receptor epidermalnog faktora rasta strukturne promjene u želučanom cancer

receptora epidermalnog faktora rasta strukturnih promjena u karcinomu želuca
apstraktna pregled Pozadina
EGFR prekomjerna ekspresija je opisana u mnogim ljudskim tumorima, uključujući rak želuca. U NSCLC bolesnika somatskih EGFR mutacije unutar kinazne domene proteina, kao i pojačavanje gena su bili povezani s dobrom kliničkom odgovoru na inhibitore EGFR. U želučanih tumora podacima o strukturne promjene EGFR ostaje kontroverzno. S obzirom da je moguće terapijski značaj, nastojali smo utvrditi učestalost i vrste strukturnih promjena EGFR pregled gena u nizu primarnih želučanog karcinoma.
Metode
Izravna sekvenciranje kinaze domene EGFR
gen je izvedena u nizu 77 primarnih želučane karcinoma. Analiza FISH provedena je u 30 slučajeva. su provedene studije o pridruživanju između EGFR pregled izmjena i kliničke patološke značajke tumora. pregled Rezultati
Unutar 77 osnovnih želučanog karcinoma smo pronašli dva EGFR pregled somatske mutacije i nekoliko EGFR pregled polimorfizama eksona 20. Šest različitih intronske varijante sekvence od EGFR pregled također su pronađeni. Četiri želučani karcinom pokazala uravnotežen polysomy ili EGFR pregled gena pojačanje. Utvrdili smo da je karcinom želuca s izmjenama EGFR pregled (somatskih mutacija ili kopirati broj varijacija) su pokazali značajno povećanje veličine tumora (p
= 0,0094) u odnosu na divlji tip EGFR pregled karcinoma. pregled Zaključak pregled smo pokazati da EGFR pregled strukturalne promjene su rijetke u želučanom karcinomu, ali kad god su prisutni, to dovodi do rasta tumora. Smatrali smo da je u potrazi za EGFR pregled promjena u raka želuca je vjerojatno da će biti klinički važna kako bi se utvrdili pacijenata osjetljivih odgovoriti na inhibitorima tirozin kinaze. pregled Pozadina pregled, raka želuca ostaje drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu [1] scenarij koji naglašava potrebu za više specifičnih i učinkovitih terapija. Točni mehanizmi u podlozi želučane karcinogeneze još nisu u potpunosti razumio, ali dokazi upućuju na povezanost s putova uključenih u razvojnim procesima [2]. Ključnih molekula ovih puteva su receptor tirozin-kinaze (RTK), koji se nalaze se neprirodno aktiviran ili prisutan u različitim tumora i stoga predstavljaju obećavajuće mete za terapijsku intervenciju.
Članovi RTK nadobitelji receptora erbB su glikoproteini koji se sastoje od izvanstanične domene gdje vezanje liganada odvija, kratki lipofilni transmembranski domenu, te unutarstanični domena nosi aktivnost tirozin kinaze [3, 4]. Oni su izražene u nekoliko tkiva epitela, mesenchvmal i neuronske porijekla, gdje se igraju ključne uloge u razvoju, proliferacije i diferencijacije. Deregulirani ekspresiju erbB molekula, a to su erbB2, je impliciran u razvoju brojnih tipova tumora, uključujući i želučanih tumora. U želučanom karcinoma pokazano je da prevelika ekspresija erbB2 pokreće amplifikacije gena i povezana s karcinomom s visokim invazivni potencijal [5]. ErbB1, poznatiji kao receptor faktora rasta (EGFR), prekomjerna ekspresija je opisana u mnogim ljudskim tumorima, uključujući pluća, debelog crijeva, dojke, prostate, mozga, glave i vrata, tiroidni, jajnika, mokraćnog mjehura, bubrega i također želuca [6 -11], te je u korelaciji s uznapredovalom stadiju tumora i slabom kliničkom ishodu. Nedavno smo pokazali da aktivacija EGFR je povezan s gubitkom funkcije E-kadherina, in vitro pregled [12].
Mehanizme onkogenim pretvorbu EGFR kod raka uključuju pojačan broj kopija strukturne premještanje receptora i aktivacija mutacija [13]. EGFR mutacije skupina na kinazne domene EGFR (eksona 18-21), te uzrokuje ligand-ovisnu aktivaciju receptora, predstavljaju mogući ciljevi za terapijsku intervenciju. U tom pogledu, somatske mutacije EGFR kao pojačanje gena u bolesnika s ne-malih stanica pluća (NSCLC) visoko korelira s kliničkom odgovoru na inhibitorima tirozin kinaze [14, 15].
U gastričnih tumora, podacima o strukturna preinake EGFR ostaje kontroverzno. S obzirom da je moguće terapijski značaj, u ovom istraživanju željeli smo pojasniti važnost EGFR strukturnih promjena u želučane karcinogeneze analizom niza primarnih želučanog karcinoma za broj kopija i mutacije u domeni tirozin kinaze (eksona 18-21) od EGFR pregled, gen. pregled metoda
odabir kućišta i patohistološko klasifikacija tumora
Reprezentativni blokova 77 formalinom fiksna, uklopljeno u parafin ljudskim primarnim tumorima želuca dobivene su iz Odjela za patologiju bolnice S. João nakon informirani pristanak pacijenta. Pacijenti su bili informirani da je tumor materijal se koristiti samo u svrhu istraživanja. Nijedan od pacijenata uključenih u ovom nizu je imala obiteljsku povijest raka želuca. H &E- obojeno sekcije su korištene za kategorizaciju tumora prema klasifikacijama Lauren i Ming. Prodiranje kroz želučanu stijenku i prisutnost i lokalizaciju metastaze limfnih čvorova zabilježene su za sve pacijente koji koriste standardne kriterije za patološku inscenacije. Orcein-obojene sekcije korištene su za određivanje vaskularne invazije.
EGFR mutacija Screening pregled Genomska DNA bila je ekstrahirana iz 10 um dijela nakon mikrodisekcijom tumorskih područja kako bi se osigurala čistoća od najmanje 70% neoplastičnih stanica. Ekstrakcija DNA provedeno je pomoću genomska DNK Purification Kit (Gentra System) u skladu s uputama proizvođača. Eksona specifični primeri konstruirani i DNA je podvrgnuta PCR eksona 18, 19, 20 i 21. Četiri EGFR
eksona broj za domenom tirozin kinaze EGFR. Sekvencijama prikazani su u tablici 1.Table 1 klica korištenih za PCR domene EGFR kinaze pregled egzona
pregled, početni odsječak
PCR veličine proizvoda (bp)
egzona 18
Naprijed pregled TGGGCCATGTCTGGCACTGC pregled 283 pregled unazad
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
eksona 19
Naprijed
TCACTGGGCAGCATGTGGCA pregled 241 pregled unazad
CAGCTGCCAGACATGAGAAA pregled eksona 20
Naprijed
CCTTCTGGCCACCATGCGAA pregled 295 pregled unazad
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
eksona 21
Naprijed
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT pregled 265 pregled unazad
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PCR proizvodi su razdvojeni na 2% agaroznom gelu i PCR umnoženi bendovi su izvađeni iz gela s gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Uzorci su zatim pročišćeno i sekvencionirani uporabom ABI Prism dGTP BigDye Terminator brzi odgovor Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA) po uputi Proizvodnja je i ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). Rezultati su analizirani upotrebom 3100 prikupljanje podataka softver. Sekvenciranje je provedeno je u obje niti. U slučajevima za koje se sumnja mutacija PCR amplifikacija je ponovljen, a uzorak je ponovno redoslijedom kako bi se isključila PCR artefakte.
EGFR Copy broj varijacija Screening
parafinski blokovi su prerezani na 5 um i tkiva sekcije su osušeni na 60 ° C tijekom 30 minuta. Stakalca su deparaffinised i isprana nakon toga predobrade i korak digestije pomoću pepsin i konačno dehidracije. LSI EGFR Dual Color Probe-Hib Set (VYSIS ®), optimiziran za otkrivanje područje trake 7p12 spektra naranče i centromere kromosoma 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) u spektru zelene, i u međufaznim jezgrama i na metafazi kromosoma, korišten. Pet ul sonde su naneseni na svako stakalce. Denaturacije je provedena na 80 ° C tijekom 8 minuta, nakon čega slijedi hibridizacijom na vlažnoj komori na 37 ° C tijekom 16 sati. Nakon hibridizacije, stakalca su isprana i inkubirana sa 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) za obojenje jezgre. Za ocjenjivanje, šezdeset do 100 netaknut međusloja jezgre analizirane su dvije neovisne promatrače kako bi se rezultat signale za kromosomu 7 centromere i EGFR genu. Okolina limfociti i normalno sluznica se koristi kao unutarnje kontrole kvalitete za analize. Najmanje su odabrane dvije ili tri reprezentativna područja na maligne stanice, pod amplifikacije polje 100 × /200 ×, brojati jezgre signale. Nakon pregleda pod 400 × pojačanja u, signali su tada broje pomoću zaštitno ulje (1.000 ×). Pregled, Statistička analiza pregled studija o pridruživanju između EGFR izmjenama i kliničkopatološkim obilježjima slučajeva su provedena samo u 30 slučajeva (tumora analizira na EGFR mutacije i EGFR broj kopija varijacije). Statističke analize su ocijenjeni od strane testa x2 ili Studentov t
test. P pregled vrijednost. ≪ 0,05 smatrana je statistički značajna pregled Rezultati
EGFR mutacije Screening Netlogu od 77 želučanog karcinoma analiziranih, EGFR pregled mutacije u eksona 18-21 otkrivene su u 2,6% (2/77) slučajeva (sl. 1). Jedna mutacija pripadao eksona 20 i bio missens mutaciju (2300 C > T) dovode do supstituciji alanin 767 za valina. Druga mutacija utjecati ekson 21 i bio je missense mutacija (2524 NHRA G) koji vodi do substituition u asparagin 842 s aspartatnom kiselinom. Nitko od mutacije su prethodno opisano. Nema slijed promjene nađene su u eksona 18 i 19. Na slici 1 strukturnih promjena u EGFR. (A) izravno sekvenciranje prikazuje jednu od mutacija u kinazne domene EGFR - Missense mutacija (2300 C > T) u eksonu 20, što dovodi do supstituciju alanin 767 za valina. (B) Difuzni karcinom želuca s EGFR povećanom broju kopija uzrokovane kromosoma 7 polysomy. (C) neoplastične stanice koje pokazuju pojačanje gena uz formiranje nakupina s brojnim signala za EGFR.
Nekoliko egfr polimorfizma su pronađeni u eksonu 20 (Tablica 2). Polimorfizam 2361G > Gln787Gln, prethodno opisali Mu sur pregled [16], bila je prisutna u 55,8% (43/77) slučajeva, te u devet od 43 slučajeva u homozigotnom stanju. prikazan smo 50 normalne kontrole i 2361G > Gln787Gln bio prisutan u 82% u kontrolnoj grupi (41/50). Dva druga EGFR tihe mutacije (The 2301 C > T Ala767Ala i 2415 C > T His805His) pronađeni su u eksona 20, niti jedan od njih je prethodno opisano. Obje promjene pronađeni su u jednom slučaju i bili odsutni u normalnim controls.Table 2 slijedu promjena pronađenih izravnim sekvenciranje pregled pregled promjenom
pregled Upišite
frekvenciji
Reference
egzona 18 pregled, 2184 + 19 g > A
intronske varijantu pregled 2/77 Netlogu Ensembl pregled SNP rs17337107 (dbSNP126) [17] pregled egzona 19 pregled 2185-9 C > G pregled intronske varijanti pregled 1/77 Ne
još opisan pregled 2283 + 11 G >A pregled intronske varijanta pregled 1/77 Ne
još opisano pregled 2283 + 47 G > pregled intronske varijanta pregled 1/77
još nije opisan pregled 2283+ 49 C > T pregled intronske varijanti pregled 1/77 Ne
još opisan pregled eksona 20 pregled 2284-60 C > T
intronske varijantu pregled 2/77 pregled Ensembl pregled SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C >T pregled misscnsc Ala 767 Val pregled 1/77
još nije opisan pregled 2301 C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
još nije opisan pregled 2361G > pregled Silent Gln 787 Gln
43/77
[16]
2415 C > T pregled Bez zvuka His 805 Njegov pregled 1/77
još nije opisan pregled eksona 21 pregled, 2524 A > g pregled Missense Asn 842 Asp pregled 1/77
još nije opisan pregled našli smo šest drugačiji slijed varijante lokaliziran u intronske regijama EGFR, dva od njih su prethodno opisani u Ensembl [17]. pregled EGFR Copy broj varijacija Screening pregled analiza EGFR pregled broju kopija, po procjeni fluorescentne in situ hibridizacije (FISH), jedino je moguće u 30 od 77 slučajeva analiziranih za EGFR mutacije. Sve EGFR pregled signali su u odnosu na signale za centromerni proba za kromosomu 7. Više od 2,0 EGFR pregled kopije po stanici (uravnoteženom polysomy ili amplifikacije gena) su otkrivene u 13,3% (4/30) slučajeva. Od četiri slučajeve koji pokazuju više od 2 primjerka EGFR Netlogu po kromosomu 7, tri povećao broj kopija, zbog polysomy a jedan je amplifikacija gena, difuzni karcinom želuca, izlaže stvaranje klastera s brojnim signalima za EGFR Netlogu (sl. 1 B, C). pregled EGFR promjene u strukturi i kliničko parametri pacijenata i tumora pregled Tablica 3 prikazuje statističke povezanost između EGFR izmjenama i kliničko karakteristikama bolesnika i tumora. Kada se uspoređuju karcinom želuca skrivanje EGFR promjene s karcinomima s normalnim EGFR statusa ili broja kopija, gledali smo značajnu povezanost između EGFR strukturnih promjena i povećane veličine tumora. (P pregled = 0,0094). Nema značajne udruge su pronađene između EGFR promjenama i drugim kliničko parametara bolesnika i tumora, a to su spol i dob bolesnika, tumor lokalizaciju, histološkom tipu, penetracija zida, uz prisustvo limfnih čvorova metastaza, vaskularne invazije i stupnjevanje tumora tumora .table 3 Udruga EGFR gena promjene s kliničkopatološkim parametrima pregled kliničkopatološkim parametri
EGFR status

Pojačanje /mutacija (n = 6)
Normal (N = 24)
Ukupno (n = 30)
p pregled vrijednost
Sex (Ž /M)
1/5 pregled 10/14 pregled 11/19 pregled 0.2557 pregled Dob (SD) pregled, 62,3 ± 14,1 pregled 56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2 pregled 0,4271 pregled tumora lokalizacija pregled 0.8548
proksimalnom
3 pregled, 11 pregled, 14
distalni
3
13
16
Veličina (SD) pregled, 11,6 ± 9,8 pregled, 5,8 ± 2,0 pregled, 6,9 ± 5,0 pregled, * 0,0094 pregled Lauren je klasifikacija pregled 0,1261 pregled crijeva
1
12 pregled, 13 pregled difuznu pregled 5
9
14 pregled Atipični
0 pregled 3
3
zid penetracija pregled 0,4642 pregled Rano (T1) pregled, 0 pregled 2 pregled, 2 pregled, Advanced (T2-T4) pregled, 6
22 pregled, 28 pregled vaskularnog Invazija
0.7125
odsutna ( N0)
3 pregled, 14 pregled, 17
prisutan (N = 1) pregled 3 pregled, 10 pregled, 13 pregled limfnih čvorova metastaze pregled 0.1921
odsutna
1 pregled 11 pregled, 12 pregled Prisutni pregled 5
13 pregled, 18 pregled inscenacije
0,3845 pregled sam
1 pregled 7
8 pregled II pregled, 0 pregled 5
5 pregled III pregled 5
11 pregled, 16 pregled IV pregled 0
1 pregled 1
Rasprava pregled EGFR gena nalazi se na kromosomu 7p12 i kodova za 170-kDa receptora, prisutna u membranama stanica kao neaktivne monomera. Nakon vezanja liganda za vanstaničnu domenu, receptor prolazi konformacijske promjene, dimerises i postaje autophosphorylated u ključnim tirozinskih ostataka u intracelularne tirozin kinaze (TK) domene. To dovodi do aktivacije nizvodne puteve koji kontroliraju preživljavanje stanica, inhibiciju apoptoze i proliferacije [18].
Mnogo pažnje privlači onkogenog efekta EGFR i prije svega za uspjeh EGFR ciljnih terapija, koje su dobro osnovana za ne malih plućnih stanica karcinoma. Uloga EGFR kod raka želuca je vrlo kontroverzna. Neki autori su izvijestili da EGFR koji je visoko izražen u karcinomu želuca, što ukazuje na njegove prikladnosti meta za inhibitori receptorske tirozin kinaze [19, 20]. S druge strane, Takehana i kolege izvijestili da je prekomjerna ekspresija receptora epidermalnog čimbenika rasta je rijedak događaj u želučanom karcinomu [21] i nastaje uglavnom zbog pojačanja EGFR gena, što potvrđuje rezultate iz prijašnjih studija [22-24]. EGFR mutacije u primarnoj želučanog karcinoma ili želučanih staničnim linijama karcinoma nikada nisu prijavili [25-27]; ipak smo nedavno pokazali da nasljedne difuzni karcinom želuca povezane E-kadherina klica misscnsc mutacije dovode do povećane aktivnosti EGFR. pregled, na temelju toga, smatra se da je u potrazi za EGFR promjene u rak želuca, možda je važno identificirati terapije suspektnih slučajeva.
Ovdje smo izvješće prisutnost EGFR pregled povećanog broja kopija u 13,3% od 30 slučajeva u kojima FISH analiza bila moguća. Od četiri slučaja s povećanom broju kopija, samo jednom predstavio pojačanje gena, dok su preostala 3 slučaja pokazao polysomy kromosoma 7. Ovi rezultati podudaraju dosadašnja izvješća ispitivanjem broja EGFR kopiranja u rakom želuca [22-24]. Mutacijskih Analiza kinazne domene EGFR pokazala prisutnost mutacije u 2,6% od 77 želučane karcinoma. Identificirani mutacije su bili tipa missense i bili su prisutni u eksona 20 i 21 gena EGFR. Niti jedan od identificiranih mutacija je prethodno opisano i njihovo funkcionalno značenje još nije ocijenjen. Međutim, zbog njihove lokalizacije u kinazne domene EGFR, to je primamljiva nagađati da oni utječu na aktivnost receptora i stoga pacijenti nose ove odgovore EGFR mutacije mogu imati koristi od inhibitore tirozin kinaze kao terapijskog pristupa.
Osim ovih mutacija identificirane su i drugi slijed promjene, a sve klastera u eksona 20. EGFR polimorfizma 2361 G > a (prethodno opisano u Ensembl) pojavljuje se u velikom postotku slučajeva i kod normalnih kontrola. Nasuprot tome, druga dva još nije opisana tihe inačice u eksonu 20 (2301 ° C > T, 2415 C > T) su prisutna u normalnim kontrolama. Osim ovih EGFR slijed varijante u kodiranju regije, također su identificirali varijacije u intronske slijedu bočni eksona 18, 19 i 20, ali je njihov funkcionalni učinak ostaje nejasno.
Povezanost kliničkih parametara za slučajeve za koje oboje mutacija i FISH analiza bila moguća, pokazala značajnu povezanost između EGFR izmjenama i veličine tumora. Zanimljivo je da su svi slučajevi s promjenama u EGFR (pojačavanje /mutacije) su karcinomi već okupatorski bazalnu membranu i šire u želučanu stijenku (T2-T4), što ukazuje da promjene tog gena mogu dati invazivni ponašanje na maligne stanice. Pregled Međutim, ta hipoteza treba pojasniti daljnjim ispitivanjima, jer nismo potvrdili statistički značajnu korelaciju između EGFR promjenama i invazije na želučanu stijenku (p = 0.4642), kao što smo upravo analizirani vrlo nizak broj ranih želučanog karcinoma ( n = 2) u seriji. Obje su rezultati u skladu s izvješćima Hirono sur pregled., 1995. [23] i Tsugawa sur pregled., 1998. [24], što upućuje da EGFR je uključen u rast tumora i pokretanje promjena može biti kasno događaj koji su uključeni u progresiji tumora.
Iako je pronađen ni jedan drugi statistički značajna povezanost, zanimljivo je primijetiti da EGFR promjene se javljaju uglavnom u karcinomima difuznog tipa. Prisutnost EGFR promjene u difuznim karcinoma je u suprotnosti s onim što je prethodno spomenuto i za druge članove obitelji receptora erbB u raka želuca. U želučane erbB2 karcinom pojačanje otkrivena je pretežno u crijevnih karcinoma želuca
[5]. Zaključak Netlogu Zaključno, u ovom istraživanju smo pokazali da EGFR aktiviraju promjene nisu česta pojava u želučanoj karcinogeneze. Promjene pretežno pojavljuje u želučanim karcinoma difuznog podtip, a povezani su s veličinom tumora. Unatoč niskoj frekvenciji EGFR promjena, naši rezultati također pokazuju da postoji ograničena skupina odabranih želučanih bolesnika koji bi mogli imati koristi od ne konvencionalne terapije, uključujući farmakološke inhibitorima EGFR receptora. Pregled Bilješke
Catia Moutinho, Ana R Mateus doprinijeli jednako na ovom poslu pregled deklaracija
Zahvale pregled Ova studija je financiran od strane potpore iz Fundação para Ciência ea tecnologia, Portugal (SFRH /BD /16747/2004, Poci /SAU -. OBS /57670 /2004 i PTDC /SAU -. OBD /64319/2006)
autora originalne dostavljeni datoteke za slike
Ispod su linkovi na autora originalnih dostavljenih datoteka za slike. 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf autora izvorna datoteka za Slika 1 suprotstavljenih interesa
autor (i) izjaviti da oni nemaju konkurentne interese. Pregled

• Povezan želučanu premosnicu - četiri godine pratiti u istraživačkoj multicentričnoj analysis
• Iscrpljivanje OLFM4 gena inhibira rast stanica i povećava osjetljivost prema vodikovom peroksidu i čimbenik tumorske nekroze alfa-inducirane apoptoze u stanicama raka želuca