alteraciones estructurales de los receptores de factor de crecimiento epidérmico en el cáncer gástrico

alteraciones estructurales de los receptores de factor de crecimiento epidérmico en el cáncer gástrico
Abstract
Antecedentes
sobreexpresión de EGFR se ha descrito en muchos tumores humanos, incluyendo el cáncer gástrico. En pacientes con CPNM mutaciones somáticas EGFR, dentro del dominio quinasa de la proteína, así como la amplificación de genes se asociaron con una buena respuesta clínica a los inhibidores de EGFR. En los tumores gástricos datos relativos a las alteraciones estructurales del EGFR sigue siendo controvertido. Teniendo en cuenta su posible relevancia terapéutica, nuestro propósito es determinar la frecuencia y tipo de alteraciones estructurales del EGFR
gen en una serie de carcinomas gástricos primarios.
Métodos
La secuenciación directa del dominio quinasa del EGFR
gen se llevó a cabo en una serie de 77 carcinomas gástricos primarios. análisis FISH se realizó en 30 casos. Se realizaron estudios de asociación entre EGFR
alteraciones y las características patológicas clínicas de los tumores.
: Resultados de la Dentro de los 77 carcinomas gástricos primarios se encontraron dos mutaciones somáticas
EGFR y varios EGFR
polimorfismos en el exón 20. Seis secuencia intrónica diferentes variantes de EGFR
también fueron encontrados. Cuatro carcinomas gástricos mostraron polysomy equilibrada o EGFR
amplificación de genes. Verificamos que el carcinoma gástrico con alteraciones de EGFR
(mutaciones somáticas o copiar la variación del número) mostró un aumento significativo del tamaño del tumor (p = 0,0094
) en comparación con el tipo salvaje EGFR
carcinomas.
conclusión
demostramos que EGFR
alteraciones estructurales son poco comunes en el carcinoma gástrico, pero siempre presentes, que conduce al crecimiento del tumor. Se consideró que la búsqueda de EGFR
alteraciones en el cáncer gástrico es probable que sea clínicamente importante con el fin de identificar a los pacientes susceptibles de responder a los inhibidores de tirosina quinasa.
Antecedentes
cáncer gástrico sigue siendo la segunda causa principal de muerte en todo el mundo el cáncer [1] un escenario que pone de relieve la necesidad de terapias más específicas y eficaces. Los mecanismos exactos que subyacen a la carcinogénesis gástrica aún no se entienden completamente, pero la evidencia apunta a una asociación con los involucrados en los procesos de desarrollo [2]. moléculas clave de estas vías son las tirosina quinasas receptoras (RTK), que se encuentran para ser activado o sobreexpresa en una variedad de tumores de forma aberrante y por lo tanto representan objetivos prometedores para la intervención terapéutica.
Los miembros de la superfamilia de los receptores RTK de ERBB son glicoproteínas que consisten en un dominio extracelular, donde la unión de ligandos tiene lugar, un dominio transmembrana lipófilo corto, y un dominio intracelular que lleva la actividad de la tirosina quinasa [3, 4]. Se expresan en varios tejidos epiteliales, mesenquimales y origen neuronal, en los que juegan un papel fundamental en el desarrollo, la proliferación y la diferenciación. La expresión desregulada de moléculas de ERBB, a saber, ERBB2, se ha implicado en el desarrollo de numerosos tipos de tumores, incluyendo tumores gástricos. En el carcinoma gástrico, se ha demostrado que la sobreexpresión de ERBB2 está impulsado por la amplificación del gen y se asocia a los carcinomas de alto potencial invasivo [5]. ERBB1, mejor conocido como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), la sobreexpresión se ha descrito en muchos tumores humanos, incluyendo de pulmón, colon, mama, próstata, cerebro, cabeza y cuello, tiroides, ovario, vejiga, riñón y también cáncer de estómago [6 -11], y se ha correlacionado con el estadio tumoral avanzado y los pobres resultados clínicos. Muy recientemente, hemos demostrado que la activación del EGFR se asocia a la pérdida de la función de E-cadherina, in vitro
[12].
Los mecanismos de conversión oncogénica de EGFR en cáncer incluyen amplifica el número de copias, reordenamientos estructurales del receptor , y la activación de mutaciones [13]. mutaciones de EGFR se agrupan en el dominio quinasa de EGFR (exones 18-21), y causan la activación independiente de ligando del receptor, lo que representa posibles dianas para la intervención terapéutica. En este sentido, mutaciones de EGFR somáticas, así como la amplificación de genes en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) altamente correlacionan con la respuesta clínica a los inhibidores de tirosina quinasa [14, 15].
En los tumores gástricos, los datos relativos estructural alteraciones del EGFR sigue siendo controvertido. Teniendo en cuenta su posible relevancia terapéutica, en el presente estudio tuvo como objetivo aclarar la relevancia de las alteraciones estructurales del EGFR en la carcinogénesis gástrica mediante el análisis de una serie de carcinomas gástricos primarios para el número de copias y mutaciones en el dominio tirosina quinasa (exones 18-21) del EGFR
gen.
Métodos
la selección de casos y clasificación histopatológica de los tumores
bloques representativos de 77, incluidos en parafina tumores primarios gástricos humanos fijados con formalina fueron recuperados desde el Departamento de Anatomía Patológica del hospital S. João , tras el consentimiento informado de los pacientes. Los pacientes fueron informados de que el material tumoral sería utilizado únicamente con fines de investigación. Ninguno de los pacientes incluidos en la presente serie tenía un historial familiar de cáncer gástrico. H & E- secciones teñidas se utilizaron para clasificar los tumores según las clasificaciones de Lauren y Ming. La penetración de la pared gástrica y la presencia y localización de metástasis en los ganglios linfáticos se registran para todos los pacientes utilizando los criterios estándar para la estadificación patológica. secciones teñidas con Orceína se utilizaron para la detección de invasión vascular.
EGFR mutación Screening
ADN genómico fue extraído de 10 micras sección después de microdisección de las zonas tumorales para asegurar una pureza de al menos 70% de las células neoplásicas. La extracción de ADN se realizó usando el kit de purificación de ADN genómico (Sistema Gentra) de acuerdo con el protocolo del fabricante. cebadores Exon-específicos fueron diseñados y ADN se sometió a amplificación por PCR de los exones 18, 19, 20 y 21. Los cuatro EGFR código
exones para el dominio de tirosina quinasa de EGFR. Primer secuencias se muestran en la Tabla 1 1.Table Los cebadores usados ​​para la amplificación por PCR del dominio quinasa de EGFR
Exon

cebador de secuencia
PCR tamaño del producto (pb) guía empresas exón 18
Delantero
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Reverse
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
exón 19
hacia delante
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Reverse
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
exón 20
Delantero
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
inversa
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
exón 21
hacia delante
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Reverse
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2% y las bandas de PCR amplificados se extrajeron del gel con el kit de purificación de gel de banda (GE Healthcare). Las muestras fueron entonces purificados y secuenciados utilizando el kit ABI Prism BigDye Terminator dGTP Ready Reaction (Perkin Elmer, Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricación y una Prism 3100 Analyser ABI genética (Perkin Elmer, Foster City, CA). Los resultados fueron analizados utilizando el software 3100 de recogida de datos. La secuenciación se realizó en ambas cadenas. En los casos con sospecha de mutaciones amplificación por PCR se repitió y la muestra fue re-secuenciado para descartar artefactos de PCR.
Número EGFR Copia Variación Proyección
Los bloques de parafina se seccionaron a 5 micras secciones de tejido y se secaron a 60 ° C por 30 minutos. Los portaobjetos se deparaffinised y se lavó seguido de un pre-tratamiento y una etapa de digestión con pepsina y finalmente deshidratado. El LSI EGFR color dual sonda-Hyb Conjunto (Vysis ®), optimizado para detectar la región 7p12 banda de espectro de color naranja y el centrómero del cromosoma 7 (7p11.1-Q11.1, D7Z1 locus) en el espectro verde, tanto en núcleos en interfase y en los cromosomas en metafase, se utilizó. Cinco l de la sonda se aplicaron a cada diapositiva. La desnaturalización se realizó a 80 ° C durante 8 minutos, seguido de la hibridación en una cámara húmeda a 37 ° C durante 16 horas. Después de la hibridación, los portaobjetos se lavaron y se incubaron con 4 '6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción nuclear. Para la evaluación, sesenta a 100 núcleos en interfase intactas fueron analizadas por dos observadores independientes con el fin de marcar las señales para el centrómero del cromosoma 7 y el gen EGFR. linfocitos que rodean y mucosa normal se utilizaron como control interno de la calidad de los ensayos. Al menos se seleccionaron dos o tres áreas representativas de las células neoplásicas, en un campo de la amplificación de 100 × /200 ×, para contar las señales de los núcleos. Después de una visión general bajo una amplificación de 400 ×, las señales fueron contados usando aceite de inmersión (1000 ×).
El análisis estadístico
Los estudios de asociación entre alteraciones del EGFR y las características clínico-patológicas de los casos se realizaron sólo en 30 casos (tumores analizadas para mutaciones de EGFR y la variación del número de copias EGFR). Los análisis estadísticos fueron evaluadas por la prueba de la x2 o t de Student
. Un valor de p Red de. ≪ 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
mutación EGFR Screening
A partir de los 77 carcinomas gástricos analizadas, se detectaron mutaciones de EGFR
en los exones 18-21 en el 2,6% (2/77) de los casos (Fig. 1A). Una mutación pertenecía al exón 20 y era una mutación de sentido erróneo (2300 C > T) que conduce a la sustitución de la alanina 767 por una valina. La segunda mutación afectada exón 21 y era una mutación de sentido erróneo (2524 A > G) que conduce a la substituition de la asparagina 842 de un ácido aspártico. Ninguna de las mutaciones fueron descritas anteriormente. No hay alteraciones de la secuencia se encontraron en los exones 18 y 19. Figura 1 alteraciones estructurales en el EGFR. (A) La secuenciación directa que muestra una de las mutaciones encontradas en el dominio quinasa de EGFR - mutación de sentido erróneo (2300 C > T) en el exón 20, dando lugar a la sustitución de la alanina 767 por una valina. (B) el carcinoma gástrico difuso con EGFR número de copias incrementado causado por el cromosoma 7 polysomy. Se encontraron (C) Las células neoplásicas que muestran la amplificación del gen con la formación de grupos con numerosas señales de EGFR.
Varios polimorfismos de EGFR en el exón 20 (Tabla 2). El polimorfismo 2361G > A Gln787Gln, descrito previamente por Mu et al
[16], estaba presente en el 55,8% (43/77) de los casos, y en nueve de los 43 casos en un estado homocigótico. Se seleccionaron 50 controles normales y el 2361G > A Gln787Gln estaba presente en el 82% de los controles (41/50). Otras dos mutaciones silenciosas (EGFR el 2301 C > T Ala767Ala y el 2415 C > T His805His) se encontraron en el exón 20, ninguno de ellos se ha descrito anteriormente. Ambos se encontraron alteraciones en un solo caso y estaban ausentes en controls.Table 2 alteraciones de la secuencia normales que se encuentran por secuenciación directa

Alteración

tipo
frecuencia

Referencias
exón 18
2184 + 19 G > Una variante Intronic
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
exón 19
2185-9 C > G
variante Intronic
1/77 todavía no se ha descrito

2283 + 11 G > Una variante Intronic
1/77 todavía no
describe
2283 + 47 G > Una variante Intronic
1/77
Sin embargo, no se describe
2283+ 49 C > T
variante Intronic
1/77 todavía no se ha descrito

exón 20
2284-60 C > T
Intronic variante
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T
sentido erróneo Ala Val 767
1/77 todavía no se ha descrito

2301 C > T
silenciosa Ala 767 Ala
1/77 todavía no se ha descrito

2361G > A
silenciosa Gln Gln 787
43/77
[16]
2415 C > T
silencioso Su 805 Su
1/77
Sin embargo, no se describe
exón 21
2524 A > G
sentido erróneo Asn Asp 842
1/77 todavía no se ha descrito

encontramos seis secuencias diferentes variantes localizadas en regiones intrónicas de EGFR, dos de ellos describió anteriormente en Ensembl [17].
Selección de números de EGFR copia Variación Francia El análisis de EGFR
número de copias, según la evaluación de hibridación in situ fluorescente (FISH), sólo fue posible en 30 de los 77 casos analizados en busca de mutaciones de EGFR. Todo EGFR
señales se compararon con las señales de las sondas centroméricas para el cromosoma 7. EGFR
más de 2,0 copias por célula (polysomy equilibrada o amplificación de genes) fueron detectados en 13,3% (4/30) de los casos. De los cuatro casos que muestran más de 2 copias de EGFR
por cromosoma 7, tres habían número de copias incrementado debido a polysomy y uno tenía la amplificación de genes, un carcinoma gástrico difuso, mostrando la formación de conglomerados con numerosas señales de EGFR
(Fig. 1B, C).
EGFR alteraciones estructurales y parámetros clínico de los pacientes y tumores
Tabla 3 muestra las asociaciones estadísticas entre alteraciones del EGFR y las características clínico-patológicas de los pacientes y tumores. Al comparar el carcinoma gástrico albergar alteraciones del EGFR con carcinomas del EGFR normal o el número de copias, se observó una asociación significativa entre las alteraciones estructurales del EGFR y el aumento de tamaño del tumor. (P = 0,0094
). No se encontraron asociaciones significativas entre las alteraciones del EGFR y otros parámetros clínico de los pacientes y tumores, a saber, el género y la edad de los pacientes, la localización del tumor, el tipo histológico, la penetración de la pared, la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos, invasión vascular y la estadificación tumoral del tumor .table 3 Asociación de EGFR alteraciones genéticas con parámetros clínico
parámetros clínico
EGFR estado

amplificación /mutación (n = 6)
normal (n = 24) guía empresas total (n = 30) guía empresas p
valor
sexo (M /M)
1/5
10/14 11/19

0,2557
Edad (SD)
62,3 ± 14,1 56,3 ± 16,8

57,5 ​​± 16,2
0,4271
tumor de localización
0,8548
proximal Estrellas: 3 página 11 página 14
distal página 3 página 13 16

Tamaño (SD)
11,6 ± 9,8 5,8 ± 2,0

6.9 ± 5.0
* 0,0094
clasificación de Lauren
0,1261
intestinal
1

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