Epidermális növekedési faktor receptor szerkezeti változásokat hozott gyomorrák

Epidermális növekedési faktor receptor szerkezeti változásokat a gyomorrák
Abstract
alapon
EGFR túlzott mértékű expressziója leírták számos emberi tumorok, beleértve a gyomorrákot. Az NSCLC-betegek szomatikus EGFR-mutációk, belül a kináz domén a fehérje, valamint génamplifikáció jártak együtt a jó klinikai választ EGFR-inhibitorok. A gyomor tumorok vonatkozó adatok szerkezeti változásokat EGFR vitatott maradt. Tekintettel arra, hogy lehetséges terápiás relevanciáját, célul tűztük, hogy meghatározzák a gyakorisága és típusa szerkezeti változások az EGFR katalógusa gén egy sor elsődleges gastricus karcinómák.
Módszerek
közvetlen szekvenálása a kináz domén az EGFR
gén végeztünk egy sor 77 elsődleges gastricus karcinómák. FISH-analízist végeztünk 30 esetben. Asszociációs vizsgálatok között az EGFR
módosításokat, és a klinikai patológiai jellemzői a tumorok végeztünk.
Eredménye
belül 77 elsődleges gastricus karcinómák találtunk két EGFR
szomatikus mutációt és számos EGFR
polimorfizmusok exon 20. Hat különböző intronic szekvencia variánsok EGFR katalógusa is találtak. Négy gyomor carcinoma megmutatta kiegyensúlyozott es poliszómiát vagy EGFR katalógusa génamplifikációnak. Igazoltuk, hogy a gyomor carcinoma elváltozások EGFR katalógusa (szomatikus mutációk vagy kópiaszám variáció) jelentős növekedést mutatott a tumor mérete (p = 0,0094 katalógusa) összehasonlítva a vad típusú EGFR katalógusa carcinoma. Katalógusa Következtetés katalógusa azt bizonyítják, hogy az EGFR katalógusa szerkezeti változásokat ritkák gyomorrák, de amennyiben jelen van, azt eredményezi, hogy a tumor növekedését. Úgy gondoltuk, hogy keresi az EGFR katalógusa változások gyomorrák valószínűleg klinikailag fontos annak érdekében, hogy azon betegek hajlamosak reagálni tirozin-kináz-inhibitorok. Katalógusa Háttér katalógusa gyomorrák továbbra is a második vezető daganatos halálok világszerte [1] egy olyan forgatókönyvet, amely kiemeli, hogy több konkrét és hatékony terápiákat. A pontos mechanizmusa gyomor carcinogenesis még nem teljesen ismert, de bizonyítékok arra utalnak, társulás extrapiramidális rendszer fejlődési folyamatok [2]. Kulcs molekulák ezen utak vannak a receptor tirozin-kinázok (RTK-k), amelyek megállapították, hogy abnormálisan aktivált vagy túlexpresszált a különböző tumorok és ezért képviseli ígéretes célpontjai a terápiás beavatkozás.
A tagok a RTK szupercsalád erbB receptorok glikoproteinek, hogy áll egy extracelluláris domén, ahol a ligandumok kötődését zajlik, egy rövid lipofil transzmembrán domént és egy intracelluláris domént hordozó tirozin-kináz-aktivitás a [3, 4]. Ezek fejezik ki számos szövetében epithelialis, mesenchymalis és idegi eredetű ahol sarkalatos szerepet játszanak a fejlődésben, proliferációját és differenciálódását. Szabályozatlan expressziója ErbB molekulák, nevezetesen az erbB2, a szerepet játszik a fejlesztés a számos típusú tumorok, beleértve a gyomor daganatok. A gyomor karcinóma kimutatták, hogy Az ErbB2 túlzott expresszióját hajtja génamplifikáció és összekapcsolható karcinómák nagy invazív potenciállal [5]. ErbB1, jobban ismert, például az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), overexpressziója leírták számos emberi tumorok, beleértve a tüdő-, vastagbél-, emlő-, prosztata-, az agy, a fej és a nyak, a pajzsmirigy, a petefészek, a hólyag, vese-és szintén gyomorrák [6 -11] és összefüggésbe hozták a fejlett daganat stádiuma és rossz klinikai eredmény. A közelmúltban kimutattuk, hogy az EGFR aktiválását társul, hogy funkciójának elvesztése E-cadherin, az in vitro
[12].
A mechanizmusok onkogén átalakítására EGFR rák közé amplifikált kópiaszám, szerkezeti átrendeződések a receptor és aktiváló mutációk [13]. EGFR-mutációk klaszter a kináz domén az EGFR (exonok 18-21), és okoz, ligandumtól független aktiválása a receptor, ami a lehetséges célpontok a terápiás beavatkozásra. Ebben a tekintetben, szomatikus EGFR-mutációk, valamint génamplifikáció betegekben nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) nagyon korrelálnak a klinikai válasz tirozin-kináz-inhibitorok [14, 15].
Gyomor tumorok, vonatkozó adatokat strukturális változtatások EGFR vitatott maradt. Tekintettel arra, hogy lehetséges terápiás jelentősége, hogy a jelen tanulmány arra törekedtünk, hogy tisztázza relevanciáját EGFR szerkezeti változásokat hozott a gyomor karcinogenezis elemzésével egy sor elsődleges gyomor carcinoma a kópiaszám és mutációk a tirozin-kináz domén (exon 18-21) az EGFR
gén.
módszerek katalógusa Case kiválasztása és kórszövettani osztályozását a tumorok
képviselője blokk 77 formalin-fixált, paraffinba ágyazott emberi gyomor primer tumorokat letölteni a Department of Pathology a kórház S. João után beleegyező a betegek. A betegeket tájékoztatni, hogy a daganatos anyagot használnak kizárólag kutatási célokra. Egyik beteg sem szerepel a jelen sorozat volt egy családi anamnézisében gyomorrák. H & E festett metszeteket használtunk kategorizálni daganatok besorolásának megfelelően Lauren és a Ming. Behatolás a gyomorfal és a jelenléte és lokalizációja nyirokcsomóáttétek rögzítettük minden betegnél a szokásos kritériumok patológiai stádium. Orcein-festett metszeteket használtunk kimutatására vaszkuláris invázió.
EGFR mutáció Screening
Genomiális DNS-t extraháltunk 10 um-szakasz után mikrodisszekcióban a tumor területek, hogy biztosítsa a tisztasága legalább 70% -os a daganatos sejtek. DNS extrakció alkalmazásával végeztük a genomi DNS Purification Kit (Gentra System) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. Exon-specifikus primereket terveztünk, és a DNS-t vetjük alá PCR-amplifikáció exonok 18, 19, 20 és 21. A négy EGFR
exonokat kódját a tirozin-kináz domén az EGFR. A primer szekvenciák táblázatban mutatjuk be 1.Table 1. használt primerek PCR-amplifikáció az EGFR kináz domén
Exon Matton
primer szekvenciát Matton PCR termék mérete (bp) Matton Exon 18
Előre katalógusa TGGGCCATGTCTGGCACTGC katalógusa 283 katalógusa Fordított katalógusa ACAGCTTGCAAGGACTCTGG katalógusa Exon 19 katalógusa Előre
TCACTGGGCAGCATGTGGCA katalógusa 241 katalógusa Fordított katalógusa CAGCTGCCAGACATGAGAAA katalógusa Exon 20 katalógusa Előre katalógusa CCTTCTGGCCACCATGCGAA katalógusa 295 katalógusa Fordított katalógusa CGCATGTGAGGATCCTGGCT katalógusa Exon 21 katalógusa Előre
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Fordított
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PCR termékeket futtattuk 2% -os agaróz gélen, és PCR-rel amplifikált sávokat extraháljuk a gélből a gélen Purification Kit (GE Healthcare). A mintákat ezután tisztítottuk és szekvenáltuk az ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA) a következő gyártó instrukciói és egy ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). Az eredményeket analizáltuk 3100 adatgyűjtő szoftver. A szekvenálást végeztünk mindkét szál. Azokban az esetekben, a feltételezett mutációt PCR amplifikációt megismételjük, és a mintát újra szekvenáltuk, hogy zárja ki a PCR műtermékek.
EGFR Copy Number Variation Screening katalógusa A paraffin metszetekre vágtuk 5 jim és szöveti metszeteket szárítjuk 60 ° C hőmérsékleten 30 percig. A tárgylemezeket deparaffinised mossuk, majd egy előkezelést és egy feltárási lépést használó pepszin és végül dehidratált. Az LSI EGFR Kétszínű Probe-Hyb Set (Vysis ®) kimutatására optimalizált az együttes terület 7p12 frekvenciákhoz narancs és centromérához 7-es kromoszóma (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) a spektrum zöld, mind a interfázisban sejtmagok és metafázisos kromoszómákon, használták. Öt ul a szonda vittük fel dia. A denaturáció végeztük 80 ° C-on 8 percig, majd hibridizáció nedves kamrában 37 ° C-on 16 órán át keverjük. A hibridizáció után a metszeteket mostuk és inkubáltuk 4'-6-diamino-2-fenil-(DAPI) nukleáris festődést. Az értékelés, hatvan 100 intakt interfázis sejtmagok elemezték két független megfigyelők annak érdekében, hogy pont a jeleket a 7-es kromoszóma centroméra és az EGFR-gén. Környező limfociták és a normál nyálkahártya használtunk belső minőség-ellenőrzés a vizsgálatokban. Legalább két vagy három reprezentatív területek a daganatos sejteket szelektáltuk, alatt egy 100 × /200 × amplifikációs mező, hogy számít a sejtmagok jeleket. Áttekintése után alatt 400 × erősítés, a jeleket megszámoltuk az immerziós olaj (1000 ×). Katalógusa Statisztikai analízis katalógusa Egyesület tanulmányok között EGFR változtatások és klinikopatológiai jellemzői az esetek végeztünk csak 30 esetben (daganatok elemeztük EGFR-mutációk és az EGFR kópiaszám variáció). A statisztikai elemzéseket értékelte az x2 teszt vagy Student t katalógusa teszt. A p katalógusa érték < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa Eredmények katalógusa EGFR mutációanalízis katalógusa A 77 gyomor carcinoma elemezni, EGFR katalógusa mutációk exon 18-21 mutattunk 2,6% (2/77) az esetek (1A.). Egy mutáció egyértelműen exon 20 és egy missense mutáció (2300 C > T) vezető helyettesítése alanin 767 egy Valin. A második mutáció befolyásolja exon 21, és volt egy missense mutációt (2524 A > G), ami a substituition az aszparagin 842 egy aszparaginsav. Egyik mutációk korábban leírtuk. Nem-változtatások találtak exon 18. és 19. ábra 1 Szerkezeti változások EGFR. (A) közvetlen szekvenálása mutatja az egyik a mutációk találhatók a kináz domén az EGFR - missense mutáció (2300 C > T) az exon 20, ami a helyettesítése alanin 767 a valin. (B) A diffúz gyomorrák EGFR fokozott kópiaszám okozta kromoszóma 7-es poliszómiát. (C) Daganatos sejtek mutatnak génamplifikációnak a formáció a klaszterek számos jeleket EGFR.
Több EGFR polimorfizmusok találtak exon 20 (2. táblázat). A polimorfizmus 2361G > A Gln787Gln, korábban leírt által Mu és mtsai katalógusa [16], jelen volt 55,8% (43/77) az esetek és kilenc a 43 esetben egy homozigóta állapotban. Mi árnyékolt 50 normál kontrollok és a 2361G > A Gln787Gln volt jelen 82% -a az ellenőrzések (41/50). Két másik EGFR csendes mutációk (a 2301 C > T Ala767Ala és a 2415-C > T His805His) találtak exont 20, egyikük korábban leírtuk. Mindkét elváltozásokat találtak egy esetben, és nem voltak jelen a szokásos controls.Table 2-változtatások talált direkt szekvenálás katalógusa katalógusa módosítása
katalógusa Írja Matton Frequency Matton Referenciák Matton Exon 18 katalógusa 2184 + 19 G > Egy fiatal Intronic variáns katalógusa 2/77 katalógusa EnsEMBL katalógusa SNP rs17337107 (dbSNP126) [17] katalógusa Exon 19 katalógusa 2185-9 C > G katalógusa Intronic variáns katalógusa 1/77
még nem ismertetett katalógusa 2283 + 11 G > Egy fiatal Intronic variáns katalógusa 1/77
még nem ismertetett katalógusa 2283 + 47 G > Egy fiatal Intronic variáns katalógusa 1/77
még nem ismertetett katalógusa 2283+ 49 C > T katalógusa Intronic variáns katalógusa 1/77
még nem ismertetett katalógusa Exon 20 katalógusa 2284-60 C > T katalógusa Intronic variáns katalógusa 2/77 katalógusa Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T katalógusa misszensz Ala 767 Val
1/77
még nem ismertetett katalógusa 2301 C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
még nem ismertetett katalógusa 2361G > Egy fiatal Silent Gin Gin 787
43/77 katalógusa [16] katalógusa 2415 C > T
Silent His 805 Ő katalógusa 1/77
még nem ismertetett katalógusa Exon 21 katalógusa 2524 A > G katalógusa misszensz Asn 842 Asp
1/77
még nem ismertetett katalógusa Találtunk hat különböző szekvencia-változatokat lokalizált intron régiójában EGFR, kettő közülük a korábban leírt Ensembl [17].
EGFR copy Number Variation Screening
elemzése EGFR katalógusa kópiaszám, értékelése szerint fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH), csak úgy volt lehetséges a 30. 77 elemzett esetekben az EGFR-mutációk. Minden EGFR katalógusa jeleket képest jeleket centromerikus próbák kromoszóma 7. Több mint 2,0 EGFR katalógusa sejtenként (kiegyensúlyozott es poliszómia vagy gén amplifikáció) mutattunk 13,3% (30/04) az esetek. A négy eset mutatja több mint 2 példányban EGFR katalógusa per 7. kromoszóma három nőtt kópiaszám miatt a poliszómia, míg egy gén amplifikáció diffúz gyomorrák, kiállító képződését klaszterek számos jelek EGFR katalógusa (ábra. 1B, C).
EGFR szerkezeti változtatások és klinikopatológiai paraméterek a betegek és a tumorok
3. táblázat mutatja a statisztikai összefüggést EGFR módosításokat, és a klinikai és patológiai jellemzői a betegek és a daganatok. Ha összehasonlítjuk gyomorrák hordozó EGFR-változást carcinoma normális EGFR státusz vagy kópiaszám, azt tapasztaltuk, hogy szignifikáns összefüggést az EGFR szerkezeti változtatások és növelte a tumor méretét. (P = 0,0094 katalógusa). Nem találtunk szignifikáns összefüggést találtunk között EGFR átalakítási és egyéb klinikai és patológiai paraméterek a betegek és a tumorok, azaz a nemek és a betegek életkora, a daganat lokalizációja, szövettani típus, fali penetráció, jelenléte nyirokcsomó áttét, vaszkuláris invázió és a tumor stádium a tumor .table 3. társulási EGFR-gén eltéréseinek klinikopatológiai paraméterek katalógusa klinikopatológiai paraméterek Matton EGFR státusz Matton
Erősítés /mutáció (n = 6) Matton Normál (n = 24) Matton Összesen (n = 30) Matton p katalógusa érték Matton Nem (F /M) hotelben 05/01 katalógusa 10/14 katalógusa 11/19 katalógusa 0,2557 katalógusa Életkor (SD) hotelben 62,3 ± 14,1 katalógusa 56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2 katalógusa 0,4271 katalógusa tumor lokalizáció katalógusa 0,8548 katalógusa Proximal
3 katalógusa 11 katalógusa 14 katalógusa distalis katalógusa 3 katalógusa 13 katalógusa 16
méret (SD) hotelben 11,6 ± 9,8 katalógusa 5,8 ± 2,0 6,9 ± 5,0 katalógusa katalógusa * 0,0094 katalógusa Lauren besorolás katalógusa 0,1261 katalógusa Bél
1 katalógusa 12 katalógusa 13 katalógusa Diffúz katalógusa 5 katalógusa 9 katalógusa 14
Atipikus katalógusa 0 katalógusa 3 katalógusa 3 katalógusa Fali penetráció katalógusa 0,4642 katalógusa Early (T1) hotelben 0 katalógusa 2

• Sávos gyomor bypass - négy éves követés során prospektív multicentrikus analysis
• Kiürülése OLFM4 gén gátolja a sejtnövekedést és növeli a szenzitizáció hidrogén-peroxid és a tumor nekrózis faktor-alfa által indukált-apoptózist gyomorrák cells