Epidermaalisen kasvutekijän reseptori rakenteellisia muutoksia mahalaukun cancer

epidermaalisen kasvutekijän reseptori rakenteellisia muutoksia mahasyövän
Abstract
tausta
EGFR yli-ilmentyminen on kuvattu monissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien syöpään. Pienisoluista keuhkosyöpää somaattisten EGFR mutaatioita, sisällä kinaasi domeeni, samoin kuin geenin monistamisen liittyi hyvä kliinistä vastetta EGFR-inhibiittoreita. Mahalaukun kasvaimet koskevia tietoja rakenteellisia muutoksia EGFR edelleen kiistanalainen. Kun otetaan huomioon mahdollinen terapeuttinen merkitys, pyrimme määrittämään taajuuden ja tyyppi rakenteellisia muutoksia EGFR
geenin sarjan ensisijaisen mahakarsinoomat.
Menetelmät
suora sekvensointi kinaasidomeenin EGFR
geenin suoritettiin sarja 77 ensisijaisen mahakarsinoomat. FISH-analyysi suoritettiin 30 tapauksessa. Association tutkimukset välillä EGFR
muutokset ja kliinisen patologisia piirteitä kasvainten tehtiin.
Tulokset
Sisällä 77 ensisijainen mahakarsinoomat löytyi kaksi EGFR
somaattisten mutaatioiden ja useita EGFR
polymorfismit eksonissa 20. Kuusi eri introni variantteja EGFR
todettiin myös. Neljä mahakarsinoomat osoitti tasapainoinen polysomy tai EGFR
geenimonistuman. Olemme varmistaneet, että mahakarsinoo- kanssa korjauksilla EGFR
(somaattiset mutaatiot tai kopioida numeron vaihtelu) osoitti merkittävää kasvua kasvaimen koon (p
= 0,0094) verrattuna villityypin EGFR
karsinoomat.
johtopäätös
Osoitamme, että EGFR
rakenteelliset muutokset ovat harvinaisia ​​mahalaukun karsinooma, mutta kun läsnä, se johtaa kasvaimen kasvua. Me katsoi, että etsivät EGFR
muutoksia mahasyövän on todennäköisesti kliinisesti tärkeää, jotta voidaan tunnistaa potilaat herkkiä reagoimaan tyrosiinikinaasiestäjiksi.
Tausta
Mahasyöpää edelleen toiseksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti [1] skenaario, joka korostaa tarvetta tarkempi ja tehokas hoitoja. Tarkka mekanismeista mahasyövän eivät ole vielä täysin ymmärretty, mutta todisteet osoittavat yhdistyksen väylien mukana kehitysprosessien [2]. Avainmolekyylejä näistä reiteistä ovat reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t), joiden on todettu olevan poikkeavasti aktivoida tai yli-ilmentyy eri kasvaimia ja näin ollen edustavat lupaavia kohteita terapeuttiseen interventioon.
Jäsenet RTK superperheen erbB-reseptorit ovat glykoproteiineja, jotka koostuvat ekstrasellulaarisen domeenin, jossa ligandien tapahtuu, lyhyen lipofiilinen transmembraanidomeeni, ja solunsisäinen domeeni kuljettaa tyrosiinikinaasiaktiivisuuden [3, 4]. Ne mainitaan useissa kudoksissa epiteelin mesenkymaaliset ja hermosolujen alkuperää, jossa niillä keskeisiä rooleja kehittämiseen, lisääntymistä ja erilaistumista. Sääntelemättömään ilmentymiseen erbB molekyylien, eli erbB2: n, on liitetty kehittämiseen lukuisia kasvaimia, mukaan lukien mahalaukun kasvaimet. Mahalaukun karsinooma on osoitettu, että ErbB2: ta yli-ilmentyminen ohjaa geenin monistaminen ja liittyy karsinoomat korkea invasiivista potentiaalia [5]. Erbb1, joka tunnetaan paremmin nimellä epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), yliekspressio on kuvattu monissa ihmisen kasvaimissa, kuten keuhko-, paksusuoli-, rinta-, eturauhas-, aivo-, pään ja kaulan, kilpirauhasen, munasarja-, virtsarakko-, munuais- ja myös mahasyövän [6 -11], ja on korreloinut pitkälle kasvaimen vaiheesta ja huono kliiniseen tulokseen. Aivan äskettäin, osoitimme, että EGFR aktivaation liittyy lakkaa toimimasta E-kadheriinin, in vitro
[12].
Mekanismit onkogeenisten muuntamiseksi EGFR syövän ovat monistettu kopiomäärä, rakenteellisia uudelleenjärjestelyjä reseptorin , ja aktivoivat mutaatiot [13]. EGFR mutaatioita klusterin kinaasidomeenissa EGFR (eksonit 18-21), ja aiheuttaa ligandin riippumaton reseptorin aktivoitumista, mikä on mahdollista, tavoitteet terapeuttisen intervention. Tässä suhteessa, somaattisten EGFR mutaatiot sekä geenin monistamisen potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) erittäin korreloivat kliininen vaste tyrosiinikinaasin estäjät [14, 15].
Kohteessa mahalaukun kasvaimet, koskevat tiedot rakenteellisia korjauksilla EGFR edelleen kiistanalainen. Kun otetaan huomioon mahdollinen terapeuttinen merkitys, esillä olevassa tutkimuksessa pyrittiin selvittämään merkitystä EGFR rakenteelliset poikkeamat mahasyövän analysoimalla joukko ensisijaisen mahakarsinoomat kopioida numeron ja mutaatioita tyrosiinikinaasialueeseen (eksonit 18-21) EGFR
geeni.
menetelmät
Case valinta ja histopatologisia luokittelu kasvainten
edustaja lohkojen 77 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut ihmiskudokset mahalaukun primaarikasvaimista haettiin patologian osaston sairaalan S. João , kun tietoinen suostumus potilaista. Potilaille kerrottiin, että kasvain materiaalia käytettäisiin vain tutkimustarkoituksiin. Kukaan potilaista ei sisälly esillä olevaan sarjaan oli suvussa mahasyöpä. H & E- värjätään leikkeitä käytettiin luokitella kasvainten mukaan luokitukset Lauren ja Ming. Tunkeutuminen mahalaukun seinämän ja läsnäolo ja lokalisoinnin imusolmukemetastaaseja kirjattiin kaikkien potilaiden tavallisilla kriteerit patologisen lavastus. Orseiiniin leikkeitä käytettiin havaitsemiseen verisuonten invaasio.
EGFR mutaatio seulonta
Genominen DNA uutettiin 10 um osiossa mikrodissektion kasvaimen alueilla varmistaakseen puhtaus on vähintään 70% kasvainsolujen. DNA: n uutto suoritettiin käyttäen genomista DNA: ta Purification Kit (Gentra System) mukaan valmistajan protokollaa. Eksoni-alukkeet suunniteltiin ja DNA alistettiin PCR-monistus eksonien 18, 19, 20 ja 21. Nämä neljä EGFR
eksonia koodi tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.Table 1 käytetyt alukkeet PCR-amplifikaatiota varten EGFR kinaasin domeenin
eksoni

alukkeen sekvenssi
PCR-tuotteen koko (bp)
eksoni 18
Eteenpäin
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Käänteinen
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
eksoni 19
edelleen
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Käänteinen
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
eksoni 20
Eteenpäin
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Käänteinen
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
eksoni 21
edelleen
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Käänteinen
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PCR-tuotteet ajettiin 2% agaroosigeelissä ja monistettiin PCR: llä bändejä uutettiin geelistä kanssa Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Näytteet olivat sitten puhdistettu ja sekvensoitiin käyttäen ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA) seuraavat valmistajan ohjeen ja ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). Tulokset analysoitiin 3100 tiedonkeruun ohjelmistoja. Sekvensointi suoritettiin molempiin säikeitä. Tapauksissa, joissa epäillään mutaatioita PCR-monistaminen toistettiin ja näyte uudelleen sekvensoitiin poissulkemiseksi PCR artefakteja.
EGFR Kopioi numero vaihtelu Seulonta
parafiiniblokit leikeltiin 5 um ja kudosleikkeiden kuivattiin 60 ° C: ssa 30 minuuttia. Levyjä deparaffinised ja pesty seurasi esikäsittely ja ruoansulatus vaiheessa käytetään pepsiini ja lopuksi kuivattu. LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (Vysis ®), optimoitu havaitsemaan bändi alueella 7p12 taajuuksien oranssina ja centromere 7. kromosomissa (7p11.1-q11.1, D7Z1 lokus) taajuuksien vihreä, molemmat interfaasivaiheessa ytimet ja metafaasikromosomeissa, käytettiin. Viisi ui koetinta levitettiin kunkin dian. Denaturaatio suoritettiin 80 ° C: ssa 8 minuutin ajan, jota seuraa hybridisaatio kosteassa kammiossa 37 ° C: ssa 16 tunnin ajan. Hybridisaation jälkeen kalvot pestiin ja inkuboitiin 4'-6-diamino-2-fenyyli (DAPI) ja tumavärjäystä. Arvioitavaksi, kuusikymmentä 100 ehjä interphase tumat analysoitiin kaksi riippumatonta tarkkailijaa, jotta pisteet signaalit kromosomissa 7 sentromeerin ja EGFR-geenin. Ympäröivät lymfosyytit ja normaali limakalvo käytettiin sisäistä laadunvalvontaa varten määrityksissä. Vähintään kaksi tai kolme edustavalla neoplastiset solut valittiin, alle 100 x /200 x vahvistus kenttä, laskea ytimet signaaleja. Sen jälkeen kun yleiskatsaus alle 400 × vahvistus, signaalit sitten laskettiin käyttäen immersioöljy (1000 x).
Tilastollinen analyysi
Association tutkimusten välillä EGFR muutoksia ja kliinis-tapauksista tehtiin vain 30 tapauksessa (kasvaimet analysoitiin EGFR mutaatioita ja EGFR kopioluku vaihtelu). Tilastolliset analyysit arvioi x2 testin tai Studentin t
testiä. A s
arvo < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
EGFR Mutaatio Screening
Vuodesta 77 mahakarsinoomat analysoitu, EGFR
mutaatiot eksonit 18-21 havaittiin 2,6% (2/77) tapauksista (Fig. 1A). Yksi mutaatio kuului eksonia 20 ja oli missensemutaatio (2300 C > T) johtavat korvaamisen alaniini 767 varten valiini. Toinen mutaatio vaikutti eksonin 21 ja oli missensemutaatio (2524 A > G) johtavat substituition että asparagiini 842 varten asparagiinihappo. Mikään mutaatioista on kuvattu aikaisemmin. Ei jaksojen muutoksia havaittiin eksonit 18 ja 19 kuvassa 1 Rakenteelliset muutokset EGFR. (A) suora sekvensointi esittää yhtä mutaatioita löytyy kinaasidomeenia EGFR - missense-mutaatio (2300 C > T) eksonissa 20, mikä johtaa korvaamisen alaniini 767 varten valiini. (B) Diffuusi mahasyöpä EGFR lisääntynyt kopiomäärä aiheuttama kromosomissa 7 polysomy. (C) Neoplastiset solut, joilla geenin monistuksen klustereiden muodostumiseen lukuisia signaaleja EGFR.
Useita EGFR polymorfismit havaittiin eksonissa 20 (taulukko 2). Polymorfiaetsintä 2361G > Gln787Gln, aikaisemmin kuvanneet Mu et al
[16], oli läsnä 55,8% (43/77) tapauksista, ja yhdeksässä 43 tapausta on homotsygoottinen tilassa. Me seulotaan 50 normaalia valvontaa ja 2361G > Gln787Gln oli läsnä 82%: n valvonnan (41/50). Kaksi muuta EGFR hiljaiset mutaatiot (jäljempänä 2301 C > T Ala767Ala ja 2415 C > T His805His) havaittiin eksonissa 20, mikään niistä ei aiemmin on kuvattu. Molemmat muutokset havaittiin yhdessä tapauksessa ja olivat poissa normaalissa controls.Table 2 jaksojen muutoksia saapuvat suoralla sekvensoinnilla

Alteration

Tyyppi
Frequency
referenssit
eksoni 18
2184 + 19 G >
intronisekvenssejä variantti
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
eksoni 19
2185-9 C > G
intronisekvenssejä variantti
1/77
ole vielä kuvattu
2283 + 11 G >: A
intronisekvenssejä variantti
1/77
ole vielä kuvattu
2283 + 47 G >
intronisekvenssejä variantti
1/77
ole vielä kuvattu
2283+ 49 C > T
intronisekvenssejä variantti
1/77
ole vielä kuvattu
eksoni 20
2284-60 C > T
intronisekvenssejä variantti
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T
Missense Ala 767 Val
1/77
ole vielä kuvattu
2301 C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
ole vielä kuvattu
2361G >
Silent Gin 787 Gin
43/77
[16]
2415 C > T
Silent His 805 Hänen
1/77
ole vielä kuvattu
eksoni 21
2524 A > G
Missense Asn 842 Asp
1/77
ole vielä kuvattu
Löysimme kuusi erilaista sekvenssivariantteja lokalisoitu introni alueilla EGFR, joista kaksi on aiemmin kuvattu Ensembl [17].
EGFR Kopioi numero vaihtelu seulonta
analyysi EGFR
kopioluvun, joka arvioidaan fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH), oli mahdollista vain 30 77 tapauksia analysoitiin EGFR mutaatioita. Kaikki EGFR
signaaleja verrattiin signaalit sentromeerisen koettimia kromosomiin 7. Yli 2,0 EGFR
kopiota solua kohti (tasapainotettu polysomy tai geenin monistaminen) havaittiin 13,3% (4/30) tapauksista. Neljästä tapaukset osoittavat yli 2 kopiota EGFR
per kromosomi 7, kolme oli lisääntynyt kopiomäärä johtuen polysomy ja yhdellä oli geenimonistuksen, diffuusi mahasyöpä näytteille klustereiden muodostumiseen lukuisia signaaleja EGFR
(Fig. 1 B, C).
EGFR rakenteellisia muutoksia ja ennusteeseen viittaavia parametreja potilaista ja kasvainten
taulukossa 3 on esitetty tilastollisen assosiaatiot EGFR muutoksia ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia potilaiden ja kasvaimia. Verrattaessa mahakarsinoo- kätkeminen EGFR muutoksia kanssa karsinoomat normaali EGFR tilaa tai kopioida numeron, havaitsimme merkittävää yhdistyksen välillä EGFR rakenteellisia muutoksia ja lisääntynyt kasvaimen kokoa. (P
= 0,0094). Mitään merkittävää esiintynyt eroja EGFR muutoksia ja muut ennusteeseen viittaavia parametreja potilaista ja kasvaimet, eli sukupuoli ja potilaan iästä, kasvainpaikantumisen, histologinen tyyppi, läpiviennit, läsnäolo imusolmuke etäpesäke, verisuonten invaasio ja tuumorin luokitus kasvain .table 3 ry EGFR-geenin muutosten kanssa kliinis parametrien
kliinis parametrit
EGFR tila

Vahvistus /mutaatio (n = 6)
Normaali (n = 24)
Yhteensä (n = 30)
p
arvo
Sex (F /M)
1/5
10/14
11/19
0,2557
Ikä (SD) B 62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2
0,4271
Kasvainten lokalisointi
0,8548
proksimaalinen
3
11
14
Distal
3
13
16
Size (SD) B 11,6 ± 9,8
5,8 ± 2,0
6,9 ± 5,0
* 0,0094
Laurenin luokitus
0,1261
Suoliston
1
12
13
Diffuusi
5
9
14
Epätyypilliset
0
3
3
seinäläpivientejä
0,4642
Early (T1) B 0
2
2
Advanced (T2-T4) B 6
22
28
Vascular Invasion
0,7125
Absent ( N0)
3
14
17
Present (N = 1) B 3
10
13
Imusolmuke etäpesäke
0,1921
Absent
1
11
12
Present
5
13
18
Staging
0,3845
I
1
7
8
II
0
5
5
III
5
11
16
IV
0
1
1
keskustelu
EGFR-geeni sijaitsee kromosomissa 7p12 ja koodaa 170 kDa: n reseptorin, läsnä kalvon solujen inaktiivisena monomeereja. Ligandin sitoutuminen solunulkoisen domeenin reseptori käy läpi konformaatiomuutoksia, dimeroituu ja tulee autofosforyloidun keskeisillä tyrosiinijäännös solunsisäinen tyrosiinikinaasi (TK) domain. Tämä johtaa aktivaatioon loppupään reittejä, jotka säätelevät solujen eloonjäämistä, apoptoosin estämisestä ja leviämisen [18].
Paljon huomiota on kiinnitetty kasvaimia synnyttävän vaikutuksen EGFR ja ennen kaikkea menestykseen EGFR kohde hoitoja, jotka ovat hyvin vahvistettu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä karsinoomat. Rooli EGFR mahasyövän on erittäin kiistanalainen. Jotkut kirjoittajat raportoitu, että EGFR ilmentyy voimakkaasti mahalaukun syövän, mikä viittaa sen soveltuvuutta kohteena reseptori tyrosiinikinaasin estäjät [19, 20]. Käänteisesti Takehana ja kollegat ilmoitti, että yli-ilmentyminen kasvutekijän reseptori on harvinainen tapahtuma mahakarsinoo- [21] ja tapahtuu pääasiassa johtuu EGFR geenin monistamisen, vahvistaa tuloksia aikaisempien tutkimusten [22-24]. EGFR mutaatioita ensisijainen mahakarsinoo- tai mahasyövän solulinjat koskaan raportoitu [25-27]; kuitenkin äskettäin osoitti, että perinnöllinen hajanainen mahasyövän liittyy E-kadheriinin ituradan missensemutaatioita johtaa lisääntyneeseen EGFR toimintaan.
Tältä pohjalta pidimme etsivät EGFR muutoksia mahasyövässä ehkä ollut tärkeää tunnistaa terapian herkkiä tapauksia.
Kirjoittajat raportoivat läsnäollessa EGFR
lisääntynyt kopiomäärä on 13,3% 30 tapausta, joissa FISH-analyysillä oli mahdollista. Neljästä tapauksissa lisääntynyt kopiomäärä, vain yksi esitti geenimonistuksen, kun taas loput 3 tapaukset osoittivat polysomy kromosomi 7. Nämä tulokset vastaavat aikaisempien raporttien tutkivat EGFR kopiomäärä mahasyövän [22-24]. Mutaation analyysi kinaasidomeeni EGFR paljasti mutaatioiden 2,6% 77 mahakarsinoomat. Tunnistetut mutaatiot olivat sitä missense tyyppi ja oli läsnä eksonit 20 ja 21 EGFR-geenin. Yksikään tunnistettu mutaatioita oli kuvattu aikaisemmin ja niiden toiminnallinen merkitys ei ole vielä arvioitu. Kuitenkin, koska niiden lokalisointi kinaasidomeenissa EGFR, se on houkuttelevaa spekuloida, että ne vaikuttavat reseptorin aktiivisuutta ja siksi potilaita kätkeminen nämä EGFR mutaatiot voivat hyötyä tyrosiinikinaasiestäjiksi kuin terapeuttinen lähestymistapa.
Näiden mutaatioiden löydetty , muut jaksojen muutoksia tunnistettiin, kaikki klusterointi eksonissa 20. EGFR polymorfismi 2361 G > A (aikaisemmin kuvattu Ensembl) esiintyy suuri osa tapauksista ja normaalit kontrollit. Sen sijaan kaksi muuta ole vielä kuvattu hiljainen variantit eksonissa 20 (2301 C > T, 2415 C > T) olivat poissa normaaleihin kontrolleihin. Näiden lisäksi EGFR sekvenssivariantit koodausalueilla olemme myös tunnistettu vaihtelut introni reunustavat eksonit 18, 19 ja 20, mutta niiden toiminnallinen vaikutus jää epäselväksi.
Korrelaatio kliinisten parametrien tapauksia, joissa molemmat mutaatio ja FISH-analyysillä oli mahdollista, havaittiin merkittävä yhdistyksen välillä EGFR muutoksia ja kasvaimen kokoa. Mielenkiintoista, kaikki tapaukset, joissa muutokset EGFR (vahvistus /mutaatio) oli karsinoomia jo valtaavat tyvikalvon ja leviäminen mahalaukun seinämän (T2-T4), mikä viittaa siihen, että muutokset tämän geenin voi antaa invasiivisen käyttäytymisen neoplastisten solujen.
tämä hypoteesi on selvennettävä edelleen tutkimuksia, koska meillä ei todentaa tilastollisesti merkitsevä korrelaatio EGFR muutoksia ja hyökkäyksen mahalaukun seinämän (p = 0,4642), kuten juuri analised hyvin vähän varhaisen mahakarsinoomat ( n = 2) tarkoitetun sarjan. Molemmat tulokset ovat yhtä mieltä raportteja Hirono ym
., 1995 [23] ja Tsugawa ym
., 1998 [24], mikä viittaa siihen, että EGFR on osallisena kasvaimen kasvua ja aktivoimalla muutokset voivat olla myöhässä tapahtuma mukana syövän etenemiseen.
Vaikka mitään muuta tilastollisesti merkitsevää yhteyttä todettiin, on mielenkiintoista huomata, että EGFR muutokset tapahtuvat pääasiassa karsinoomat hajanainen tyyppi. Läsnäolo EGFR muutoksia diffuusi karsinoomia on päinvastoin kuin aikaisemmin havaittu muiden jäsenten erbB-reseptoriperheen mahasyövän. Vuonna mahakarsinoo- ErbB2 vahvistus havaittiin ensisijaisesti suoliston karsinoomien mahan [5].
Päätelmä
Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa osoitimme, että EGFR aktivoivat muutokset eivät ole yleinen tapahtuma mahasyövän. Muutokset ensisijaisesti näkyvät mahakarsinoomat on hajanainen alatyypin ja liittyy kasvaimen kokoa. Huolimatta matalataajuista EGFR muutoksia, tuloksemme osoittavat myös, että on olemassa rajoitettu joukolle valikoituja mahalaukun potilaista, jotka voisivat hyötyä kuin tavanomaisten hoitojen, kuten farmakologiset inhibiittorit EGFR-reseptorin.
Huomautuksia
Catia Moutinho, Ana R Mateus vaikuttanut yhtä tähän työhön.
julistukset
Kiitokset
tutkimuksen rahoittivat avustusta Fundação para a Ciência ea Tecnologia, Portugali (SFRH /BD /16747/2004, POCI /SAU - OBS /57670 /2004 ja PTDC /SAU - OBD /64319/2006).
kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 Kilpailevat edut
tekijä (t) ilmoittaa, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.

• Porrastettuja mahalaukun ohitusleikkaus - neljä vuotta seurata prospektiivisessa satunnaistetussa analyysi
• Ehtyminen OLFM4 geenin estää solujen kasvua ja lisää herkistyminen vetyperoksidia ja tuumorinekroositekijä-alfa indusoi-apoptoosin mahasyövän soluissa