Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor strukturelle Veränderungen in Magenkrebs

Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor strukturelle Veränderungen in Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
EGFR-Überexpression in vielen menschlichen Tumoren, einschließlich Magenkrebs beschrieben worden. In NSCLC-Patienten somatische EGFR Mutationen innerhalb der Kinase-Domäne des Proteins, sowie Genamplifikation wurden mit einer guten klinischen Reaktion auf EGFR-Inhibitoren verbunden sind. In Magentumoren bleibt Daten über die strukturelle Veränderungen des EGFR umstritten. Aufgrund seiner möglichen therapeutischen Relevanz, war es unser Ziel, die Häufigkeit und die Art der strukturellen Veränderungen des EGFR
Gens in einer Reihe von primären Magenkarzinomen.
Methods
direkte Sequenzierung der Kinase-Domäne des EGFR zu bestimmen
Gen wurde in einer Reihe von 77 primären Magenkarzinomen durchgeführt. FISH-Analyse wurde in 30 Fällen durchgeführt. Assoziationsstudien zwischen EGFR
Veränderungen und der klinischen pathologischen Merkmale der Tumoren durchgeführt wurden.
Ergebnis einschränken Innerhalb der 77 primären Magenkarzinomen wir zwei somatische Mutationen und mehrere EGFR
Polymorphismen in Exon
EGFR gefunden 20. Sechs verschiedene Intron-Sequenzvarianten von EGFR
auch gefunden wurden. Vier Magenkarzinomen zeigte ausgewogene Polysomie oder EGFR
Gen-Amplifikation. Wir Nachweis erbracht, dass das Magenkarzinom mit Veränderungen von EGFR
(somatische Mutationen oder Kopienzahl Variation) zeigte einen signifikanten Anstieg der Tumorgröße (p = 0,0094
) im Vergleich zum Wildtyp-EGFR
Karzinome.
Fazit
Wir zeigen, dass EGFR
strukturelle Veränderungen sind selten in Magenkarzinom, aber wenn vorhanden, es führt zu Tumorwachstum. Wir dachten, dass bei Magenkrebs für EGFR
Veränderungen der Suche wahrscheinlich klinisch wichtig, um zu sein, Patienten zu identifizieren anfällig reagieren Kinase-Inhibitoren zu Tyrosin.
Hintergrund
Magenkrebs bleibt die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit [1] ein Szenario, das die Notwendigkeit präziser und effiziente Therapien hervorhebt. Die genauen Mechanismen Magen-Krebsentstehung zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig verstanden, aber Beweise deuten auf eine Assoziation mit Bahnen in Entwicklungsprozessen beteiligt [2]. Schlüsselmoleküle dieser Wege sind die Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK), die gefunden werden aberrant aktiviert oder in einer Vielzahl von Tumoren und stellen daher für therapeutische Intervention vielversprechende Ziele überexprimiert wird.
Die Mitglieder der RTK-Superfamilie von Rezeptoren sind ERBB Glykoproteine, die aus einer extrazellulären Domäne, in der die Bindung von Liganden stattfindet, eine kurze lipophile Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Domäne trägt die Tyrosinkinase-Aktivität [3, 4] bestehen. Sie werden in verschiedenen Geweben von epithelialen, mesenchymalen und neuronalen Ursprungs exprimiert, wo sie eine entscheidende Rolle in der Entwicklung, Proliferation und Differenzierung spielen. Deregulierte Expression von erbB-Moleküle, nämlich ERBB2, wurde bei der Entwicklung von zahlreichen Arten von Tumoren, einschließlich Tumoren des Magens beteiligt ist. In Magenkarzinomen ist es, dass ERBB2 Überexpression wird durch Genamplifikation und Karzinomen assoziiert mit hoher invasive potential [5] gezeigt angetrieben. ErbB1, besser als epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) bekannt, die Überexpression in vielen menschlichen Tumoren, einschließlich Lungen-, Darm-, Brust-, Prostata-, Gehirn, Kopf und Hals, Schilddrüse, Eierstock-, Blasen-, Nieren- und auch Magenkrebs [6 beschrieben worden ist -11] und hat sich zu fortgeschrittenen Tumorstadium und schlechten klinischen Ergebnis korreliert. Erst vor kurzem haben wir gezeigt, dass EGFR-Aktivierung zu einem Verlust der Funktion des E-Cadherin-assoziiert ist, in vitro
[12]., Die Mechanismen zur onkogenen Umwandlung von EGFR in Krebs gehören amplifizierte Kopienzahl, strukturelle Umlagerungen des Rezeptors und aktivierende Mutationen [13]. EGFR Mutationen Cluster in der Kinase-Domäne von EGFR (Exons 18-21) und verursachen ligandenunabhängige Aktivierung des Rezeptors, die mögliche Ziele für die therapeutische Intervention. In diesem Zusammenhang weisen eine hohe Korrelation somatischen EGFR-Mutationen sowie Gen-Amplifikation bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) mit der klinischen Reaktion Kinase-Inhibitoren zu Tyrosin [14, 15].
Magentumoren, Daten über die strukturelle Veränderungen des EGFR bleibt umstritten. Aufgrund seiner möglichen therapeutischen Relevanz, die in der vorliegenden Studie wollten wir durch die Analyse einer Reihe von primären Magenkarzinomen für Kopienzahl und Mutationen in der Tyrosinkinase-Domäne (Exons 18-21) des EGFR die Bedeutung von EGFR strukturellen Veränderungen im Magen-Krebsentstehung zu klären
Gen.
Methoden
Fallauswahl und histopathologischen Klassifikation der Tumoren
Repräsentative Blöcke von 77 in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten menschlichen Magenprimärtumoren wurden von der Abteilung für Pathologie des Krankenhauses S. João abgerufen nach Zustimmung der Patienten informiert. Die Patienten wurden darüber informiert, dass Tumormaterial nur für Forschungszwecke verwendet werden würde. Keiner der Patienten in der vorliegenden Serie enthalten hatte eine Familiengeschichte von Magenkrebs. H & E-gefärbten Schnitten wurden verwendet, Tumoren zu kategorisieren nach den Einstufungen von Lauren und Ming. Penetration der Magenwand und das Vorhandensein und Lokalisation von Lymphknotenmetastasen wurden für pathologische Staging für alle Patienten mit Standard-Kriterien erfasst. Orcein-gefärbten Schnitte wurden für den Nachweis von vaskulären Invasion verwendet.
Screening EGFR Mutation
Genomische DNA von 10 &mgr; m Abschnitt nach Mikrodissektion der Tumorbereiche extrahiert wurde eine Reinheit von mindestens 70% der neoplastischen Zellen zu gewährleisten. DNA-Extraktion wurde unter Verwendung des Genomic DNA Purification Kit (Gentra Systems) gemß dem Protokoll des Herstellers. Exon-spezifische Primer wurden entworfen und DNA einer PCR-Amplifikation der Exons 18 unterzogen, 19, 20 und 21. Die vier EGFR
Exons Code für die Tyrosin-Kinase-Domäne von EGFR. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 1.Table Primer für die PCR-Amplifikation des EGFR-Kinase-Domäne verwendet gezeigt
Exon

Primer-Sequenz
PCR-Produkt Größe (bp)
Exon 18
Vorwärts
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Rückwärts
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
Vorwärts
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Rückwärts
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Vorwärts
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
Vorwärts Rückwärts
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Rückwärts
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PCR Produkte auf einem 2% Agarosegel und PCR amplifizierten Banden wurden aus dem Gel mit dem Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) extrahiert ausgeführt wurden. Die Proben wurden dann gereinigt und sequenziert, um die ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA) unter Verwendung von nach der Herstellung der Anweisung und einem ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). Die Ergebnisse wurden mit 3100 Datenerfassungs-Software analysiert. Sequenzierung wurde in beiden Strängen durchgeführt. In Fällen mit Verdacht auf Mutationen wurde die PCR-Amplifikation wiederholt und die Probe wurde erneut sequenzierten PCR-Artefakte auszuschließen.
EGFR Copy Number Variation Screening
Die Paraffinblöcke bei 5 &mgr; m und Gewebeschnitten geschnitten wurden bei 60 ° C getrocknet wurden für 30 Minuten. Die Objektträger wurden gewaschen und deparaffinised durch eine Vorbehandlung und einem Verdauungsschritt unter Verwendung von Pepsin und schließlich dehydriert, gefolgt. Der LSI-EGFR Dual Color Probe-Hyb-Set (Vysis ®), optimiert die Bandregion 7p12 in Spektrum orange und Zentromer von Chromosom 7 (7p11.1-Q11.1, D7Z1 Locus) in Spektrum grün, beide zu erkennen in Interphasezellkernen und auf Chromosomen in der Metaphase, verwendet wurde. Fünf ul der Sonde wurden zu jeder Folie aufgetragen. gefolgt von Hybridisierung auf einer feuchten Kammer 16 Stunden bei 37 ° C Die Denaturierung wurde 8 Minuten bei 80 ° C durchgeführt wird. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger gewaschen und mit 4'-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für die Kernfärbung inkubiert. Zur Auswertung sechzig bis 100 intakten Interphasekerne wurden von zwei unabhängigen Beobachtern analysiert, um die Signale für das Chromosom 7 Zentromer und EGFR-Gen zu punkten. Umliegende Lymphozyten und normale Schleimhaut wurden als interne Qualitätskontrolle für die Tests verwendet. Mindestens zwei oder drei repräsentative Bereiche der neoplastischen Zellen wurden ausgewählt, unter einer 100 × /200 × Verstärkung Feld, um die Kerne Signale zu zählen. Nach einer Übersicht unter einer 400 × Verstärkung wurden die Signale dann gezählt Sionsöl verwendet (1000 ×).
Statistische Analyse
Assoziationsstudien zwischen EGFR Veränderungen und der klinisch-pathologischen Merkmale der Fälle nur in 30 Fällen durchgeführt wurden (Tumoren für EGFR-Mutationen und EGFR-Kopienzahl Variation analysiert). Statistische Analysen wurden von der x2-Test oder Student t
Test bewertet. A p
Wert von <. 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen
Ergebnisse

• Banded Magen-Bypass - 4 Jahre Follow-up in einer prospektiven, multizentrischen analysis
• Depletion of OLFM4 Gens hemmt das Zellwachstum und erhöht die Sensibilisierung gegenüber Wasserstoffperoxid und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha induzierten Apoptose bei Magenkrebs cells