epidermalni rastni dejavnik, receptor strukturne spremembe pri raku želodca

epidermalni rastni dejavnik, receptor strukturne spremembe pri raku želodca
Abstract
Ozadje
EGFR prekomerno je bil opisan v številnih človeških tumorjev, vključno z rakom želodca. Pri NSCLC bolnikov so somatske mutacije EGFR, v kinaze domeno proteina, kot tudi gen pomnoževanje povezano z dobrim klinični odziv zaviralcem EGFR. Pri želodčnih tumorjev podatke o strukturne spremembe za EGFR še vedno sporna. Glede na njena morebitna terapevtski pomen, smo želeli ugotoviti pogostnost in vrsto strukturnih sprememb v EGFR
gena v vrsto primarnih želodčnega karcinoma.
Metode
Direct Zaporedje kinaze domeni EGFR
gen smo izvedli v seriji 77 primarnih želodčnega karcinoma. Analiza FISH je bila izvedena v 30 primerih. bile opravljene zveza študije med EGFR
spremembe in kliničnih patoloških značilnosti tumorjev.
Rezultati
V 77 osnovnih želodčnega karcinoma smo ugotovili dve EGFR
somatskih mutacij in več EGFR
polimorfizmov v eksonu 20. Šest drugačen intronskih zaporedje variant EGFR
je bilo ugotovljeno tudi. Štiri želodčni karcinomi pokazala uravnotežen polysomy ali EGFR
amplifikacijo gena. Preverili smo, da raka želodca s spremembami EGFR
(somatskih mutacij ali kopirajte sprememba številka) je pokazala znatno povečanje velikosti tumorja (p
= 0,0094), v primerjavi z divjim tipom EGFR
karcinomov.
Zaključek
smo dokazati, da so EGFR
strukturne spremembe redko pri karcinomu želodca, ampak, kadar je prisoten, saj vodi k rasti tumorja. Upoštevali smo, da je iskanje EGFR
sprememb pri raku želodca verjetno klinično pomembna, da bi opredelili bolnikov dovzetne za odzivanje na tirozin kinaze inhibitorje.
Ozadje
raka želodca ostaja drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [1] scenarij, ki poudarja potrebo po bolj specifičnih in učinkovitih terapij. Natančni mehanizmi, povezane z želodčnim rakotvornost še ni povsem jasen, vendar dokazi kažejo na združenje s poti, ki sodelujejo pri razvojnih procesov [2]. Ključni molekule teh poti so receptorjev tirozin kinaz (RTK), ki se nahajajo za odklonsko aktivira ali močno izraženi pri številnih tumorjih in zato predstavljajo obetavne ciljev za terapevtsko posredovanje.
Člani RTK naddružine erbB receptorji glikoproteini, ki jih sestavljajo ekstracelični domeni, kjer vezavo ligandov poteka, kratek lipofilnega transmembransko domeno in intracelularni domena nosi aktivnost tirozin kinazno [3, 4]. Izraženi so v različnih tkivih epitelnih, mezenhimskih in nevronov izvora, na katerih imajo osrednje vloge v razvoj, rast in diferenciacijo. Deregulacijo izraz erbB molekul, in sicer erbB2, je bila vpletena v razvoju številnih vrst tumorjev, vključno želodčnih tumorjev. V raka želodca se je izkazalo, da ErbB2 prekomerno poganja gena pomnoževanjem in je povezan z karcinomov z visoko invazivno potencialom [5]. ErbB1, bolj znan kot epidermalni rastni faktor receptor (EGFR), je bila čezmernim opisan v številnih človeških tumorjev, vključno pljuč, debelega črevesa, dojke, prostate, možganov, glave in vratu, ščitnice, jajčnikov, mehurja, ledvic in tudi rak želodca [6 -11], in je povezana s fazi tumorja in slabe kliničnim izidom. Pred kratkim smo dokazali, da je aktivacija EGFR povezana z izgubo funkcije E-kadherina, in vitro
[12].
Mehanizme za onkogenih pretvorbo EGFR raka vključujejo pomnožili število kopij, strukturne preureditve za receptor in aktiviranje mutacije [13]. EGFR mutacije grozda v kinaze področju EGFR (eksonov 18-21), in povzroči ligand neodvisni aktivacijo receptorja, ki predstavljajo možne tarče za terapevtsko intervencijo. V zvezi s tem, somatske mutacije EGFR ter pomnožitev gena pri bolnikih z nedrobnoceličnim pljučnim rakom (NSCLC), močno korelira z klinični odziv na tirozin kinazni inhibitorji, [14, 15].
V želodčnih tumorjev, podatke o strukturni spremembe v EGFR še vedno sporna. Glede na njena morebitna terapevtski pomen, v tej raziskavi smo želeli pojasniti pomen EGFR strukturnih sprememb v želodcu kancerogenosti z analizo vrsto primarnih želodčnih karcinomov za številu kopij in mutacij v tirozin kinaze domeni (eksonov 18-21) v EGFR
gen.
metod
izbor primera in histopatološki klasifikacija tumorjev
Predstavništva blokov 77-formalin določen, parafin vgrajeni človekovih želodca primarnih tumorjev so bili pridobljeni iz oddelka za patologijo bolnišnice S. João po obveščena privolitev pacientov. Bolniki so bili obveščeni, da bi se tumor material, uporabljen samo za raziskovalne namene. Nihče od bolnikov, vključenih v tej seriji so imeli družinsko anamnezo raka želodca. H & E-obarvani odseki so bili uporabljeni za kategorizacijo tumorje po klasifikacijah Lauren in Ming. Penetracija želodčne stene in prisotnosti in lokalizacija bezgavkah smo zabeležili pri vseh bolnikih, ki uporabljajo standardne kriterije za patološko uprizoritve. Orcein-obarvajo odseki so bili uporabljeni za odkrivanje vaskularne invazije.
Mutacije EGFR screening
je Genomsko DNA, ekstrahirana z 10 um oddelka po mikrodisekcijo območij, tumorskih, da se zagotovi čistost vsaj 70% neoplastičnih celic. ekstrakcija DNA smo izvedli z genomsko DNA Purification Kit (GENTRA System) v skladu s protokolom proizvajalca. Ekson-specifičnih primerjev so bile oblikovane in DNA izpostavimo pomnoževanje eksonov 18, 19, 20 in 21. Štiri EGFR
eksonov kode za tirozin kinaze domeno EGFR. Primer zaporedja so prikazani v tabeli 1.Table 1 premazi, ki se uporabljajo za pomnoževanje domeni EGFR kinaze
Exon

Primer Sequence
PCR velikosti izdelka (bp)
exon 18
Forward
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Povratne
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
eXON 19
Forward
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Povratne
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
eXON 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Povratne
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
eXON 21
Forward
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Povratne
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
izdelki PCR smo izvedli na 2% agaroznem gelu in PCR, pomnoženi trakovi so bili pridobljeni iz gela z Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Vzorci so bili nato očistimo in zaporedje z Reaction Kit ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready (Perkin Elmer, Foster City, CA), ki sledi pouk Proizvodnja je in ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster mesta, CA). Rezultate smo analizirali z uporabo programske opreme 3100 zbiranja podatkov. Zaporedje je bila izvedena v obeh sklopih. V primerih, kjer obstaja sum mutacij je bila PCR ponovili, vzorec pa je bil ponovno sekvencirali za izključitev PCR artefakte.
EGFR kopiranje Število Notranja razsvetljava screening
so se parafinske bloke prerezana na 5 um in tkiv odsekih smo sušili pri 60 ° C 30 minut. Diapozitivi so deparaffinised in oprana sledi predobdelavo in razklop uporabo pepsin in končno dehidrirani. LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (VYSIS ®), optimizirana za odkrivanje pas regijo 7p12 v oranžni barvi spektra in centromero kromosoma 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) v spektru zelena, tako v medfaznih jedra in metafaznih kromosomov, je bila uporabljena. Pet xl sonde so bile uporabljene na vsako stran. Denaturacijski smo izvedli pri 80 ° C 8 minut, čemur sledi hibridizacija na vlažni komori pri 37 ° C za 16 ur. Po hibridizaciji smo drsi sprali in inkubirali z 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) za jedrsko obarvanjem. Za oceno, je bilo šestdeset do 100 nedotaknjenih medfaznih jedra analizirali z dveh neodvisnih opazovalcev, da bi zdrvel signale za kromosoma 7 centromero in gena EGFR. Okoliških limfociti in normalna sluznica so bili uporabljeni kot notranjega nadzora kakovosti za teste. Vsaj bila izbrana dva ali tri reprezentativne področja v neoplastičnih celicah, pod polju 100 x /200 x ojačanje, za štetje jeder signale. Po pregledu pod 400 x ojačanje, so bili signali nato prešteti uporabo potapljanjem olje (1.000 ×).
Statistična analiza
pridružitvenih študij med EGFR sprememb in clinicopathological značilnosti primerov so bile opravljene le v 30 primerih (kožnega raka analizirajo za EGFR mutacij in EGFR kopija variacije števil). Statistične analize so bile ocenjene s testom x2 ali test t
študenta. A p
vrednost. ≪ 0,05 zdela statistično značilno
Rezultati
EGFR mutacij Screening
Od 77 želodca karcinomov analiziranih je bilo odkritih EGFR
mutacije eksonov 18-21 pri 2,6% (2/77) od primerov (sl. 1A). Eno mutacijo pripadal eksonu 20 in je bil v missense mutacijo (2300, C > T), ki vodi do zamenjave Alaninom 767 za valin. Drugi mutacija prizadela ekson 21 in je bil missense mutacija (2524 A > G), ki vodijo do substituition v asparagin 842 za aspartinske kisline. Nobeden izmed mutacij smo že prej opisali. Ni zaporedje spremembe so bile ugotovljene v eksonih 18 in 19. Slika 1 strukturnih sprememb v EGFR. (A) Direct zaporedja prikazuje eno izmed mutacij najdemo v kinaze področju EGFR - missense mutacijo (2300, C > T) v eksonu 20, ki vodi do zamenjave alanin 767 za valin. (B) Razpršeni želodčnega karcinoma z EGFR povečanim številom kopij, ki jih kromosoma 7 polysomy škodo. (C) neoplastične celice kažejo amplifikacijo gena z oblikovanjem grozdov s številnimi signali za EGFR.
Številna EGFR polimorfizmov so našli v eksonu 20 (tabela 2). Polimorfizem 2361G > Gln787Gln, ki ga je prej opisano Mu et al
[16], je bila prisotna v 55,8% (43/77) v primerih in v devetih od 43 primerov v homozigotno stanje. pregledani smo 50 običajnih kontrol in 2361G > Gln787Gln je bil prisoten v 82% kontrol (41/50). Dve drugi EGFR tihe mutacije (Na 2301 C > T Ala767Ala in 2415 C > T His805His) so našli v eksonu 20, nobena od njih prej opisano. Oba spremembe so bile ugotovljene v enem primeru, in so odsotni v normalnih controls.Table 2 zaporedji sprememb, ki jih neposredno sekvenciranja
najdemo
sprememba

Tip
frekvenca
Reference
Exon 18
2184 + 19 G > A
intronskih varianto
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
intronskih varianto
1/77
še ni opisanega
2283 + 11 G >
intronskih varianta
1/77
še ni opisano
2283 + 47 G >
intronskih varianta
1/77
še ni opisano
2283+ 49 C > T
intronskih varianto
1/77
še ni opisanega
eXON 20
2284-60 C > T
intronskih varianto
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T
Missense Ala 767 Val
1/77
še ni opisano
2301 C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
še ni opisano
2361G >
Silent Gln 787 Gin
43/77
[16]
2415 C > T
Tiho His 805 Njegov
1/77
še ni opisano
eXON 21
2524 A > G
Missense Asn 842 Asp
1/77
še ni opisano
Ugotovili smo, šest drugačno zaporedje variante lokalizirana v intronskih regijah EGFR, dva izmed njih že opisano v Ensembl [17].
EGFR kopiranje Število Sprememba Screening
analiza EGFR
številu kopij, kot jih fluorescence ocenil in situ hibridizacija (FISH), je mogoča le v 30 od 77 analiziranih primerih za EGFR mutacij. Vse EGFR
signali so bili v primerjavi s signali za centromerne sonde za kromosomu 7. Več kot 2,0 EGFR
kopij na celico (uravnoteženi polysomy ali gena ojačanje), so bile odkrite v 13,3% (4/30) primerov. Od štirih primerih, ki kažejo več kot 2 kopij EGFR
na kromosomu 7, tri se je povečalo število kopij zaradi polysomy in je bila ena amplifikacijo gena, razpršeno karcinom želodca, kar kaže na nastanek grozdov s številnimi signali za EGFR
(sl. 1B, C).
EGFR strukturne spremembe in clinicopathologic parametri bolnikov in tumorji
Tabela 3 prikazuje statistične povezave med EGFR sprememb in clinicopathologic značilnosti bolnikov in tumorjev. Če primerjamo želodčni karcinom zatočišča EGFR spremembe s karcinomom z normalnim stanjem EGFR ali številu kopij, smo opazili pomembno povezavo med EGFR strukturne spremembe in večjo velikost tumorja. (P
= 0,0094). Ni bistvenih združenja bile ugotovljene med EGFR sprememb in drugih clinicopathologic parametrov bolnikov in tumorjev, in sicer spol in starost bolnikov, tumorja lokalizacijo histološki tip, penetracija stene, prisotnost bezgavk metastaz, vaskularne invazije in tumorja uprizoritev tumorja .table 3 združenje EGFR genske spremembe z clinicopathological parametri
Clinicopathological parametri
EGFR statusa

Amplification /mutacija (n = 6)
Normal (n = 24)
Skupaj (n = 30)
p
vrednost
Sex (F /M)
1/5
10/14
11/19
0.2557
Age (SD)
62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2
0,4271
tumorja lokalizacija
0.8548
proksimalnem
3
11
14
Distalno
3
13
16
Velikost (SD)
11,6 ± 9,8
5,8 ± 2,0
6,9 ± 5,0
* 0,0094
uvrstitev Lauren
0,1261
Črevesne
1
12
13
razpršenih
5
9
14
Neobičajni
0
3
3
Wall penetracija
0,4642
Zgodnje (T1)
0
2
2
Napredno (T2-T4)
6
22
28
Vascular Invasion
0.7125
odsoten ( N0)
3
14
17
Present (N = 1)
3
10
13
limfnega vozla metastaze
0.1921
Je ni
1
11
12
Present
5
13
18
uprizoritev PODJETJA
0,3845
sem
1
7
8
II
0
5
5
III
5
11
16
IV
0
1
1
diskusija
EGFR gen se nahaja na kromosomu 7p12 in oznakami za receptor 170-kDa prisotni v membrano celic kot neaktivna monomerov. Na ligand veže na zunajcelično domeno receptorja opravi konformacijske spremembe, dimerises in postane autophosphorylated v ključnih ostanke tirozina v intracelularni tirozin kinazo (TK) domeno. To vodi do aktivacije prodajnih poti, ki nadzorujejo celično preživetje, inhibicijo apoptoze in orožja [18].
Veliko pozornosti je bilo treba na onkogenih učinka EGFR in predvsem na uspeh EGFR ciljnih terapij, ki so dobro določena za nedrobnocelični pljučni karcinom. Vloga EGFR pri raku želodca je zelo sporna. Nekateri avtorji poročajo, da je EGFR močno izražen pri raku želodca, kar kaže na njegovo primernost kot cilj za inhibitorjev kinaze receptorja tirozin [19, 20]. Nasprotno, Takehana in sodelavci so poročali, da je čezmernim epidermalni rastni faktor receptor redek dogodek želodčnega raka [21] in se pojavlja predvsem zaradi EGFR gena ojačanja, kar potrjuje rezultate iz prejšnjih študij [22-24]. EGFR mutacij v primarnem želodca raka ali želodca raka celičnih linijah nikoli niso poročali [25-27]; Kljub temu smo pred kratkim pokazala, da je dedni razpršenih rak želodca, povezanih E-kadherina reproduktivnih missense mutacije vodi do povečane aktivnosti EGFR.
Na podlagi tega smo menili, da bi bilo iskanje EGFR sprememb pri raku želodca pomembno ugotoviti terapije občutljive primere.
Tukaj smo poročanje o prisotnosti EGFR
povečanim številom kopij v 13,3% od 30 primerov, v katerih je mogoče analiza FISH. Od štirih primerih s povečanim številom kopij, enim predstavila gena ojačanja, medtem ko preostali 3 primeri pokazala polysomy od kromosoma 7. Ti rezultati se ujemajo prejšnja poročila preiskovalne število EGFR kopij na raka želodca [22-24]. Mutacij Analiza kinaze področju EGFR pokazala prisotnost mutacij pri 2,6% 77 želodčnega karcinoma. Ugotovljene so bile mutacije tipa missense in so prisotni v eksonih 20 in 21 gena EGFR. Nobena od ugotovljenih mutacij je bilo opisano prej in njihov funkcionalni pomen še ni ocenjena. Vendar pa je zaradi njihove lokalizacije v kinaze domeni EGFR, je skušnjava, da domnevajo, da vplivajo na aktivnost receptorja in zato lahko bolniki zatočišča te mutacije EGFR koristi od zaviralcev tirozin kinaze kot terapevtskega pristopa.
Poleg teh mutacij najdenih so bile ugotovljene druge zaporedje sprememb, vse povezovanje v eksonu 20. EGFR polimorfizem 2361 G > a (prej opisano v Ensembl) pojavi v visokem odstotku primerov, pri normalnih kontrolah. V nasprotju s tem, drugi dve pa še ni opisana neme variant v eksonu 20 (2301 C > T, 2415 C > T) so bile odsotne v običajnih kontrol. Poleg teh EGFR zaporedju različice v kodirnih regij, smo ugotovili tudi razlike v intronskih zaporedju spremljajočih eksonov 18, 19 in 20, vendar je njihov funkcionalni učinek ostaja nejasna.
Korelacijo kliničnih parametrov v primerih, za katere tako mutacija in FISH analizo je bilo mogoče, so pokazali pomembno povezavo med EGFR spremembe in velikost tumorja. Zanimivo je, da so bili vsi primeri s spremembami v EGFR (pomnoževanje /mutacije) karcinomov že preplavljajo bazalno membrano in širi v želodčni steni (T2-T4), kar kaže, da lahko spremembe tega gena dajejo invazivno obnašanje neoplastične celice.
Vendar pa je ta hipoteza je treba pojasniti z dodatnimi študijami, saj nismo preverili statistično pomembno povezanost med EGFR spremembe in invazijo v želodčni steni (p = 0.4642), kot smo pravkar analised zelo majhno število zgodnjih želodčnih karcinomov ( n = 2) v naši seriji. Oba rezultata sta v dogovoru s poročili Hirono et al
., 1995 [23] in Tsugawa et al
., 1998 [24], kar kaže, da je EGFR je vpletena v rast tumorja in aktiviranja spremembe je lahko prepozno dogodek vpleten v napredovanja tumorja.
Čeprav je bilo ugotovljeno nobeno drugo statistično značilno povezavo, je zanimivo opaziti, da EGFR spremembe pojavljajo predvsem v karcinomov difuznega tipa. Prisotnost EGFR sprememb v razpršenih karcinomov je v nasprotju s tem, kar je prej opazili druge člane družine erbB receptorja raka želodca. Želodčnega karcinoma erbB2 ojačanje bila odkrita preferenčno v črevesni karcinom želodca [5].
Zaključek
in zaključek, v tej študiji smo dokazali, da so EGFR sprožitev sprememb ni pogost dogodek v želodcu rakotvornost. Spremembe prednostno pojavljajo v želodčnih karcinomov razpršenega podtip in so povezani z velikostjo tumorja. Kljub nizki frekvenci EGFR sprememb, naši rezultati kažejo, da je omejena skupina izbranih želodčnih bolnikov, ki bi lahko imeli koristi od zunaj konvencionalnih terapij, vključno s farmakološkimi inhibitorji receptorja EGFR.
Opombe
CATIA Moutinho, Ana R Mateus prav tako prispevali k temu delu
deklaracij
Zahvala
Ta študija je bila financirana z donacijami Fundação para Fiktivnih ea Tecnologia, Portugalska (SFRH /BD /16747/2004, POCI /SAU -. OBS /57670 /2004 in PTDC /SAU -. OBD /64319/2006)
avtorjev originalnih predloženi datoteke za slike
Spodaj so povezave do avtorjev izvirnih predloženih spisov za slike. Izvirna datoteka 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf avtorjev na sliki 1 nasprotujočimi si interesi
Avtor (y) izjavi, da nimajo konkurenčnih interesov.

• Odvisnih želodčnim obvodom - štiri leta spremljala v prospektivni multicentrični analysis
• Izčrpavanje OLFM4 gena zavira rast celic in poveča preobčutljivost vodikovega peroksida in faktor tumorske nekroze-alfa inducirane-apoptoze v želodčni rak cells