Epidermale groeifactorreceptor structurele veranderingen in maagkanker

Epidermale groeifactorreceptor structurele veranderingen in maagkanker
Abstract achtergrond
EGFR overexpressie is beschreven in vele humane tumoren waaronder maagkanker. Bij NSCLC patiënten EGFR somatische mutaties in het kinasedomein van het eiwit, alsmede genamplificatie geassocieerd met een goede klinische respons op EGFR remmers. In maagtumoren gegevens betreffende verbouwingen van EGFR blijft controversieel. Gezien de mogelijke therapeutische relevantie, wilden wij de frequentie en het type van structurele veranderingen in de EGFR
gen in een aantal primaire maagcarcinomen bepalen.
Methods
Directe sequentiebepaling van het kinasedomein van de EGFR
gen werd uitgevoerd in een reeks van 77 primaire maagcarcinomen. FISH analyse werd uitgevoerd in 30 gevallen. Associatiestudies tussen EGFR
veranderingen en de klinische pathologische kenmerken van de tumoren werden uitgevoerd.
Resultaten
Binnen de 77 primaire maagcarcinomen vonden we twee EGFR
somatische mutaties en verschillende EGFR
polymorfismen in exon 20. Zes verschillende intronsequentie varianten van EGFR
werden ook gevonden. Vier maagcarcinomen toonde evenwichtige polysomie of EGFR
genamplificatie. We vastgesteld dat maagcarcinoom met afwijkingen van EGFR
(somatische mutaties of kopienummer variatie) vertoonden een significante toename van de tumorgrootte (p
= 0,0094) in vergelijking met wildtype EGFR
carcinomen.
conclusie
We tonen aan dat EGFR
structurele veranderingen zijn zeldzaam in maagcarcinoom, maar wanneer aanwezig, het leidt tot tumorgroei. Wij vonden dat het zoeken naar EGFR
veranderingen in maagkanker is waarschijnlijk klinisch belangrijk om patiënten te identificeren gevoelig reageren op tyrosine kinaseremmers zijn. Achtergrond
maagkanker de op één na belangrijkste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1] een scenario dat de behoefte aan specifieke en efficiënte therapieën belicht. De exacte mechanismen die ten grondslag liggen aan de maag carcinogenese zijn nog niet volledig begrepen, maar het bewijsmateriaal wijst op een associatie met routes die betrokken zijn bij ontwikkelingsprocessen [2]. Sleutelmoleculen deze routes zijn receptortyrosinekinasen (RTK's), die blijken afwijkend worden geactiveerd of overexpressie in een verscheidenheid van tumoren en vertegenwoordigen dus veelbelovende doelen voor therapeutische interventie. Ondernemingen De leden van de RTK superfamilie ErbB receptoren glycoproteïnen die bestaan ​​uit een extracellulair domein waarbij de binding van liganden plaatsvindt, een korte lipofiel transmembraandomein en een intracellulair domein die de tyrosinekinase-activiteit [3, 4]. Zij worden uitgedrukt in verschillende weefsels van epitheliale, mesenchymale en neuronale oorsprong, wanneer zij een centrale rol in de ontwikkeling, proliferatie en differentiatie spelen. Gedereguleerde expressie van ErbB moleculen, namelijk ErbB2 is betrokken bij de ontwikkeling van verschillende typen tumoren, waaronder maagtumoren. In maagcarcinoom is aangetoond dat overexpressie van ErbB2 wordt aangedreven door genamplificatie en carcinomen geassocieerd met hoge invasiepotentieel [5]. ErbB1, beter bekend als epidermale groeifactor receptor (EGFR), is overexpressie beschreven in veel menselijke tumoren, met inbegrip van long, colon, borst, prostaat, hersenen, hoofd en hals, schildklier, eierstok, blaas, nieren en ook maagkanker [6 -11], en is gecorreleerd met geavanceerde tumor stadium en een slechte klinische uitkomst. Zeer recent hebben we aangetoond dat EGFR activering is geassocieerd met verlies van functie van E-cadherine, in vitro
[12]. Ondernemingen De mechanismen voor oncogene omzetting van EGFR bij kanker omvatten geamplificeerd kopieaantal structurele herschikkingen van de receptor en activerende mutaties [13]. EGFR mutaties clusteren in het kinasedomein van de EGFR (exons 18-21), en veroorzaken ligand-onafhankelijke activering van de receptor, die mogelijke doelwitten voor therapeutische interventie. Hierbij EGFR somatische mutaties en genamplificatie bij patiënten met niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) sterk correleren met de klinische respons op kinaseremmers [14, 15] tyrosine.
In maagtumoren, gegevens betreffende structurele veranderingen van EGFR blijft controversieel. Gezien de mogelijke therapeutische relevantie van deze studie was het doel om de relevantie van EGFR structurele veranderingen in maagkanker verduidelijkt door het analyseren van een reeks primaire maagcarcinomen voor kopieaantal en mutaties in het tyrosine kinase domein (exons 18-21) van de EGFR
gen.
Methods
Case selectie en histopathologische classificatie van de tumoren
vertegenwoordiger blokken van 77-formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde menselijke maag primaire tumoren werden opgehaald uit de afdeling Pathologie van het ziekenhuis S. João na geïnformeerde toestemming van de patiënten. Patiënten werden geïnformeerd dat tumor materiaal zou worden gebruikt alleen voor onderzoeksdoeleinden. Geen van de patiënten in deze serie hadden een familiegeschiedenis van maagkanker. H & E gekleurde coupes werden gebruikt om tumoren te categoriseren op basis van de classificaties van Lauren en Ming. Penetratie van de maagwand en de aanwezigheid en lokalisatie van metastasen vermeld voor alle patiënten die standaardcriteria voor pathologische staging. Orceïne-gekleurde coupes werden gebruikt voor de detectie van vasculaire invasie.
EGFR mutatiescreening
Genomisch DNA van 10 urn gedeelte na microdissectie van de tumorzones werd geëxtraheerd met een zuiverheid garanderen ten minste 70% van neoplastische cellen. DNA-extractie werd uitgevoerd met behulp van Genomic DNA Purification Kit (Gentra System) volgens het protocol van de fabrikant. Exon-specifieke primers werden ontworpen en DNA werd onderworpen aan PCR-amplificatie van exons 18, 19, 20 en 21. De vier EGFR
exonen coderen voor tyrosine kinase domein van EGFR. Primersequenties worden getoond in Tabel 1 1.Table Primers gebruikt voor PCR amplificatie van het EGFR-kinasedomein
Exon

primersequentie
PCR-product grootte (bp)
Exon 18
Forward
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Reverse
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
Forward
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Reverse
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Reverse
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
Forward
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Reverse
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PCR-producten liet men lopen op een 2% agarosegel en PCR geamplificeerde banden werden uit de gel met de gel Band zuiveringskit (GE Healthcare). Monsters werden vervolgens gezuiverd en gesequenced met behulp van de ABI Prism BigDye dGTP Terminator Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA) volgens instructies vervaardiging en een ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin Elmer, Foster City, CA). De resultaten werden geanalyseerd met 3100 gegevensverzameling software. Sequentiebepaling werd uitgevoerd op beide strengen. In gevallen met een vermoeden van mutaties werd PCR-amplificatie herhaald en het monster werd opnieuw opeenvolgende uit te sluiten PCR artefacten.
EGFR Copy Number Variation Screening
De paraffine blokken werden coupes op 5 pm en weefsel secties werden gedroogd bij 60 ° C gedurende 30 minuten. De objectglaasjes werden gewassen en deparaffinised gevolgd door een voorbehandeling en ontsluitingsstap behulp pepsine en tenslotte ontwaterd. De LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (Vysis ®), geoptimaliseerd om de band regio 7p12 detecteren spectrum oranje en het centromeer van chromosoom 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) in het spectrum groen, zowel in interfase kernen en metafase chromosomen, werd gebruikt. Vijf pi van de probe werden toegepast op elke dia. De denaturatie werd uitgevoerd bij 80 ° C gedurende 8 minuten gevolgd door hybridisatie op een vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 16 uur. Na hybridisatie werden objectglaasjes gewassen en geïncubeerd met 4'-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) voor nucleaire kleuring. Voor de evaluatie werden zestig tot 100 intact interfase kernen geanalyseerd door twee onafhankelijke waarnemers om de signalen te scoren voor de chromosoom 7 centromeer en het EGFR-gen. Omringende lymfocyten en normale slijmvlies werden gebruikt als interne kwaliteitscontrole voor de testen. Tenminste werden twee of drie representatieve gebieden van de neoplastische cellen geselecteerd, onder een 100 × /200 × amplificatie veld, de kernen signalen tellen. Na een overzicht onder een 400 × amplificatie werden de signalen vervolgens geteld met behulp van immersie olie (1000 ×).
Statistische analyse
Vereniging studies tussen EGFR wijzigingen en de klinisch-pathologische kenmerken van de gevallen werden alleen uitgevoerd in 30 gevallen (tumoren geanalyseerd op EGFR mutaties en EGFR copy number variation). Statistische analyses werden door de x2-test of de Student's t Electronics Test. Een p
waarde van <. 0,05 werd beschouwd als statistisch significant
Resultaten
EGFR Mutation Screening
Van de 77 maag carcinomen geanalyseerd, EGFR
mutaties in exons 18-21 werden gedetecteerd in 2,6% (2/77) van de gevallen (Fig. 1A). Één mutatie was voor exon 20 en een missense mutatie (2300 C > T) leidt tot de substitutie van de Alanine 767 voor een Valine. De tweede mutatie getroffen exon 21 en een missense mutatie (2524 A > G) die leidt tot substituition van de Asparagine 842 voor een asparaginezuur. Geen van de mutaties zijn eerder beschreven. Geen reeks veranderingen werden gevonden in exons 18 en 19. Figuur 1 Structurele veranderingen in de EGFR. (A) Directe sequentiebepaling die één van de mutaties in het kinasedomein van de EGFR - missense mutatie (2300 C > T) in exon 20 leidt tot de substitutie van alanine voor een 767 Valine. (B) Diffuse maagcarcinoom met EGFR verhoogde aantal kopieën veroorzaakt door chromosoom 7 polysomie. (C) neoplastische cellen vertonen genamplificatie met de vorming van clusters met verschillende signalen voor EGFR. EGFR
verschillende polymorfismen gevonden in exon 20 (tabel 2). Het polymorfisme 2361G > A Gln787Gln, eerder beschreven door Mu et al
[16], aanwezig in 55,8% (43/77) van de gevallen, en in negen van de 43 gevallen in een homozygote toestand was. We gescreend 50 normale controles en de 2361G > Een Gln787Gln aanwezig in 82% van de controles (41/50) was. Twee andere EGFR stille mutaties (de 2301 C > T Ala767Ala en 2415 C > T His805His) gevonden in exon 20, geen van hen eerder beschreven. Beide veranderingen werden gevonden in een enkel geval en waren afwezig bij normale controls.Table 2 Sequence veranderingen gevonden door directe sequentiebepaling

Wijziging

Type
Frequency
Referenties
Exon 18
2184 + 19 G > A
intronic variant
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
intronic variant
1/77 Nog niet
beschreven
2283 + 11 G > Een
intronic variant
1/77
nog niet beschreven
2283 + 47 G > A
intronic variant
1/77
nog niet beschreven
2283+ 49 C > T Shirts intronic variant
1/77 Nog niet
beschreven
Exon 20
2284-60 C > T Shirts intronic variant
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T Shirts Missense Ala 767 Val
1/77
nog niet beschreven
2301 C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
nog niet beschreven
2361G > A
Silent Gin 787 Gin
43/77
[16]
2415 C > T
Silent Zijn 805 Zijn
1/77
nog niet beschreven
Exon 21
2524 A > G
Missense Asn 842 Asp
1/77
nog niet beschreven
We hebben zes verschillende sequentievarianten gelokaliseerd in intron gebieden van EGFR, beiden eerder beschreven in Ensembl [17].
EGFR copy Number Variation Screening
analyse van EGFR
kopieaantal, zoals bepaald door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werd alleen in 30 van de 77 gevallen geanalyseerd op EGFR mutaties. Alle EGFR
signalen werden vergeleken met signalen voor centromere probes voor chromosoom 7. Meer dan 2,0 EGFR
kopieën per cel (gebalanceerd polysomie of genamplificatie) werden gedetecteerd in 13,3% (4/30) van de gevallen. Van de vier gevallen toont meer dan 2 exemplaren van EGFR
per chromosoom 7, drie had copy number toegenomen als gevolg van polysomie en men had genamplificatie, een diffuse maagcarcinoom, vertonen de vorming van clusters met tal van signalen voor EGFR
(fig. 1B, C).
EGFR verbouwingen en clinicopathologic parameters van de patiënten en tumoren
Tabel 3 toont de statistische associaties tussen veranderingen EGFR en clinicopathologic kenmerken van de patiënten en tumoren. Bij het vergelijken van maagcarcinoom herbergen EGFR wijzigingen met carcinomen met een normale status van EGFR of copy number, zagen we een significant verband tussen EGFR verbouwingen en de toegenomen omvang tumor. (P
= 0,0094). Geen significante associaties gevonden tussen EGFR wijzigingen en andere clinicopathologic parameters van de patiënten en tumoren, namelijk geslacht en leeftijd van de patiënt, tumor lokalisatie, weefseltype, muurdoorvoering de aanwezigheid van lymfeklier metastase, vasculaire invasie en stagering van de tumor .table 3 Vereniging van EGFR-gen wijzigingen met klinisch-pathologische parameters
clinicopathologische parameters
EGFR-status

Amplification /mutatie (n = 6)
Normaal (n = 24)
Totaal (n = 30)
p
waarde
Sex (F /M)
1/5
10/14
11/19
0,2557
Age (SD)
62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2
0,4271
Tumor lokalisatie
0,8548
proximale
3
11
14
distale
3
13
16
Size (SD)
11,6 ± 9,8
5,8 ± 2,0
6,9 ± 5,0
* 0,0094
indeling Lauren's
0,1261
Intestinal 1
12
13
Zend
5
9
14
Atypische
0
3
3
Muur penetratie
0,4642
Early (T1)
0 Pagina 2 2
Geavanceerd (T2-T4)
6
22
28
Vascular Invasion
0,7125
Absent ( N0)
3
14
17
Present (N = 1)
3
10

• Gestreepte gastric bypass - vier jaar follow-up in een prospectieve multicenter analysis
• Uitputting van OLFM4 gen remt celgroei en verhoogt de gevoeligheid voor waterstofperoxide en tumornecrosefactor-alfa geïnduceerde apoptose bij maagkanker cells