del fattore di crescita epidermico recettore alterazioni strutturali in gastriche cancer

fattore di crescita epidermico recettore alterazioni strutturali a cancro gastrico
Abstract
sfondo
EGFR sovraespressione è stata descritta in molti tumori umani, tra cui il cancro gastrico. In pazienti con NSCLC mutazioni somatiche EGFR, all'interno del dominio chinasi della proteina, così come l'amplificazione del gene sono stati associati con una buona risposta clinica agli inibitori dell'EGFR. Nei tumori gastrici dati relativi alterazioni strutturali di EGFR rimane controverso. Data la sua possibile rilevanza terapeutica, abbiamo voluto determinare la frequenza e il tipo di alterazioni strutturali del EGFR
gene in una serie di carcinomi gastrici primari.
Metodi
sequenziamento diretto del dominio chinasi di EGFR
gene è stato eseguito in una serie di 77 carcinomi gastrici primari. analisi FISH è stata eseguita in 30 casi. sono stati realizzati studi di associazione tra EGFR
alterazioni e le caratteristiche patologiche cliniche dei tumori.
risultati
Entro i 77 carcinomi gastrici primarie abbiamo trovato due EGFR
mutazioni somatiche e diversi EGFR
polimorfismi nell'esone 20. Sei diversa sequenza intronic varianti di EGFR
sono stati trovati anche. Quattro carcinomi gastrici hanno mostrato polisomia bilanciato o EGFR
amplificazione genica. Abbiamo verificato che il carcinoma gastrico con alterazioni di EGFR
(mutazioni somatiche o copiare il numero di variazione) ha mostrato un aumento significativo delle dimensioni del tumore (p = 0,0094
) rispetto al wild-type EGFR
carcinomi.
conclusione
Abbiamo dimostrato che EGFR
alterazioni strutturali sono rari nel carcinoma gastrico, ma ogni volta presente, porta alla crescita del tumore. Abbiamo considerato che la ricerca di EGFR
alterazioni nel cancro gastrico è probabile che sia clinicamente importante al fine di identificare i pazienti a rischio di rispondere in tirosina chinasi inibitori.
Sfondo
cancro gastrico resta la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo [1] uno scenario che evidenzia la necessità di terapie più specifiche ed efficienti. L'esatto meccanismo alla base carcinogenesi gastrica non sono ancora pienamente compreso, ma prove indicano una associazione con meccanismi coinvolti nei processi di sviluppo [2]. molecole chiave di questi percorsi sono recettore delle tirosin chinasi (RTK), che si trovano ad essere aberrante attivato o sovraespresso in una varietà di tumori e quindi rappresentare bersagli promettenti per l'intervento terapeutico.
I membri della superfamiglia dei recettori RTK erbB sono glicoproteine ​​che consistono di un dominio extracellulare dove il legame di ligandi avviene, a breve dominio transmembrana lipofila, e un dominio intracellulare trasporta la tirosina chinasi [3, 4]. Essi sono espressi in diversi tessuti epiteliali, mesenchimali e l'origine neuronale, dove giocano un ruolo cardine nello sviluppo, la proliferazione e la differenziazione. espressione di molecole deregolamentato erbB, cioè ErbB2, è stata implicata nello sviluppo di numerosi tipi di tumori, compresi i tumori gastrici. Nel carcinoma gastrico è stato dimostrato che ERBB2 sovraespressione è guidato da amplificazione genica ed è associata a carcinomi ad alto potenziale invasivo [5]. ErbB1, meglio noto come fattore di crescita epidermico (EGFR), sovraespressione è stata descritta in molti tumori umani, tra cui polmone, del colon, della mammella, della prostata, del cervello, della testa e del collo, tiroide, ovaie, vescica, rene e anche il cancro dello stomaco [6 -11], ed è stato correlato alla stadio tumorale avanzato e scarso esito clinico. Molto recentemente, abbiamo dimostrato che l'attivazione di EGFR è associata alla perdita di funzione di E-caderina, in vitro
[12].
I meccanismi di conversione oncogenica di EGFR nel cancro includono amplificato numero di copie, riarrangiamenti strutturali del recettore e mutazioni attivanti [13]. mutazioni EGFR cluster nel dominio della chinasi di EGFR (esoni 18-21), e causano attivazione ligando-indipendente del recettore, che rappresentano possibili bersagli per l'intervento terapeutico. A questo proposito, mutazioni EGFR somatiche così come l'amplificazione genica nei pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) altamente correlati con la risposta clinica in tirosina chinasi inibitori [14, 15].
Nei tumori gastrici, i dati relativi strutturale alterazioni di EGFR rimane controverso. Data la sua possibile rilevanza terapeutica, nel presente studio abbiamo cercato di chiarire la rilevanza di EGFR alterazioni strutturali nella carcinogenesi gastrica, analizzando una serie di carcinomi gastrici primarie per numero di copie e le mutazioni nel dominio della tirosin-chinasi (esoni 18-21) del EGFR
gene
. Metodi
selezione Case e classificazione istopatologica dei tumori
blocchi rappresentativi di 77, paraffina tumori primari gastrici umani fissati in formalina sono stati presi dal Dipartimento di Patologia dell'Ospedale S. João , dopo il consenso informato dei pazienti. I pazienti sono stati informati che il materiale del tumore sarebbe stato utilizzato solo per scopi di ricerca. Nessuno dei pazienti inclusi nella presente serie ha avuto una storia familiare di cancro gastrico. H & E- sezioni colorate sono stati usati per classificare i tumori in base alle classificazioni di Lauren e Ming. Penetrazione della parete gastrica e la presenza e la localizzazione delle metastasi linfonodali sono stati registrati per tutti i pazienti utilizzando criteri standard per la stadiazione patologica. sezioni Orceina macchiati sono stati utilizzati per la rilevazione di invasione vascolare.
EGFR screening delle mutazioni
DNA genomico è stato estratto da 10 micron sezione dopo microdissezione delle aree tumorali per garantire una purezza di almeno il 70% delle cellule neoplastiche. estrazione del DNA è stata effettuata utilizzando il DNA Purification Kit Genomic (Gentra System) secondo il protocollo del produttore. primer esone-specifiche sono state progettate e DNA è stato sottoposto ad amplificazione PCR esoni 18, 19, 20 e 21. I quattro EGFR codice
esoni per il dominio tirosina chinasi di EGFR. sequenze primer sono riportati nella tabella 1 1.Table primer utilizzati per l'amplificazione PCR del dominio EGFR chinasi
Exon

Primer Sequenza
PCR dimensioni del prodotto (bp)
Exon 18
Forward
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Reverse
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
avanti
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Reverse
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Reverse
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
avanti
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Reverse
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
prodotti di PCR sono stati eseguiti su un gel di agarosio al 2% e bande PCR amplificati sono stati estratti dal gel con il Purification Kit gel band (GE Healthcare). I campioni sono stati poi purificato e sequenziato utilizzando il kit ABI Prism dGTP BigDye Terminator Pronta Reazione (Perkin Elmer, Foster City, CA) seguendo le istruzioni del produttore e un ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). I risultati sono stati analizzati utilizzando 3100 software di raccolta dati. Sequencing è stato eseguito in entrambi i filamenti. In casi con sospetta mutazioni amplificazione PCR è stata ripetuta e il campione è stato ri-sequenziata per escludere artefatti di PCR.
EGFR Copy Number Variation Screening
I blocchi di paraffina sono stati sezionati a 5 micron sezioni e del tessuto sono stati essiccati a 60 ° C per 30 minuti. I vetrini sono stati lavati deparaffinised e seguiti da un pre-trattamento e una fase di digestione con pepsina e infine disidratate. La LSI EGFR Dual Color Probe-Ibrida Set (Vysis ®), ottimizzato per rilevare la regione banda 7p12 nello spettro arancione e il centromero del cromosoma 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) nello spettro verde, sia in nuclei in interfase e cromosomi in metafase, è stato utilizzato. Cinque microlitri della sonda sono stati applicati a ciascuna diapositiva. La denaturazione è stata effettuata a 80 ° C per 8 minuti seguito da ibridazione su una camera umida a 37 ° C per 16 ore. Dopo l'ibridazione, i vetrini sono stati lavati e incubati con 4'-6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la colorazione nucleare. Per la valutazione, sessanta a 100 nuclei in interfase intatti sono stati analizzati da due osservatori indipendenti al fine di segnare i segnali per il cromosoma 7 centromero e del gene EGFR. linfociti circostanti e mucosa normale sono stati utilizzati come controllo di qualità interno per i saggi. Almeno stati selezionati due o tre aree rappresentative delle cellule neoplastiche, in un campo di amplificazione 100 × /200 ×, per contare i segnali nuclei. Dopo una panoramica sotto un ampliamento di 400 ×, i segnali sono poi stati contati con olio di immersione (1000 ×). L'analisi statistica
studi di associazione tra le alterazioni EGFR e le caratteristiche clinico-patologici dei casi sono stati eseguiti solo in 30 casi (tumori analizzato per le mutazioni EGFR e il numero di EGFR copia variazione). Le analisi statistiche sono state valutate con il test x2 o il test t di Student
. Un valore di p
di. ≪ 0.05 è stato considerato statisticamente significativo
Risultati
mutazione dell'EGFR Proiezione
Dalle 77 carcinomi gastrici analizzati, EGFR
mutazioni in esoni 18-21 sono stati rilevati nel 2,6% (2/77) dei casi (Fig. 1A). Una mutazione apparteneva esone 20 ed era una mutazione missenso (2300 C > T) che porta alla sostituzione della alanina 767 per una valina. La seconda mutazione colpiti esone 21 ed era una mutazione missenso (2524 A > G) porta alla substituition del Asparagine 842 per un acido aspartico. Nessuna delle mutazioni erano descritto in precedenza. Nessuna alterazione della sequenza sono stati trovati in esoni 18 e 19. La figura 1 alterazioni strutturali in EGFR. (A) sequenziamento diretto che mostra una delle mutazioni trovate nel dominio chinasi di EGFR - mutazione missenso (2300 C > T) nell'esone 20, portando alla sostituzione della alanina 767 per una valina. (B) carcinoma gastrico diffusa con EGFR aumento del numero di copie di causato dal cromosoma 7 polisomia. (C), le cellule neoplastiche che presentano amplificazione genica con la formazione di gruppi con numerosi segnali per EGFR.
Diversi polimorfismi EGFR sono stati trovati in esone 20 (tabella 2). Il polimorfismo 2361G > A Gln787Gln, in precedenza descritto da Mu et al
[16], era presente in 55,8% (43/77) dei casi, e in nove dei 43 casi in uno stato omozigote. Abbiamo proiettato 50 controlli normali e il 2361G > A Gln787Gln era presente nel 82% dei controlli (41/50). Altri due mutazioni silenti EGFR (il 2301 C > T Ala767Ala e il 2415 C > T His805His) sono stati trovati in esone 20, nessuno di loro descritto in precedenza. Entrambe le alterazioni sono stati trovati in un singolo caso e sono stati assenti nelle normali controls.Table 2 alterazioni sequenza trovate da sequenziamento diretto

Alterazione

Tipo
frequenza
Riferimenti
Exon 18
2184 + 19 G > A
variante Intronic
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
variante Intronic
1/77
Non ancora descritto
2283 + 11 G > Un
variante Intronic
1/77 Non
ancora descritto
2283 + 47 G > A
variante Intronic
1/77
Non ancora descritto
2283+ 49 C > T
variante Intronic
1/77
Non ancora descritto
Exon 20
2284-60 C > T
Intronic variante
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T
Missenso Ala 767 Val
1/77
Non ancora descritto
2301 C > T
silenzioso Ala 767 Ala
1/77
Non ancora descritto
2361G > A
silenzioso Gln 787 Gln
43/77
[16]
2415 C > T
silenzioso suo 805 La sua
1/77
Non ancora descritto
Exon 21
2524 A > G
Missenso Asn 842 Asp
1/77
Non ancora descritto
Abbiamo trovato sei diverse varianti di sequenza localizzata nelle regioni introniche di EGFR, due di loro in precedenza descritte in Ensembl [17]
. EGFR Copy Number Variation Proiezione
L'analisi di EGFR
numero di copie, valutata mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH), è stato possibile solo in 30 dei 77 casi analizzati per mutazioni EGFR. Tutti EGFR
segnali sono stati confrontati con i segnali per sonde centromeriche per cromosoma 7. Più di 2,0 EGFR
copie per cellula (polisomia bilanciato o amplificazione genica) sono stati rilevati nel 13,3% (4/30) dei casi. Dei quattro casi che mostrano più di 2 copie di EGFR
per cromosoma 7, tre avevano aumentato numero di copie a causa di polisomia e uno aveva amplificazione genica, un carcinoma gastrico diffuso, esibendo la formazione di cluster con numerosi segnali per EGFR
(Fig. 1B, C).
EGFR alterazioni strutturali e parametri clinico-patologici dei pazienti e dei tumori
tabella 3 mostra le associazioni statistiche tra alterazioni EGFR e le caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti e dei tumori. Quando si confrontano carcinoma gastrico ospitare alterazioni dell'EGFR con carcinomi con normale stato di EGFR o numero di copie, è stata osservata una significativa associazione tra alterazioni strutturali dell'EGFR e aumento delle dimensioni del tumore. (P = 0,0094
). Nessuna associazione significativa è stata trovata tra le alterazioni EGFR e altri parametri clinico-patologici dei pazienti e dei tumori, vale a dire sesso e l'età dei pazienti, localizzazione del tumore, tipo istologico, la penetrazione della parete, la presenza di metastasi linfonodali, invasione vascolare e la stadiazione del tumore del tumore .table 3 Associazione di EGFR alterazioni del gene con parametri clinico-patologici
parametri clinico-patologiche
EGFR stato

Amplificazione /mutazione (n = 6)
normale (n = 24)
totale (n = 30)
p valore
Sesso (F /M)
1/5
10/14
11/19
0,2557
Age (SD)
62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57.5 ± 16.2
0,4271
Tumori localizzazione
0,8548
prossimale 3
11
14
distale 3
13
16
Size (SD)
11.6 ± 9.8
5.8 ± 2.0
6,9 ± 5,0
* 0,0094
classificazione di Lauren
0,1261
intestinale
1 12
13
Diffuse
5
9
14
atipica
0 3
3
penetrazione parete
0,4642
precoce (T1)
0 Pagina 2 2
avanzata (T2-T4)
6
22
28
vascolare Invasion
0,7125
Assente ( N0) 3
14
17
Present (n = 1)
3 10
13
metastasi linfonodali
0,1921
Assente
1
11
12
Presente
5
13
18
Staging
0,3845
I
1 7
8
II
0
5
5
III
5
11
16
IV
0
1 1
Discussione
gene EGFR è localizzato sul cromosoma 7p12 e codifica per un recettore di 170 KDa, presente nella membrana delle cellule come un monomeri inattivi. Su ligando vincolante al dominio extracellulare, il recettore subisce cambiamenti conformazionali, dimerises e diventa autophosphorylated in residui di tirosina chiave nel dominio intracellulare della tirosin-chinasi (TK). Questo porta all'attivazione di vie a valle che controllano la sopravvivenza cellulare, inibizione dell'apoptosi e della proliferazione [18].
Molta attenzione è stata attirata l'effetto oncogeno di EGFR e soprattutto per il successo di EGFR terapie bersaglio, che sono ben stabilito per i carcinomi polmonare non a piccole cellule. Il ruolo di EGFR nel carcinoma gastrico è molto controverso. Alcuni autori hanno riferito che EGFR è altamente espresso nel cancro gastrico, suggerendo la sua idoneità come bersaglio per gli inibitori del recettore tirosin-chinasi [19, 20]. Al contrario, Takehana e colleghi hanno riportato che la sovraespressione del recettore del fattore di crescita epidermico è un evento raro nel carcinoma gastrico [21] e si verifica principalmente a causa di amplificazione del gene EGFR, confermando i risultati di studi precedenti [22-24]. mutazioni EGFR nel carcinoma gastrico primaria o linee di cellule di cancro gastrico non sono mai stati segnalati [25-27]; tuttavia abbiamo recentemente dimostrato che le mutazioni ereditarie diffuse cancro gastrico associato E-caderina linea germinale missenso portano ad una maggiore attività di EGFR.
Su questa base, abbiamo considerato che la ricerca di alterazioni di EGFR nel carcinoma gastrico sarebbe stato importante per identificare i casi suscettibili di terapia.
Qui riportiamo la presenza di EGFR
aumento del numero di copie in 13,3% dei 30 casi in cui l'analisi FISH è stato possibile. Dei quattro casi con aumento del numero di copie, solo una amplificazione genica presentato, mentre i rimanenti 3 casi hanno mostrato polisomia del cromosoma 7. Questi risultati corrispondono ai rapporti precedenti che indagano il numero EGFR copia cancro gastrico [22-24]. L'analisi mutazionale del dominio chinasi di EGFR ha rivelato la presenza di mutazioni nel 2,6% dei 77 carcinomi gastrici. Le mutazioni identificate erano del tipo missenso ed erano presenti in esoni 20 e 21 del gene EGFR. Nessuna delle mutazioni identificate era stata precedentemente descritta ed il loro significato funzionale non è ancora valutato. Tuttavia, a causa della loro localizzazione nel dominio della chinasi di EGFR, si è tentati di ipotizzare che influenzano l'attività del recettore e quindi pazienti portatori di queste mutazioni EGFR possono beneficiare di inibitori della tirosina chinasi come approccio terapeutico.
Oltre a queste mutazioni trovate , sono state identificate altre alterazioni nella sequenza, tutto il clustering nell'esone 20. La EGFR polimorfismo 2361 G > a (precedentemente descritto in Ensembl) avviene in un'alta percentuale di casi e nei controlli normali. Al contrario, gli altri due non ancora descritto varianti silenziosi nell'esone 20 (2301 C > T, 2415 C > T) erano assenti nei controlli normali. In aggiunta a queste sequenze EGFR varianti in regioni codificanti, abbiamo anche identificato variazioni nella sequenza fiancheggiante intronic esoni 18, 19 e 20, ma il loro effetto funzionale rimane poco chiaro.
La correlazione dei parametri clinici per i casi in cui sia mutazione e FISH analisi è stato possibile, ha mostrato una significativa associazione tra le alterazioni EGFR e le dimensioni del tumore. È interessante notare che tutti i casi con alterazioni EGFR (amplificazione /mutazione) erano carcinomi già invadono la membrana basale e diffusione nella parete gastrica (T2-T4), suggerendo che le alterazioni di questo gene può conferire un comportamento invasivo di cellule neoplastiche.
Tuttavia, questa ipotesi deve essere chiarito da ulteriori studi, dal momento che non abbiamo verificare una correlazione statisticamente significativa tra le alterazioni EGFR e l'invasione nella parete gastrica (p = 0,4642), come abbiamo appena analised un numero molto basso di primi carcinomi gastrici ( n = 2) nella nostra serie. Entrambi i risultati sono in accordo con le relazioni di Hirono et al
. 1995 [23] e Tsugawa et al
., 1998 [24], suggerendo che EGFR è coinvolto nella crescita tumorale e attivando le alterazioni può essere un ritardo evento coinvolti nella progressione tumorale.
Anche se è stata trovata alcuna altra associazione statisticamente significativa, è interessante notare che le alterazioni di EGFR si verificano soprattutto nei carcinomi di tipo diffuso. La presenza di alterazioni di EGFR nei carcinomi diffusi è in contrasto con quanto precedentemente osservato per gli altri membri della famiglia dei recettori ERBB nel cancro gastrico. In gastrica amplificazione carcinoma ERBB2 è stato rilevato preferenzialmente nei carcinomi intestinali dello stomaco [5].
Conclusione
In conclusione, in questo studio abbiamo dimostrato che le alterazioni di EGFR attivazione non sono un evento frequente nella carcinogenesi gastrica. Alterazioni appaiono preferenzialmente nei carcinomi gastrici del sottotipo diffuso e sono associati alle dimensioni del tumore. Nonostante la bassa frequenza di alterazioni di EGFR, i nostri risultati indicano anche che ci sia un gruppo ristretto di pazienti gastrici selezionati che potrebbero trarre beneficio da terapie non convenzionali, tra cui gli inibitori farmacologici del recettore EGFR.
Note
Cátia Moutinho, Ana R Mateus contribuito in maniera uguale a questo lavoro
Dichiarazioni
Ringraziamenti
questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dal para Fundação un EA Ciência Tecnologia, Portogallo (SFRH /BD /16747/2004, POCI /SAU -. OBS /57670 /2004 e PTDC /SAU -. OBD /64319/2006)
autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai degli autori fascicoli presentati originali per immagini. file originale 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf degli autori per la figura 1 interessi concorrenti
L'autore (s) dichiarano di non avere interessi in gioco.

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