le récepteur du facteur de croissance épidermique altérations structurelles dans les récepteurs du facteur de croissance épidermique cancer

altérations structurales gastriques dans le cancer gastrique
Résumé de l'EGFR Contexte
surexpression a été décrite dans de nombreuses tumeurs humaines, y compris le cancer gastrique. Chez les patients atteints de NSCLC mutations somatiques de l'EGFR, dans le domaine kinase de la protéine, ainsi que l'amplification de gènes ont été associés à une réponse clinique aux inhibiteurs de l'EGFR. Dans les tumeurs gastriques données concernant les modifications structurelles de l'EGFR reste controversée. Compte tenu de sa possible pertinence thérapeutique, nous avons cherché à déterminer la fréquence et le type d'altérations structurales du gène de l'EGFR dans une série de carcinomes gastriques primaires.
Méthodes
séquençage direct du domaine kinase de l'EGFR
gène a été réalisée dans une série de 77 carcinomes gastriques primaires. analyse FISH a été réalisée dans 30 cas. Les études d'association entre l'EGFR de les altérations et les caractéristiques cliniques pathologiques des tumeurs ont été effectuées.: Résultats
Dans les 77 carcinomes gastriques primaires, nous avons trouvé deux EGFR de mutations somatiques et plusieurs polymorphismes EGFR
dans l'exon 20. Six séquence intronique différentes variantes de l'EGFR
ont également été trouvés. Quatre carcinomes gastriques ont montré polysomie équilibré ou d'un gène de l'amplification de l'EGFR. Nous avons vérifié que le carcinome gastrique avec des altérations de l'EGFR (de mutations somatiques ou le nombre de copies variation) a montré une augmentation significative de la taille de la tumeur (p = 0,0094
) par rapport aux carcinomes de type sauvage EGFR.
Conclusion
Nous démontrons que des modifications structurelles de l'EGFR sont rares dans le carcinome gastrique, mais chaque fois présent, il conduit à la croissance de la tumeur. Nous avons considéré que la recherche de l'EGFR de les altérations dans le cancer gastrique est susceptible d'être cliniquement important dans le but d'identifier les patients susceptibles de répondre aux inhibiteurs de tyrosine kinase.
Contexte
cancer gastrique reste la deuxième cause de décès par cancer dans le monde entier [1] un scénario qui met en évidence le besoin de thérapies plus spécifiques et efficaces. Les mécanismes exacts sous-jacents carcinogenèse gastrique ne sont pas encore entièrement compris, mais les preuves indiquent une association avec des voies impliquées dans les processus de développement [2]. des molécules clés de ces voies sont les tyrosine kinases de récepteur (RTK), qui se trouvent être aberrante activé ou surexprimé dans une variété de tumeurs, et par conséquent, représentent des cibles prometteuses pour une intervention thérapeutique.
Les membres de la superfamille TKP des récepteurs erbB sont glycoprotéines qui se composent d'un domaine extracellulaire, où la liaison de ligands a lieu, un domaine lipophile court transmembranaire et un domaine intracellulaire portant l'activité tyrosine kinase [3, 4]. Ils sont exprimés dans plusieurs tissus épithéliales, mésenchymateuses et origine neuronale, où ils jouent un rôle essentiel dans le développement, la prolifération et la différenciation. l'expression dérégulée de molécules ERBB, à savoir ERBB2, a été impliquée dans le développement de nombreux types de tumeurs, y compris les tumeurs gastriques. Dans le cancer gastrique, il a été démontré que la surexpression de ErbB2 est entraîné par amplification génique et est associée aux carcinomes ayant un potentiel invasif élevé [5]. ErbB1, mieux connu comme le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), la surexpression a été décrite dans de nombreuses tumeurs humaines, y compris le poumon, du côlon, du sein, de la prostate, du cerveau, de la tête et du cou, de la thyroïde, de l'ovaire, de la vessie, des reins et aussi cancer de l'estomac [6 -11], et a été corrélée à un stade tumoral avancé et les résultats cliniques pauvres. Très récemment, nous avons démontré que l'activation de l'EGFR est associée à une perte de fonction de la E-cadhérine in vitro
[12].
Les mécanismes de transformation oncogénique de l'EGFR dans les cancers comprennent le nombre de copies amplifié, réarrangements structuraux du récepteur et des mutations activatrices [13]. des mutations de l'EGFR cluster dans le domaine kinase de l'EGFR (exons 18-21), et provoquent l'activation indépendante du ligand du récepteur, ce qui représente des cibles possibles pour une intervention thérapeutique. À cet égard, les mutations de l'EGFR somatiques, ainsi que l'amplification génique chez des patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) corrèlent fortement avec la réponse clinique aux inhibiteurs de tyrosine kinase [14, 15].
Dans les tumeurs gastriques, des données concernant la structure les altérations de l'EGFR reste controversé. Compte tenu de sa possible pertinence thérapeutique, dans la présente étude, nous avons cherché à clarifier la pertinence des EGFR modifications structurelles dans la carcinogenèse gastrique en analysant une série de carcinomes primaires gastriques pour le nombre de copies et des mutations dans le domaine de la tyrosine kinase (exons 18-21) de l'EGFR la sélection de cas de méthodes de
gène. et la classification histopathologique des tumeurs
blocs représentatifs de 77 fixés au formol, paraffine tumeurs primaires gastriques humaines ont été extraites du département de pathologie de l'hôpital S. João , après le consentement éclairé des patients. Les patients ont été informés que le matériel de la tumeur serait utilisé à des fins de recherche uniquement. Aucun des patients inclus dans la présente série a eu une histoire familiale de cancer gastrique. H & E- coupes colorées ont été utilisés pour classer les tumeurs selon la classification de Lauren et Ming. Pénétration de la paroi gastrique et la présence et la localisation des métastases ganglionnaires ont été enregistrées pour tous les patients utilisant des critères standard pour la stadification pathologique. orcéine sections colorées ont été utilisées pour la détection de l'invasion vasculaire.
EGFR criblage
L'ADN génomique a été extrait de 10 um section après microdissection des zones tumorales afin d'assurer une pureté d'au moins 70% des cellules néoplasiques. L'extraction d'ADN a été réalisée en utilisant le kit de purification d'ADN génomique (Système Gentra) selon le protocole du fabricant. des amorces spécifiques des exons ont été conçus et l'ADN a été soumis à une amplification par PCR des exons 18, 19, 20 et 21. Les quatre codes EGFR
exons pour le domaine tyrosine kinase de l'EGFR. Les séquences des amorces sont indiquées dans le tableau 1.Table 1 Amorces utilisées pour l'amplification PCR du domaine de la kinase EGFR
Exon

Primer Séquence
PCR taille du produit (pb)
Exon 18
Forward
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Inverser
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
Forward
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Inverser
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
inverse
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
Forward
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Inverser
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
produits de PCR ont été analysés sur un gel d'agarose à 2% et des bandes PCR amplifiés ont été extraits du gel avec le kit de purification gel Band (GE Healthcare). Les échantillons ont ensuite été purifiés et séquences en utilisant le kit ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction (Perkin Elmer, Foster City, CA) suivant les instructions de fabrication et un Prism 3100 Analytique ABI génétique (Perkin Elmer, Foster City, CA). Les résultats ont été analysés en utilisant le logiciel 3100 de collecte de données. Le séquençage a été réalisé dans les deux brins. Dans les cas de mutations soupçonnés amplification par PCR a été répétée et l'échantillon a été re-séquencée pour éliminer les artefacts de PCR.
EGFR Copy Number Variation Screening
Les blocs de paraffine ont été sectionnés à 5 sections um et de tissus ont été séchés à 60 ° C pendant 30 minutes. Les lames ont été déparaffinées et lavées suivies d'un prétraitement et une étape de digestion à l'aide de la pepsine, et enfin déshydratée. Le LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (VYSIS ®), optimisé pour détecter la région de la bande 7p12 en orange du spectre et le centromère du chromosome 7 (7p11.1-Q11.1, locus D7Z1) dans le spectre vert, à la fois dans les noyaux interphasiques et sur les chromosomes métaphasiques, a été utilisé. Cinq ul de la sonde ont été appliquées à chaque diapositive. La dénaturation a été réalisée à 80 ° C pendant 8 minutes, suivie d'une hybridation dans une chambre humide à 37 ° C pendant 16 heures. Après hybridation, les lames ont été lavées et incubées avec le 4'-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Pour l'évaluation, soixante à 100 noyaux interphasiques intacts ont été analysés par deux observateurs indépendants afin de marquer les signaux pour le chromosome 7 centromère et le gène de l'EGFR. lymphocytes Environnement et de la muqueuse normale ont été utilisées comme contrôle interne de qualité pour les essais. Au moins deux ou trois zones représentatives des cellules néoplasiques ont été sélectionnés, sous un champ d'amplification de 100 × /200 ×, pour compter les signaux noyaux. Après un aperçu sous une amplification de 400 ×, les signaux ont ensuite été comptées en utilisant l'huile d'immersion (1000 ×). L'analyse statistique
études d'association entre les altérations de l'EGFR et les caractéristiques clinico des cas ont été réalisées que dans 30 cas (tumeurs analysé les mutations de l'EGFR et du nombre de copies de l'EGFR variation). Les analyses statistiques ont été évaluées par le test de x2 ou t
test de Student. Une valeur p de
. ≪ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative: Résultats
EGFR Mutation Screening
De 77 carcinomes gastriques analysés, EGFR de les mutations dans les exons 18-21 ont été détectés chez 2,6% (2/77) des cas (Fig. 1A). Une mutation a appartenu à l'exon 20, et a une mutation faux-sens (2300 C > T), qui conduit à la substitution de l'alanine 767 pour une Valine. La seconde mutation affectée exon 21, et a une mutation faux-sens (2524 A > G) conduisant à la substituition de l'asparagine 842 par un acide aspartique. Aucune des mutations ont été décrites précédemment. Aucune modification de la séquence ont été trouvées dans les exons 18 et 19. Figure 1 modifications structurelles dans l'EGFR. (A) Le séquençage direct montrant l'une des mutations trouvées dans le domaine kinase de l'EGFR - mutation faux-sens (2300 C > T) dans l'exon 20, conduisant à la substitution de l'alanine 767 pour une Valine. (B) de carcinome gastrique Diffuse avec EGFR nombre accru de copies causée par le chromosome 7 polysomie. (C) Les cellules néoplasiques présentant une amplification génique par la formation de grappes avec de nombreux signaux pour l'EGFR.
Plusieurs polymorphismes de l'EGFR ont été trouvés dans l'exon 20 (tableau 2). Le polymorphisme 2361G > A Gln787Gln, décrit précédemment par Mu et al
[16], était présent dans 55,8% (43/77) des cas, et dans neuf des 43 cas dans un état homozygote. Nous avons examiné 50 contrôles normaux et 2361G > A Gln787Gln était présent dans 82% des témoins (41/50). Deux autres mutations silencieuses EGFR (la 2301 C > T Ala767Ala et 2415 C > T His805His) ont été trouvés dans l'exon 20, aucun d'entre eux décrit précédemment. Les deux modifications ont été trouvés dans un seul cas, et étaient absents dans controls.Table 2 modifications de séquences normales trouvées par séquençage direct

Altération

Tapez
Références
Exon 18
2184 + 19 G >
fréquence
; Une variante Intronic
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
variante Intronic
1/77
Pas encore décrit
2283 + 11 G > Une variante Intronic
1/77
Pas encore décrit
2283 + 47 G > Une variante Intronic
1/77
Pas encore décrit
2283+ 49 C > T
variante Intronic
1/77
Pas encore décrit
Exon 20
2284-60 C > T
Intronic variante
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > Ala T faux-sens 767 Val
1/77
Pas encore décrit
2301 C > T Silent Ala 767 Ala
1/77
Pas encore décrit
2361G > A Silent Gln 787 Gln
43/77
[16]
2415 C > T Silent Son 805 Son
1/77
Pas encore décrit
Exon 21
2524 A > Asn faux-sens de G 842 Asp
1/77
Pas encore décrit
Nous avons trouvé six séquences différentes variantes localisées dans les régions introniques de EGFR, deux d'entre eux décrit précédemment dans Ensembl [17] Projection EGFR copie nombre Variation de.
L'analyse du nombre de copies de l'EGFR, évaluée par hybridation fluorescente in situ (FISH), n'a été possible que dans 30 des 77 cas analysés pour les mutations de l'EGFR. Les signaux de toutes les EGFR ont été comparés à des signaux pour les sondes centromériques pour le chromosome 7. Plus de 2,0 EGFR
copies par cellule (polysomie équilibrée ou amplification génique) ont été détectés dans 13,3% (4/30) des cas. Sur les quatre cas montrant plus de 2 copies de l'EGFR
par chromosome 7, trois ont augmenté le nombre de copies en raison de polysomie et on avait l'amplification du gène, un carcinome gastrique diffus, présentant la formation de grappes avec de nombreux signaux pour EGFR
(Fig. 1B, C).
EGFR altérations structurales et les paramètres clinicopathologiques des patients et des tumeurs
tableau 3 présente les associations statistiques entre les altérations de l'EGFR et les caractéristiques clinico-pathologiques des patients et des tumeurs. Lorsque l'on compare le carcinome gastrique hébergeant des altérations de l'EGFR avec des carcinomes ayant le statut EGFR normal ou le nombre de copies, nous avons observé une association significative entre EGFR altérations structurales et augmentation de la taille de la tumeur. (P = 0,0094
). Aucune association significative n'a été trouvée entre les altérations de l'EGFR et d'autres paramètres clinicopathologiques des patients et des tumeurs, à savoir le sexe et l'âge des patients, la localisation de la tumeur, le type histologique, la pénétration de la paroi, la présence de métastases ganglionnaires, l'invasion vasculaire et la mise en scène de la tumeur de la tumeur .table 3 Association de EGFR altérations des gènes avec des paramètres clinicopathologiques
paramètres clinicopathologiques
EGFR état

Amplification /mutation (n = 6)
normal (n = 24)
total (n = 30)
p
valeur
Sexe (F /M)
1/5
10/14
11/19
0,2557
âge (SD)
62,3 ± 14,1 56,3 ± 16,8

57,5 ​​± 16,2
0,4271
tumeur localisation
0.8548
proximal 3
11
14
distal 3
13
16
Taille (SD)
11,6 ± 9,8
5,8 ± 2,0 6,9 ± 5,0

* 0,0094
classification de Lauren
0,1261
Intestinal 1
12
13
diffuse
5
9
14
atypique
0 3
3
pénétration Wall
0,4642 Early (T1)
0 2
2
avancée (T2-T4)
6
22
28
Vascular Invasion
0,7125
Absent ( N0) 3
14
17
Présent (N = 1) 3
10
13
métastases ganglionnaires
0,1921
Absent
1
11
12
Présent
5
13
18
Staging
0,3845
I 1
7
8
II
0
5
5
III
5
11
16
IV
0 1
1
gène de l'EGFR de discussion est localisé sur le chromosome 7p12 et code pour un récepteur de 170 kDa présent dans la membrane des cellules en tant que monomères inactifs. Lors de la liaison du ligand au domaine extracellulaire, le récepteur subit des changements conformationnels et devient dimérise autophosphorylée en résidus tyrosine clés dans le domaine intracellulaire de la tyrosine kinase (TK). Cela conduit à l'activation des voies en aval qui contrôlent la survie cellulaire, l'inhibition de l'apoptose et la prolifération [18].
Une grande attention a été attirée sur l'effet oncogénique de l'EGFR et surtout de succès des thérapies ciblées de l'EGFR, qui sont bien établi pour petits cancers du poumon non cellulaire. Le rôle de l'EGFR dans le cancer gastrique est très controversée. Certains auteurs ont rapporté que l'EGFR est fortement exprimé dans le cancer gastrique, ce qui suggère son aptitude en tant que cible pour les inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur [19, 20]. A l'inverse, Takehana et ses collègues ont rapporté que la surexpression du récepteur du facteur de croissance épidermique est un événement rare dans le carcinome gastrique [21] et se produit principalement en raison de l'amplification du gène de l'EGFR, ce qui confirme les résultats d'études antérieures [22-24]. mutations de l'EGFR dans le cancer gastrique primaire ou des lignées cellulaires de cancer gastrique n'a jamais été rapportée [25-27]; néanmoins nous avons récemment montré que héréditaires diffuses mutations cancer gastrique E-cadhérine associé germinale missense conduisent à une activité accrue de l'EGFR.
Sur cette base, nous avons considéré que la recherche de modifications de l'EGFR dans le cancer gastrique aurait pu être important d'identifier la thérapie des cas sensibles.
nous présentons ici la présence de l'augmentation de nombre de copies de l'EGFR dans 13,3% des 30 cas dans lesquels l'analyse FISH a été possible. Sur les quatre cas avec une augmentation du nombre de copies, juste une amplification génique présenté, alors que les 3 autres cas ont montré polysomie du chromosome 7. Ces résultats correspondent à des rapports précédents de l'enquête du nombre de copies de l'EGFR dans le cancer gastrique [22-24]. L'analyse mutationnelle du domaine kinase de l'EGFR a révélé la présence de mutations chez 2,6% des 77 cancers gastriques. Les mutations identifiées sont de type faux-sens et sont présentes dans les exons 20 et 21 du gène de l'EGFR. Aucun des mutations identifiées a été décrit précédemment et leur signification fonctionnelle n'a pas encore été évalué. Cependant, en raison de leur localisation dans le domaine kinase de l'EGFR, il est tentant de supposer qu'elles affectent l'activité du récepteur et par conséquent les patients porteurs de ces mutations de l'EGFR peuvent bénéficier d'inhibiteurs de tyrosine kinase comme approche thérapeutique.
Outre ces mutations trouvées d'autres modifications de séquence ont été identifiés, tout regroupement dans l'exon 20. L'EGFR polymorphisme 2361 G > a (précédemment décrit dans Ensembl) est présent dans un pourcentage élevé de cas et de témoins normaux. En revanche, les deux autres variantes non encore décrits silencieux dans l'exon 20 (2301 C > T 2415 C > T) étaient absents chez les témoins normaux. En plus de ces séquences EGFR variantes dans les régions de codage, nous avons également identifié des variations dans la séquence intronique flanquant les exons 18, 19 et 20, mais leur effet fonctionnel reste incertain.
La corrélation entre les paramètres cliniques pour les cas pour lesquels les deux mutation et FISH analyse était possible, a montré une association significative entre les altérations de l'EGFR et la taille de la tumeur. Fait intéressant, tous les cas avec des altérations de l'EGFR (amplification /mutation) étaient des carcinomes envahisseurs déjà la membrane basale et la propagation dans la paroi gastrique (T2-T4), ce qui suggère que les altérations de ce gène peut conférer un comportement invasif des cellules néoplasiques.
Cependant, cette hypothèse doit être clarifié par d'autres études, étant donné que nous n'avons pas vérifié une corrélation statistiquement significative entre les altérations de l'EGFR et l'invasion de la paroi gastrique (p = 0,4642), comme nous venons de analised un très faible nombre de carcinomes gastriques précoces ( n = 2) dans notre série. Les deux résultats sont en accord avec les rapports de Hirono et al
., 1995 [23] et Tsugawa et al
., 1998 [24], ce qui suggère que l'EGFR est impliqué dans la croissance tumorale et l'activation des modifications peut être une fin événement impliqué dans la progression tumorale.
Bien qu'aucune autre association statistiquement significative n'a été trouvée, il est intéressant de remarquer que les modifications de l'EGFR se produisent principalement dans les carcinomes de type diffus. La présence d'altérations de l'EGFR dans les cancers diffus est contraire à ce qui était auparavant observé pour d'autres membres de la famille du récepteur de ErbB dans le cancer gastrique. Dans gastrique carcinome ERBB2 amplification a été détecté préférentiellement dans les carcinomes intestinaux de l'estomac [5].
Conclusion
En conclusion, dans cette étude, nous avons démontré que EGFR altérations d'activation ne sont pas un événement fréquent dans la carcinogenèse gastrique. Les modifications apparaissent préférentiellement dans les carcinomes gastriques du sous-type diffus et sont associés à la taille de la tumeur. Remarques
Cátia Moutinho de Malgré la faible fréquence des altérations de l'EGFR, nos résultats indiquent aussi qu'il ya un groupe restreint de patients gastriques sélectionnés qui pourraient bénéficier de thérapies non conventionnelles, y compris les inhibiteurs pharmacologiques du récepteur EGFR., Ana R Mateus a contribué également à ce travail
Déclarations Remerciements
cette étude a été financée par des subventions du para Fundação a ea Tecnologia Ciência, Portugal (SFRH /BD /16747/2004, POCI /SAU -. OBS /57670 /2004 et PTDC /SAU -. OBD /64319/2006)
auteurs fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis fichiers pour les images. fichier original 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf Auteurs pour la figure 1 Intérêts concurrents
L'auteur (s) déclarent avoir aucun conflit d'intérêts.

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