Epidermio augimo faktoriaus receptorių struktūriniai pakitimai skrandžio vėžio

Epidermio augimo faktoriaus receptorių struktūriniai pakitimai skrandžio vėžio
tezės
Background pervežimas EGFR ekspresija buvo aprašytas daugelyje žmogaus navikų, įskaitant skrandžio vėžio. NSLPV pacientų somatinės EGFR mutacijų, kaip apibrėžta kinazės domeno baltymo, taip pat geno ekspresija buvo susijęs su gerai klinikiniu atsaku į EGFR inhibitorių. Skrandžio navikų duomenis apie struktūrinius pakeitimus EGFR išlieka kontraversiškas. Atsižvelgiant į galimas terapinis aktualumas, siekėme nustatyti dažnį ir tipą struktūrinių pakitimų EGFR
geno pirminių skrandžio karcinoma serijos.
Metodai
Tiesioginiai seka kinazės domeno dėl EGFR
genas buvo atliekamas 77 pirminių skrandžio karcinomos serijos. ŽUVYS analizė buvo atlikta 30 atvejų. buvo atlikta asociacijos tyrimai tarp EGFR
pokyčių ir klinikinių patologinių bruožų navikų.
rezultatai
Per 77 pirminių skrandžio karcinoma mes rado du EGFR
somatinės mutacijos ir keletą EGFR
polimorfizmas egzono 20. šešių skirtingų intronic seka variantai EGFR
taip pat buvo rasta. Keturi skrandžio karcinomos parodė subalansuotą polysomy arba EGFR
genų amplifikacija. Mes patikrino šią skrandžio karcinoma su pokyčiais EGFR
(somatinių mutacijų ar kopijų skaičiaus kitimas) parodė reikšmingą padidėjimą naviko dydis (p pervežimas = 0,0094) lyginant su laukinio tipo EGFR
karcinoma.
Išvada
Mes įrodyti, kad EGFR
struktūriniai pakitimai yra reti skrandžio karcinoma, bet kai dabar, tai veda prie naviko augimą. Mes laikoma, kad ieškome EGFR
pokyčių skrandžio vėžio gali būti kliniškai reikšmingas, siekiant nustatyti pacientus neatsparius reaguoti į tirozino kinazės inhibitorius.
Faktai
skrandžio vėžys išlieka antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje [1] scenarijus, kad pabrėžia, kad daugiau konkrečių ir efektyvių gydymo poreikį. Tikslios mechanizmus, sukeliančius skrandžio kancerogenezės dar nėra visiškai aiškus, tačiau faktai rodo, kad asociacija su keliais dalyvaujančių raidos procesų [2]. Pagrindiniai molekulės šių būdų yra tirozino kinazės receptorius (RTKs), kuri yra nustatyta, kad nenormaliai aktyvuotas arba ekspresija į navikų įvairovė, todėl atstovauti perspektyvius tikslus terapinės intervencijos.
Iš RTK superfamily iš erbB receptorių nariai glikoproteinai, kurį sudaro ekstraląstelinės domeno, kur surišimo ligandų vyksta, trumpą lipofilinį transmembraninį domeną, ir intraląstelinis domeno nešantis tirozino kinazės aktyvumo [3, 4]. Jie yra išreikšti keletą audinių epitelio, mezenchiminių ir neuronų kilmės, kur jie vaidina pagrindinį vaidmenį kuriant, platinimu ir diferenciacijos. Nebereguliuojamos išraiška ErbB molekulių, būtent erbb2, buvo susijęs su daugelio tipų auglių, įskaitant skrandžio auglių vystymąsi. Skrandžio karcinoma ji buvo parodyta, kad ypač dideliu ErbB2 aktyvumu yra varomas geno sustiprinimą ir yra susijęs su karcinomų su aukštos invazinio potencialo [5]. ErbB1, geriau žinomas kaip epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGFR), raišką buvo aprašyta daugelyje žmogaus auglių, įskaitant plaučių, gaubtinės žarnos, krūties, prostatos, smegenų, galvos ir kaklo, skydliaukės, kiaušidžių, šlapimo pūslės, inkstų ir taip pat skrandžio vėžys [6 -11], ir buvo susietas su pažangiomis naviko stadijos ir prastos klinikinės baigties. Visai neseniai, mes parodė, kad EGFR aktyvacijos siejamas nuostolių funkcija E-cad, in vitro
[12].
Už onkogeninių konvertavimo EGFR vėžiu mechanizmai yra papildyta kopija numeris, struktūrinė pertvarkymai receptoriaus ir jų panaudojimo mutacijos [13]. EGFR mutacijų spiečius kinazės domeno EGFR (egzonų 18-21), ir sukelti ligando nepriklausomą aktyvacijos receptoriaus, atstovaujanti galimus tikslus terapinės intervencijos. Atsižvelgiant į tai, somatinių EGFR mutacijų, taip pat geno amplifikacija pacientams, sergantiems nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (NSLPV) labai koreliuoja su klinikiniu atsaku į tirozino kinazės inhibitorius [14, 15].
skrandžio auglių, duomenys, susiję su struktūriniais pakitimai EGFR išlieka kontraversiškas. Atsižvelgiant į galimas terapinis aktualumas, šiame tyrime siekėme išsiaiškinti EGFR struktūrinių pokyčių skrandžio kancerogenezėje aktualumą analizuojant pirminių skrandžio karcinoma, skirtų kopijų skaičiaus ir mutacijų tirozino kinazės domeno (egzonų 18-21) nuo EGFR serija
geną.
metodai
Byla atranka ir navikų histopatologinė klasifikacija
Atstovybės blokus 77 formalinu fiksuotos, parafino įdėta žmogaus skrandžio pirminių navikų buvo gauti iš patologijos iš ligoninės S. João departamento , po to, kai informaciją duotas pacientams. Pacientai buvo pranešta, kad navikas medžiaga būtų naudojama tik mokslinių tyrimų tikslais. Nė vienas iš pacientų, įtrauktų į šios serijos turėjo šeimos istoriją skrandžio vėžio. "H & Elektroninės Dėmėti skyriai buvo naudojami klasifikuoti navikai pagal Lauren Ming klasifikacijų. Įsiskverbimas į skrandžio sieną ir buvimo ir lokalizacijos limfinių metastazių limfmazgiuose buvo įrašyti visiems pacientams, naudojant standartines kriterijus patologinės stadija. Orceinas-nudažomi dalys buvo naudojamas kraujagyslių invazijos aptikti.
EGFR mutaciją ekranavimo
Genomo DNR buvo ekstrahuojamas iš 10 mkm skyriuje po microdissection auglio srityse siekiant užtikrinti grynumas mažiausiai 70% navikinių ląstelių. DNR išskyrimas buvo atliekamas naudojant genomo DNR gryninimo rinkinį (Gentra System) pagal gamintojo protokolą. Galinio egzono-specifiniai pradmenys buvo suprojektuoti ir DNR buvo atliktas PGR amplifikacija egzonų 18, 19, 20 ir 21. keturių EGFR
egzonų code for the tirozino kinazės domeno EGFR. Gruntas sekas rodomi 1.Table 1 lentelė gruntai naudojamas PGR amplifikacijos su EGFR kinazės domeno
Exon

Primer seka
PGR produktas dydis (bp)
Exon 18
Persiųsti
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Atvirkštinė
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
Persiųsti
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Atvirkštinė
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Persiųsti
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Atvirkštinė
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
Persiųsti
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Atvirkštinė
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PGR produktai buvo paleisti 2% agarozės gelyje ir PGR amplifikacijos juostos buvo paimti iš gelio su želė Band gryninimo rinkinį (GE Healthcare "). Mėginiai buvo tada valytas ir sekos naudojant ABI PRISM dGTF BigDye Terminatorius Ready Reakcijos rinkinį (Perkino Elmer, Foster City, CA) šią Gamyba nurodymu ir ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). Rezultatai buvo analizuojami naudojant 3100 duomenų rinkimo programą. Sekos buvo atliktas abiem sritims. Tais atvejais, įtariama mutacijų PGR amplifikacija buvo pakartotas ir mėginys vėl buvo sekas paneigti PGR artefaktus.
EGFR Kopijuoti Taškų variacijos atrankos
parafino blokai buvo suskirstyta ne 5 pm ir audinių skyriuose buvo džiovinami 60 ° C 30 minučių. Skaidrės buvo deparaffinised ir nuplovė po to paruošiamojo apdorojimo ir virškinimo žingsnio naudojant pepsinas ir pagaliau dehidratuota. LSI EGFR Dvigubas Spalva zondas-Hib rinkinys (VYSIS ®), optimizuotas aptikti juostos regioną 7p12 spektro apelsinų ir chromosomos 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 lokusas) centromeros spektro žalia, tiek į interfazės branduolių ir metafazėje chromosomų, buvo naudojami. Penki mikrol zondo buvo taikomi kiekvienos skaidrės. Denatūracijos buvo atliktas 80 ° C temperatūroje 8 minutes, po to hibridizacijos dėl drėgnoje kameroje 37 ° C temperatūroje 16 valandų. Po hibridizacijos, skaidres buvo plaunami ir inkubuojami su 4'-6-Diamidino 2-fenilindolo (DAPI) branduolinės dažymo. Siekiant įvertinti, šešiasdešimt 100 nepažeistos interfazės branduoliai buvo analizuojami dviejų nepriklausomų stebėtojų, kad būtų rezultatas signalus chromosomos 7 centromeros ir EGFR geno. Aplinkiniai limfocitai ir normalu gleivinė buvo naudojami kaip vidaus kokybės kontrolei vykdant tyrimus. Bent buvo atrinkti du arba trys tipinių sritys neoplastinė ląstelių, pagal 100 × /200 × amplifikacijos srityje, skaičiuoti branduoliuose signalus. Po pagal 400 × amplifikacijos apžvalga, signalai buvo tada skaičiuojami naudojant panardinimo aliejaus (1000 ×).
Statistinė analizė
asociacijos tyrimų tarp EGFR pokyčių ir klinikos ypatybes atvejais buvo atlikti tik 30 atvejų (auglių analizuojami EGFR mutacijų ir EGFR kopijų skaičiumi variacijos). Statistinė duomenų analizė buvo įvertintas X2 bandymo arba Stjudento t pervežimas testą. Psl
vertė. ≪ buvo laikomi statistiškai reikšmingas 0,05
rezultatai
EGFR mutacijų Screening
iš 77 skrandžio karcinoma analizuotų, EGFR
mutacijos egzonų 18-21 buvo aptikta 2,6% (2/77) atvejų (pav. 1A). Vienas mutacija priklausė egzono 20 ir buvo missense mutacija (2300 C > T), dėl kurių į alaninas 767 dėl valinas keitimą. Antrasis mutacija paveikė Exon 21 ir buvo missense mutacija (2524 a > G), todėl iš asparagino 842 substituition už asparto rūgšties. Nė vienas iš mutacijų anksčiau buvo aprašyta. Nėra seka pakeitimai buvo rastas egzonų 18 ir 19 1 pav struktūrinių pokyčių EGFR. (A), tiesiogiai sekvenuojant, turintis vieną iš mutacijų rastų kinazės domeno EGFR - missense mutacija (2300 C > T) egzono 20, todėl į alaninas 767 dėl valinas keitimą. (B), difuzinis skrandžio karcinoma su EGFR padidėjo kopijų skaičiaus, kurį sukelia chromosomų 7 polysomy. (C) navikinių ląstelių eksponuoti genų amplifikacija su klasterių formavimas su daugybe signalų EGFR.
Keletas EGFR geno polimorfizmas buvo rasta 20 Exon (2 lentelė). Polimorfizmas 2361G > Gln787Gln, anksčiau aprašyta Mu kt
[16], buvo pateikti 55,8% (43/77) atvejų, o devyni iš 43 atvejų per homozigotiniu būklę. Mes tikrinami 50 normalias kontrolę ir 2361G > Gln787Gln buvo pateikti 82% kontrolės (41/50). Kiti du EGFR tylus mutacijos (2301 C > T Ala767Ala ir 2415 C > T His805His) buvo rasta egzono 20, aprašyta anksčiau nė vienas iš jų. Abu pakeitimai buvo rastas vienu atveju ir buvo išvykęs normaliomis controls.Table 2 rasti tiesioginio sekvenavimo

perdirbimo teisės seka pakeitimus

Įveskite
dažnis
Nuorodos
Exon 18
2184 + 19 G > A
Intronic variantą
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
Intronic variantu
1/77
dar aprašyta
2283 +11 G >, A
Intronic variantas
1/77
dar aprašyta
2283 + 47 G >
Intronic variantas
1/77
dar aprašyta
2283+ 49 "C > T
Intronic variantu
1/77
dar aprašyta
Exon 20
2284-60, C > T
Intronic variantą
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T
Missense Ala 767 Val
1/77
dar aprašyta
2301, C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
dar aprašyta
2361G >
tylus Gln 787 Gln
43/77
[16]
2415 C > T
Silent Jo 805 Jo
1/77
dar aprašyta
Exon 21
2524 A > G
Missense Asn 842 ASP
1/77
dar aprašyta
Mes nustatėme, šešių skirtingų seka alternatyvius lokalizuotas intronic regionuose EGFR, du iš jų anksčiau aprašyta Ensembl [17].
EGFR Kopijuoti Taškų kitimas atranka
EGFR
kopijų skaičiaus analizę, vertinant pagal chromosomų dažymas (žuvis), buvo tik įmanoma 30 77 tirtų EGFR mutacijų atvejais. Visi EGFR
signalai buvo palyginti su signalų centromerinės zondinių chromosomos 7. Daugiau nei 2,0 EGFR
kopijų per langelį (subalansuota polysomy ar genų amplifikacijos) buvo aptiktas 13,3% (4/30) atvejų. Iš keturių atvejų Rodoma daugiau nei 2 kopijas EGFR
per chromosomos 7, trijų išaugo kopijos numeris dėl polysomy ir vienas turėjo genų amplifikacija, difuzinio skrandžio karcinoma, eksponuoti klasterių su daugybe signalų EGFR
formavimas (pav. 1B, C).
EGFR struktūriniai pakeitimai ir clinicopathologic parametrai pacientams ir navikų
3 lentelė rodo statistiniai asociacijas tarp EGFR pokyčių ir clinicopathologic charakteristikas pacientų ir navikų. Lyginant skrandžio karcinoma, slepianti EGFR pakeitimus su karcinoma su normalia EGFR statuso ar kopijų skaičiaus, mes nustatėme reikšmingą ryšį tarp EGFR struktūrinių pokyčių ir padidėja naviko dydžio. (Psl
= 0,0094). Jokių reikšmingų asociacijos buvo rasta tarp EGFR pakitimų bei kitų clinicopathologic parametrų pacientų ir auglių, ty lytį ir amžių pacientų, naviko lokalizacijos histologinio tipo, sienoje, iš limfmazgių metastazių buvimas, kraujagyslių invazija ir naviko stadija naviko .table 3 asociacija EGFR geno pakitimai su klinikos parametrų
klinikos parametrai
EGFR statusas

stiprinimas /mutacija (n = 6)
normalaus (N = 24)
Iš viso (N = 30)
psl
vertė
Lytis (M /M),
1/5
10/14
11/19
0.2557
Amžius (SD)
62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57,5 ​​16,2
0,4271
± Naviko lokalizacija
0.8548 pervežimas proksimalinės
3
11
14
Distalinė
3
13
16
dydis (SD)
11,6 ± 9,8
5,8 ± 2,0
6,9 ± 5,0
* 0,0094
Lauren klasifikacija
0,1261
Žarnų
1
12
13
Difuzinė
5
9
14
atipinės
lenta skverbtis
0
3
3 0,4642
Ankstyvas (T1)
0
2
2
Išplėstinė (T2 T4)
6
22
28
kraujagyslių invazija
0.7125
NEBŪTI ( N0)
3
14
17
dabar (n = 1)
Limfmazgių metastazės
0.1921 pervežimas Neaptinkama <3 10
13
Br> 1
11
12
dabartis
5
13
18
Skirstymas
0,3845
Aš
1
7
8
II
0
5
5
III
5
11
16 IV
0
1
1
Diskusijų
EGFR geno yra chromosomos 7p12 ir kodus už 170 kDa receptorių, esančių ląstelių membranos, kaip neaktyvų monomerų. Po ligando jungimosi prie tarpląstelinio domeną, receptorius patiria konformacinės pokyčius, dimerises ir tampa autophosphorylated pagrindinėse tirozino liekanų ląstelėje tirozino kinazės (TK) srityje. Tai veda prie tolesniems kelius, kurie kontroliuoja ląstelių išgyvenimą, slopina apoptozę ir platinimo [18] aktyvacijos.
Daug dėmesio buvo atkreipiamas į onkogeninių poveikio EGFR ir svarbiausia, kad sėkmės EGFR tikslinių gydymo, kuris yra gerai įsteigta nesmulkiųjų ląstelių plaučių karcinoma. EGFR vaidmuo skrandžio vėžys yra labai prieštaringas. Kai kurie autoriai pranešė, kad EGFR labai išreikštas skrandžio vėžiu, rodo jų tinkamumą, kaip siektinas receptorių tirozino kinazės inhibitorių [19, 20]. Priešingai, Takehana ir jo kolegos pranešė, kad padidėjusi epidermio augimo faktoriaus receptorių yra retas įvykis skrandžio karcinoma [21] ir įvyksta daugiausia dėl EGFR geno, patvirtindamas rezultatai nuo ankstesnių tyrimų [22-24]. EGFR mutacijų pirminės skrandžio karcinoma ar skrandžio vėžio ląstelių linijas niekada nebuvo pranešė [25-27]; Nepaisant to, mes neseniai parodė, kad paveldimas pasklidųjų skrandžio vėžys susijęs El cad gonocitų linijos missense mutacijos padidėti EGFR veikla.
Remiantis šiais duomenimis, mūsų nuomone, kad ieškome EGFR pokyčių skrandžio vėžio galėjo svarbu nustatyti terapijos jautrias bylas.
Štai mes pranešime EGFR
padidėjo kopijų skaičiaus buvimas 13,3% iš 30 atvejų, kai ŽUVYS analizė įmanoma. Iš keturių atvejų, kuriems yra padidėjęs kopijų skaičiaus, tik vieną pateiktą geno, o likę 3 atvejai parodė polysomy chromosomos 7. Šie rezultatai atitinka ankstesnes ataskaitas tiriančių EGFR kopijos numeris skrandžio vėžio [22-24]. Mutacijos analizė kinazės domeno EGFR atskleidė, kad mutacijų buvimą 2,6%, iš 77 skrandžio karcinoma. Nustatytos mutacijos iš missense tipo ir buvo pateikti ir 21 EGFR geno egzonų 20. Nė vienas iš nustatytų mutacijų buvo aprašyta anksčiau ir jų funkcinė reikšmė yra dar vertinamas. Tačiau, atsižvelgiant į jų lokalizacijos kinazės domeno EGFR, tai pagunda spekuliuoti, kad jie paveikti receptorių aktyvumą, todėl pacientai slėpimas šiuos EGFR mutacijų gali turėti naudos iš tirozino kinazės inhibitorių, kaip terapinį metodą.
Be šių mutacijų rasti buvo nustatyta kitos sekos pakitimai, visi grupavimas į egzono 20. EGFR polimorfizmas 2361 "G > a (anksčiau aprašyta Ensembl) atsiranda didelis procentas atvejų ir kontrolinės grupės. Priešingai, kiti du dar aprašyta tylus variantus egzono 20 (2301 C > T, 2415 C > T) buvo išvykęs į įprastos kontrolės. Be šių EGFR seka variantai kodavimo regionus, mes taip pat nustatė svyravimus intronic seka gretutinė egzonų 18, 19 ir 20, bet jų funkcinis poveikis lieka neaišku.
Klinikinių parametrų koreliaciją atvejus, dėl kurių tiek mutacija ir žuvų analizė buvo įmanoma, parodė reikšmingą ryšį tarp EGFR pokyčių ir naviko dydžio. Įdomu tai, kad visais atvejais, kai keičiant EGFR (amplifikacijos /mutacija) buvo karcinomos jau įsiveržė į bazinę membraną ir plintančias į skrandžio sieną (T2-T4), o tai rodo, kad pakitimai šio geno gali suteikti invazinių elgesį prie navikinių ląstelių.
Tačiau ši hipotezė turi būti išsiaiškinti toliau tęsiant studijas, nes mes ne patikrinti statistiškai reikšmingą koreliaciją tarp EGFR pokyčių ir invazijos į skrandžio sieną (p = 0.4642), kaip mes ką tik analised labai mažą skaičių pradžioje skrandžio karcinoma ( n = 2) mūsų serijos. Abu rezultatai yra susitarusi su Cheironas ataskaitas ir kt
., 1995 [23] ir Tsugawa kt
., 1998 [24], rodo, kad EGFR dalyvauja naviko augimą bei įjungimo pakitimai gali būti vėlu renginys įtrauktas į naviko progresavimo.
Nors buvo nustatyta jokia kita statistiškai reikšmingas ryšys, įdomu pastebėti, kad EGFR pakitimai atsiranda daugiausia karcinoma difuzinio tipo. EGFR pokyčių buvimas pasklidųjų karcinoma yra priešingai, nei anksčiau pastebėta kitų narių erbB receptorių šeimai skrandžio vėžio. Skrandžio karcinoma erbb2 amplifikacija buvo aptiktas pirmenybė nustatymas žarnų karcinoma, skrandžio [5].
Išvada
Taigi, šiame tyrime mes parodė, kad EGFR aktyvinantys pakitimai nėra dažnas įvykis skrandžio kancerogenezėje. Pasikeitimai, labiausiai atsiras skrandžio karcinoma Difuzinis potipio ir yra susijusios su naviko dydžiu. Nepaisant mažo dažnio EGFR pokyčių, mūsų rezultatai taip pat rodo, kad yra ribojama grupė pasirinktų skrandžio pacientams, kurie gali pasinaudoti ne įprastiniais vaistiniais preparatais, įskaitant farmakologinį inhibitoriais EGFR receptorius.
Notes
Cátia Moutinho Ana R Mateus vienodai prisidėjo prie šio darbo
deklaracijų
nusipelniusieji
Šis tyrimas buvo finansuojamas dotacijas iš Fundação para ciencia EA Tecnologia, Portugalija (SFRH /BD /16.747 /2004, POCI /SAU -. Pastebėjimas /57670 /2004 PTDC /SAU -. OBD /64.319 /2006)
autorių originalios pateikti failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalių pateiktų failų vaizdų. 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf Autorių originalus failas 1 pav konkuruojančių interesų
Autorius (-iai) deklaruoja, kad jie neturi jokių konkuruojančių interesų.

• Surištas skrandžio aplinkkelio - ketveri metai tolesniais būsimasis daugiacentrio analysis
• Išeikvojimas OLFM4 geno slopina ląstelių augimą ir didina jautrumą su vandenilio peroksidu ir naviko nekrozės faktoriaus alfa sukeltas-apoptozės skrandžio vėžio ląsteles