receptor epidermálneho rastového faktora štrukturálne zmeny v žalúdku cancer

receptora epidermálneho rastového faktora štrukturálne zmeny v karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
EGFR nadmerná expresia bola opísaná u mnohých ľudských nádorov, vrátane karcinómu žalúdka. V NSCLC pacientov somatických mutácií EGFR, a to v kinázovej doméne proteínu, rovnako ako amplifikácia génu boli spojené s dobrou klinickou odpoveďou na inhibítory EGFR. V nádorov žalúdku údaje o štrukturálne zmeny EGFR zostáva kontroverzné. S ohľadom na jeho možné terapeutické význam, sme sa zamerali určiť frekvenciu a typ štrukturálnych zmien EGFR
génu v sérii primárnych karcinómov žalúdka.
Metódy
Priame sekvenovanie kinázovej doméne EGFR
génu bola vykonaná v sérii 77 primárnych karcinómov žalúdka. Analýza FISH bola vykonaná v 30 prípadoch. boli vykonané štúdie o pridružení medzi EGFR
zmeny a klinických patologických rysov nádorov.
Výsledky
rámci 77 hlavných žalúdočných karcinómov sme našli dva EGFR
somatické mutácie a niekoľko EGFR
polymorfizmy v exóne 20. Šesť rôzne intronové sekvencie varianty EGFR
boli tiež nájdené. Štyri žalúdočné karcinómy konzistentnejší polyzomie alebo EGFR
amplifikáciu génu. Overili sme, že rakovina žalúdka so zmenami EGFR
(somatických mutácií alebo kopírovať číslo variácie) ukázala významné zvýšenie veľkosti nádoru (p = 0,0094
) v porovnaní s divokým typom EGFR
karcinómov.
záver
sme dokázať, že EGFR
stavebné úpravy sú zriedkavé v karcinómu žalúdka, ale keď je prítomná, sa vedie k rastu nádoru. považované, že sme hľadali EGFR
zmeny v karcinómu žalúdka, je pravdepodobné, že bude klinicky významné s cieľom určiť pacientmi náchylné reagovať na inhibítory tyrozínkinázy.
Pozadie
rakovina žalúdka zostáva druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu na celom svete [1] scenár, ktorý zdôrazňuje potrebu presnejších a účinnejších terapií. Presné mechanizmy žalúdočné karcinogenéze nie sú ešte celkom známy, ale dôkazy ukazujú na asociáciu s dráhach zapojených do vývojových procesov [2]. Kľúčové molekuly týchto dráh sú receptorové tyrozínkinázy (RTK), ktoré, ako bolo zistené aberantne aktivované alebo nadmerne exprimovaný v rôznych nádoroch, a preto predstavujú sľubné ciele pre terapeutickú intervenciu.
Členovia RTK superrodiny receptorov sú ErbB glykoproteíny, ktoré sa skladajú z extracelulárnej domény, kde je väzba ligandov dochádza, krátky lipofilný transmembránovú doménu a intracelulárnu doménu nesúci aktivitu tyrozínkinázy [3, 4]. Sú vyjadrené v niekoľkých tkanivách epiteliálnych, mezenchýmových a neurónový pôvodu, v ktorých hrajú kľúčovú úlohu vo vývoji, proliferácie a diferenciácie. Deregulované expresie ErbB molekúl, a to erbB2, sa podieľa na vývoji početných typov nádorov, vrátane nádorov žalúdka. V karcinómu žalúdka, že bolo preukázané, že nadmerná expresia ErbB2 je poháňaný amplifikácie génu a je spojená s karcinómami s vysokým potenciálom invazívnej [5]. ErbB1, lepšie známy ako receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR), nadmerná expresia bola popísaná u mnohých ľudských nádorov, vrátane rakoviny pľúc, hrubého čreva, prsníka, prostaty, mozgu, hlavy a krku, štítnej žľazy, vaječníkov, močového mechúra, obličiek a tiež rakovina žalúdka [6 -11], a bola korelované s pokročilej fáze nádoru a zlým klinickým výsledkom. Nedávno sme ukázali, že aktivácia EGFR je spojená so stratou funkcie E-cadherinu, in vitro
[12].
Mechanizmy pre onkogénne konverziu EGFR v rakoviny zahŕňajú zosilnený počet kópií štrukturálne preskupenie receptora a aktivačné mutácie [13]. EGFR mutácie klastra v kinázovej doméne EGFR (exóny 18-21), a spôsobujú na ligandu nezávislú aktiváciu receptora, čo predstavuje možné ciele pre terapeutické intervencie. V tomto ohľade, somatické mutácie EGFR, rovnako ako amplifikácia génu u pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc (NSCLC) vysoko koreluje s klinickou odpoveďou na inhibítory tyrozínkinázy [14, 15].
V nádorov žalúdka, údaje týkajúce sa konštrukčné zmeny EGFR zostáva kontroverzné. Vzhľadom k jeho možnej terapeutickej význam, ktorý v tejto štúdii sme sa zamerali na objasnenie významu EGFR štrukturálne zmeny v žalúdočnej karcinogenéze tým, že analyzuje rad primárnych žalúdočných karcinómov na počte kópií a mutáciami v tyrozín kinázovej doméne (exóny 18-21) v EGFR
génu.
metódy
výber Case a histopatologické klasifikácia nádorov
Reprezentatívny bloky 77 formalínom fixované, parafínové zakotvené v žalúdku človeka primárnych nádorov boli získané z oddelenia patológie Fakultnej nemocnice S. João po informovaný súhlas pacientov. Pacienti boli informovaní, že nádor materiál budú použité len na výskumné účely. Žiadny z pacientov zaradených v tejto sérii mal rodinnú anamnézu rakoviny žalúdka. H & E- zafarbené rezy boli použité na kategorizáciu nádorov v súlade s klasifikáciou Lauren a Ming. Penetrácia steny žalúdka a prítomnosť a lokalizácia lymfatických uzlín boli zaznamenané pre všetkých pacientov s použitím štandardných kritérií pre patologické staging. Orceínu zafarbené rezy boli použité pre detekciu vaskulárnej invázie.
EGFR mutácia screening
genómovej DNA bola extrahovaná z 10 um úseku po mikrodisekcii nádorových oblastiach s cieľom zabezpečiť čistotu aspoň 70% nádorových buniek. Extrakcie DNA sa vykonáva za použitia genómovej DNA Purification Kit (Gentry System) podľa protokolu výrobcu. Exon-špecifické primery boli navrhnuté a DNA bola podrobená PCR amplifikáciu exónov 18, 19, 20 a 21. Štyri EGFR
exóny kód pre tyrozín kinázovej doméne EGFR. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1 1.Table priméry použité pre PCR amplifikáciu EGFR kinázovej domény
Exon

sekvencie primeru
PCR veľkosť produkt (bp)
exón 18
Forward
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Reverzný
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
exón 19
vpred
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Reverzný
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
exón 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Reverzný
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
exón 21
vpred
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Reverzný
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
produkty PCR boli vykonané na 2% agarosovém gélu a PCR amplifikovanej pásy boli extrahované z gélu s pruh na gélu s Purification Kit (GE Healthcare). Vzorky boli potom čistené a sekvenované za použitia ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA) po pokyne výroba a ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). Výsledky sa analyzujú za použitia 3100 software pre zber dát. Sekvenovanie bolo vykonané v oboch reťazcoch. V prípadoch s podozrením na mutáciou bola PCR amplifikácie opakuje a vzorka sa znovu sekvencovania vylúčiť PCR artefakty.
EGFR variácií v počte kópií Screening
parafínové bloky boli narezané na 5 um a tkanivových rezoch sa suší pri teplote 60 ° C po dobu 30 minút. Sklíčka bola deparaffinised a premyje sa následne predbežného spracovania a krok digescia pomocou pepsínu a nakoniec dehydratácii. LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (Vysis ®), optimalizovaný pre detekciu pásma oblasť 7p12 oblasti spektra oranžovej a centromér chromozómu 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) v spektre zelené, a to ako v bunkových jadrách a na metafázy chromozómov, bola použitá. Päť ul sondy boli aplikované na každej sklíčko. Denaturácia bola vykonávaná pri teplote 80 ° C počas 8 minút, potom nasleduje hybridizácia na vlhkej komore pri teplote 37 ° C počas 16 hodín. Po hybridizácii boli rezy premyté a inkubované s 4'-6-diamidínov-2-fenylindol (DAPI) pre jadrovú farbenie. Pre vyhodnotenie, šesťdesiat až 100 neporušené bunkových jadrách boli analyzované dvoma nezávislými pozorovateľmi, aby sa skóre signály pre chromozómu 7 centromér a génu EGFR. Okolité lymfocyty a normálne sliznice boli použité ako vnútornej kontroly kvality pre testy. Aspoň boli vybrané dva alebo tri reprezentatívne oblasti neoplastických buniek, na základe zosilnenie pole 100 x /200 x, počítať jadra signály. Po prehľade pod 400 × zosilnenie je, že signály boli potom počítané za použitia imerzný olej (1000 ×).
Štatistická analýza
štúdií o pridružení medzi EGFR zmeny a klinicko-rysy prípadov sa uskutočnili len u 30 prípadov (nádory analyzované na EGFR mutácií EGFR a variácií v počte kópií). Štatistické analýzy boli hodnotené pomocou testu X2 alebo Studentov
testu. P
hodnota. ≪ 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú
Výsledky
EGFR mutácie skríningu predaj z 77 žalúdočných karcinómov analyzovaných EGFR
mutácie exónov 18-21 boli zistené v 2,6% (2/77) prípadov (obr. 1A). Jedna mutácia patrí k exónu 20 a bol missense mutácie (2300 C > T), čo vedie k nahradeniu alanínu 767 pre valín. Druhá mutácia ovplyvnená exón 21 a bol missense mutácie (2524 A > G), čo vedie k substituition asparagínu 842 na kyselinu asparágovú. Žiadny z mutácií bolo predtým popísané. Žiadne sekvenčné zmeny boli nájdené v exóne 18 a 19. Obrázok 1 štrukturálnych zmien v EGFR. (A) priame sekvenovanie ukazuje jednu z mutácií nájdených v kinázovej doméne EGFR - missense mutácie (2300 C > T) v exóne 20, čo vedie k substitúcii alanínu 767 pre valín. (B) Difúzny karcinóm žalúdka s EGFR zvýšeným počtom kópií spôsobené chromozómu 7 polyzomie. (C) nádorových buniek, ktoré vykazujú amplifikáciu génu s tvorbou zhlukov s početnými signálmi pre EGFR.
Niekoľko EGFR polymorfizmy boli nájdené v exóne 20 (tabuľka 2). Polymorfizmus 2361G >, A Gln787Gln, bolo popísané predtým Mu et al
[16], bol prítomný v 55,8% (43/77) prípadov, av deviatich z 43 prípadov, v homozygotnom stave. premietané sme 50 normálnych kontrol a 2361G >, A Gln787Gln bola prítomná u 82% kontrol (41/50). Dva ďalšie EGFR tiché mutácie (ďalej len 2301 C > T Ala767Ala a 2415 C > T His805His) boli nájdené v exóne 20, žiadny z nich bolo popísané vyššie. Obe zmeny boli nájdené v jednom prípade, a neboli prítomné u normálnych controls.Table 2 Sequence zmien zistených priamym sekvenovania

premeny

Sem
Frekvenčný
Referencie
Exon 18
2184 + 19 G > A
intronové variant
2/77
Ensemble
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
intronové variante
1/77
dosiaľ opísané
2283 + 11 G >, a
intronové variant
1/77
doteraz bolo popísané
2283 + 47 G >, a
intronové variant
1/77
doteraz bolo popísané
2283+ 49 C > T
intronové variante
1/77
dosiaľ opísané
Exon 20
2284-60 C > T
intronové variantu
2/77
ensemble
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C >T
chybných Ala 767 Val
1/77
doteraz bolo popísané
2301 C > T
Tichý Ala 767 ala
1/77
doteraz bolo popísané
2361G >, a
Silent Gin Gin 787
43/77
[16]
2415 C > T
Silent His 805 Jeho
1/77
doteraz bolo popísané
Exon 21
2524 a >g
chybných Asn 842 Asp
1/77
doteraz bolo popísané
Zistili sme, šesť rôzne sekvenčné varianty lokalizované v oblastiach IntronA EGFR, dvaja z nich už bolo opísané v Ensemble [17].
EGFR variácií v počte kópií Screening
analýza EGFR
počtu kópií, ako bolo hodnotených fluorescenčnej in situ hybridizácia (FISH), bolo možné len v 30 z 77 analyzovaných prípadov pre EGFR mutácií. Všetky EGFR
signály boli porovnané s signálov pre centromerických sond pre chromozóme 7. Viac ako 2,0 EGFR
kópií na bunku (vyvážené polyzomie alebo amplifikácie génu) na 13,3% (4/30) prípadov boli zistené. Zo štyroch prípadov, ktoré má viac ako 2 kópie EGFR
na chromozóme 7, tri zvýšil počet kópií v dôsledku polyzomie a jeden mal amplifikáciu génu, difúzna karcinóm žalúdka, vykazujúci tvorbu zhlukov s početnými signálmi pre EGFR
(obr. 1B, C).
EGFR stavebné úpravy a patologickým parametre pacientov a nádorov
Tabuľka 3 ukazuje štatistické vzťahy medzi EGFR zmeny a patologickým charakteristiky pacientov a nádorov. Ak porovnáme žalúdočné karcinóm nesúce EGFR zmeny s karcinómy s normálnym stavu EGFR alebo počtu kópií, sme pozorovali významnú súvislosť medzi EGFR stavebných úprav a zvýšenie veľkosti nádoru. (P = 0,0094
). Žiadne významné asociácie boli nájdené medzi EGFR zmenami a ďalšími patologickým parametrov pacientov a nádorov, a to pohlavia a veku pacientov, lokalizácia tumoru, histologický typ, penetrácia stien, prítomnosť lymfatických uzlín, vaskulárnej invázie a nádoru predstavovať nádoru .Table 3 asociácia EGFR génové zmeny s klinicko-parametre
klinicko-parametre
EGFR stav

Zosilnenie /mutácie (n = 6)
Normal (n = 24)
Celkom (n = 30)
p
hodnota
sex (F /M)
1/5
10/14
11/19
0.2557
Age (SD)
62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2
0,4271
lokalizácia tumoru
0.8548
proximálnom Sims 3
11
14
distálnej Sims 3
13
16
Size (SD)
11,6 ± 9,8
5,8 ± 2,0
6,9 ± 5,0
* 0,0094
Lauren klasifikácie
0,1261
Črevné
1
12
13
Difúzna
5
9
14
Atypický
0 Sims 3 Sims 3
Wall penetrácia
0,4642
Early (T1)
0
2
2
Advanced (T2-T4)
6
22
28
vaskulárnej invázie
0.7125
prítomné ( N0) Sims 3
14
17
k dispozícii (N = 1) Sims 3
10
13
lymfatických uzlín
0.1921
Absent
1
11
12
Present
5
13
18
Staging
0,3845
Aj
1
7
8
II
0
5
5
III
5
11
16
IV
0
1
1
diskusia
EGFR gén je umiestnený na chromozóme 7p12 a kóduje receptor, 170 kDa, ktorý je obsiahnutý v membráne buniek, ako inaktívne monoméry. Na väzbu ligandu na extracelulárnej doménu, receptor podstúpi konformační zmeny, dimerises a stane sa autophosphorylated v kľúčových tyrosinových zvyškov v intracelulárnu tyrozín kinázy (TK) doménu. To vedie k aktivácii následných dráh, ktoré riadia prežívanie buniek, inhibíciu apoptózy a proliferácie [18].
Veľká pozornosť bola zameraná na onkogénne účinok EGFR a predovšetkým k úspechu EGFR cieľových terapiou, ktoré sú dobre stanovené pre nie malobunkovým karcinómom pľúc. Úloha EGFR v karcinómu žalúdka, je veľmi sporný. Niektorí autori uvádzajú, že EGFR je vysoko exprimovaný u karcinómu žalúdka, čo naznačuje, že je vhodná ako cieľ pre inhibítory receptorov tyrozín kináz [19, 20]. Naopak, Takehana a spolupracovníci uvádzajú, že nadmerná expresia receptora epidermálneho rastového faktora je vzácna udalosť v karcinómu žalúdka [21] a sa vyskytuje prevažne v dôsledku amplifikácie génu EGFR, čo potvrdzuje výsledky predchádzajúcich štúdií [22-24]. EGFR mutácie v primárnom karcinómu žalúdka alebo žalúdočných rakovinových bunkových línií nikdy neboli hlásené [25-27]; Avšak v poslednej dobe sme sa ukázalo, že dedičné difúzna rakovinu žalúdka súvisiace E-cadherin zárodočnej línie missense mutácia vedie k zvýšenej aktivite EGFR.
Na tomto základe sme sa za to, že vyhľadávanie EGFR zmeny v karcinómu žalúdka mohlo byť dôležité identifikovať terapia citlivé prípady.
Tu hlásiť prítomnosť EGFR
zvýšeného počtu kópií v 13,3% z 30 prípadov, v ktorých bolo možné analýza FISH. Zo štyroch prípadov so zvýšeným počtom kópií, len jeden predloženej amplifikácie génu, zatiaľ čo zvyšné 3 prípady ukázala polyzomie chromozóme 7. Tieto výsledky zodpovedajú predchádzajúcej správy vyšetruje počet kópií EGFR u karcinómu žalúdka [22-24]. Mutačná analýza kinázovej doméne EGFR odhalili prítomnosť mutácií v 2,6% 77 žalúdočných karcinómov. Identifikované mutácie boli typu missense a boli prítomné v exóne 20 a 21 génu EGFR. Žiadny z identifikovaných mutácií boli popísané vyššie a ich funkčné význam nie je doteraz hodnotená. Avšak, vzhľadom k ich lokalizácii v kinázovej doméne EGFR, je lákavé špekulovať, že majú vplyv na aktivitu receptoru, a preto by pacienti nesúci tieto mutácie EGFR môžu mať prospech z inhibítorov tyrozínkinázy ako terapeutický prístup.
Okrem týchto mutácií nájdených , boli identifikované ďalšie sekvenčné zmeny, všetky clustering v exóne 20. EGFR polymorfizmu 2361 G > a (už bolo popísané v Ensemble) sa vyskytuje vo vysokom percente prípadov a u normálnych kontrol. Na rozdiel od toho ďalšie dva doteraz popísaný tiché varianty v exóne 20 (2301 C > T, 2415 C >, t) neboli prítomné v normálnych kontrol. Okrem týchto EGFR sekvenciu varianty v kódujúcich oblastí, sme tiež identifikovať odchýlky v intronové sekvencie exónov 18, 19 a 20, ale ich funkčné efekt zostáva nejasný.
Koreláciu klinických parametrov pre prípady, pri ktorých sú mutácie a FISH analýzy bolo možné, ukázala významnú súvislosť medzi EGFR zmeny a veľkosti nádoru. Je zaujímavé, že vo všetkých prípadoch so zmenami v EGFR (amplifikácie /mutácie) boli karcinómy už napádať bazálnej membránou a rozširujúcich sa do žalúdočnej steny (T2-T4), čo naznačuje, že zmeny tohto génu môžu zveriť invazívne správanie na nádorových buniek.
Avšak, je potrebné táto hypotéza byť objasnené ďalších štúdií, pretože sme nemali overiť štatisticky významnú koreláciu medzi EGFR zmeny a invázie do steny žalúdka (p = 0.4642), ako sme práve analyzovanom veľmi nízky počet predčasných žalúdočných karcinómov ( n = 2), v našom seriáli. Oba výsledky sú v súlade so správami o Hirono et al
., 1995 [23] a Tsugawa et al
., 1998 [24], čo naznačuje, že EGFR sa podieľa na raste nádoru a aktivačný úpravy môže byť neskoro akcie zapojené do progresie nádoru.
Aj keď žiadny iný štatisticky významná súvislosť bolo zistené, že je zaujímavé si všimnúť, že EGFR zmenám dochádza najmä v karcinómy difúzneho typu. Prítomnosť EGFR zmeny v rozptýlených karcinómov je v kontraste s tým, čo už skôr u iných členov rodiny ErbB receptorov v karcinómu žalúdka. Žalúdočné karcinóm ErbB2 amplifikácia bola zistená prednostne v črevných karcinómov žalúdka [5].
Záver
Záverom, v tejto štúdii sme preukázali, že EGFR aktivujúce zmeny nie sú častým udalosť v žalúdočnej karcinogenéze. Zmeny prednostne sa objaví v žalúdku karcinómy difúzneho subtypu a sú spojené k veľkosti nádoru. Aj napriek nízkou frekvenciou EGFR zmeny, naše výsledky tiež naznačujú, že je tu obmedzená skupina vybraných žalúdka u pacientov, ktoré by mohli mať prospech z nekonvenčných terapiou, vrátane farmakologických inhibítory receptoru EGFR.
Notes
CATI Moutinho, Ana R Mateus prispel rovnako k tejto práci
deklarácie
Poďakovanie
Táto štúdia bola financovaná z grantov Fundação parašutista Ciencia ea Tecnologia, Portugalsko (SFRH /BD /16747/2004, poci /SAU -. OBS /57670 /2004 a PTDC /SAU -. OBD /64319/2006)
autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodných predložených súbory pre obrazy. Pôvodný súbor 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf autorov na obrázku 1 protichodnými záujmami
Autor (ri) vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Pruhovaný žalúdočné bypass - štyri roky sledovania v prospektívnej analýzy multicentrickej
• Vyčerpanie OLFM4 gén inhibuje bunkový rast a zvyšuje senzibilizáciu na peroxid vodíka a faktor nekrózy nádorov-alfa indukovanej-apoptózy v rakovinových bunkách žalúdku