 20 och 21. De fyra EGFR
exoner kod för tyrosinkinasdomänen av EGFR. Primersekvenser visas i tabell 1.Table 1 Primrar som användes för PCR-amplifiering av EGFR-kinasdomänen
Exon

Primer Sequence
PCR-produkt storlek (bp)
Exon 18
Framåt
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Omvänd
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
Framåt
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Omvänd
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Omvänd
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
Forward
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Omvänd
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PCR-produkter kördes på en 2% agarosgel och PCR amplifierade banden extraherades från gelén med gel band Purification Kit (GE Healthcare). Proven underkastades sedan renades och sekvenserades med användning av ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA) enligt tillverkares instruktioner och en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Resultaten analyserades med hjälp av 3100 datainsamlingsprogram. Sekvensering utfördes på båda strängarna. I fall med misstänkt mutationer PCR-amplifiering upprepades och provet återsekvenserades för att utesluta PCR-artefakter.
EGFR Copy Number Variation Screening sälja The paraffinblock snittades på 5 ^ m och vävnadssektioner torkades vid 60 ° C under 30 minuter. Objektglasen deparaffinised och tvättades följt av en förbehandling och en uppslutningssteg med användning av pepsin och slutligen uttorkad. LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (Vysis ®), optimerad för att detektera bandområdet 7p12 i spektrum orange och centromer av kromosom 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) i spektrum grönt, både i interfaskärnor och på metafaskromosomer, användes. Fem

• Bandad gastric bypass - fyra års uppföljning i en prospektiv multicenter analysis
• Utarmning av OLFM4 genen hämmar celltillväxt och ökar sensibilisering för väteperoxid och tumörnekrosfaktor-alfa framkallad-apoptos i magcancer cells