Högre antal av Helicobacter pylori CagA Epiya C fosforyleringsställen ökar risken för magcancer, men inte duodenalsår

Högre antal Helicobacter pylori
CagA Epiya C fosforyleringsställen ökar risken för magcancer, men inte duodenalsår Bild Sammanfattning
Bakgrund
Helicobacter pylori
infektion är en av de vanligaste infektioner över hela världen och är associerad med gastrisk cancer och magsår. Bakteriella virulensfaktorer såsom CagA har visat sig öka risken för båda sjukdomarna. Studier har föreslagit en avgörande roll för CagA Epiya polymorfism i gastric cancer, och det har visat sig vara geografiskt spridda. Vi studerade samband mellan H. pylori
CagA Epiya mönster och magcancer och tolvfingertarmen, i ett etniskt blandat Western befolkningen från Brasilien. CagA Epiya bestämdes genom PCR och bekräftades genom sekvensering. Totalt 436 patienter ingick, var 188 med magsäckscancer, 112 med tolvfingertarmen och 136 med gastrit.
Resultat
Antalet Epiya C segment var signifikant associerad med ökad risk för magsäckscancer (OR = 3,08 , 95% CI = 1,74-5,45, p < 10 -3) även efter justering för ålder och kön. Högre antal Epiya C segment var också förenad med gastric atrofi (p = 0,04) och intestinal metaplasi (p = 0,007). Dessutom patienter infekterade av CAG
A-stammar som har mer än en Epiya C-segmentet visade minskade serumnivåer av pepsinogen I i jämförelse med dem som smittats av stammar som innehåller en eller mindre Epiya C upprepa. Annars hade antalet Epiya C segment inte förknippar med duodenalsår.
Slutsatser
Våra resultat visar att infektion med H. pylori
stammar som hyser mer än en CagA Epiya C motiv tydligt samband med magcancer, men inte med duodenalsår.
Högre antal Epiya C segment var också förenad med gastric precancerous lesions som framgår av histologiska gastric atrofiska och metaplastiska förändringar och minskade serumnivåer av pepsinogen I.
bakgrund
Helicobacter pylori
koloniserar magsäcken hos mer än hälften av världens befolkning och är förknippad med utvecklingen av komplikationer såsom magsår, magcancer, och magslemhinna associerade lymfoid vävnad lymfom [1-4]. De faktorer som leder få individer att utveckla relaterade sjukdomar, medan majoriteten av infekterade människor förblir asymtomatisk, är okända, men de har varit föremål för intensiv forskning. Bland de värdfaktorer, var cytokin gen polymorfismer visat sig öka risken för magcancer, särskilt IL1B
-31, IL1RN
och TNFA
-307 single nucleotide polymorphisms i europeiska populationer, och IL1RN
i en brasiliansk befolkning [5-9]. Patogen stamspecifika faktorer har varit starkt undersökts. Bland dem är den CagA-proteinet accepteras som en riskfaktor för både magsår och magcancer [5, 10-12]. I en studie av vår grupp, infektion av H. hade pylori CAG
A-positiva stammar en odds ratio (OR) 11,9 för magcancer, efter justering för värd polymorfism och andra variabler, medan den starkaste värdfaktor var IL1RN
2 allel, med en OR av 1,9 [5].
cag Review, ett tillhör en cag
PAI (patogenicitet ö) som kodar ett typ IV sekretionssystem (T4SS) associerad med ökad utsöndring av IL -8, en mycket stark proinflammatorisk kemokin som deltar i gastrit inducerad av H. pylori
infektion. Den T4SS är också ansvarig för den ingången av CagA-proteinet in i de gastriska epitelceller där CagA fosforyleras på tyrosinresten inom fosforyleringskinetiken motiven i carboxi-terminala variabla regionen av proteinet. Dessa motiv är definierade som Epiya (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala) A, B, C och D enligt olika flankerande aminosyror. CagA-proteinet besitter nästan alltid Epiya A- och B-segment som följs av ingen, en, två eller tre C-segment, i stammar som cirkulerar i västländerna, eller en D-segmentet, i östasiatiska länder. Den Epiya C och D är de viktigaste platserna för fosforylering av CagA. Fosforylerad CagA bildar en fysisk komplex med SHP-2 fosfatas och utlöser onormala cellulära signaler som leder till avreglering av celltillväxt, cell till cell kontakt och cellmigration, förlängning av epitelceller och ökning av epitelceller omsättning, som ökar risken för skadade celler till förvärva precancerösa genetiska förändringar. Bära typ D Epiya eller flera C upprepas är associerad med ökad SHP-2 fosfatasaktivitet induceras av CagA [13, 14], vilket ökar risken att smitta av CagA stammar som har högre antal Epiya C segment predisponerar för precancerous lesions och magcancer.
i själva verket har denna hypotes testats i östländerna, men studieresultaten är disharmoniska. Azuma et al
. [15] fann ökad andel Epiya D stammar hos patienter med atrofisk gastrit och magcancer, men andra författare har kunnat återskapa dessa resultat [16, 17]. Även i västerländska populationer, signifikant samband mellan magcancer och ökat antal Epiya C motiv kunde påvisas i två studier [18, 19], kanske antingen genom ett litet antal inkluderade patienter i andra studier [20-22], eller regionala /etnicitet skillnader som redan visats för andra H. pylori
virulens markörer [23, 24]. Dessutom har skillnader har också visats i studier som utvärderar antalet Epiya C motiv och duodenalsår [19, 25], som förtjänar i djupa undersökningar eftersom duodenalsår och magcancer är ömsesidigt uteslutande H. pylori
-associated sjukdomar.
Därför utvärderade vi om ökat antal CagA Epiya C fosforylering motiv förknippas med magcancer och /eller sår i tolvfingertarmen med ett stort antal patienter för att undvika partiskhet och för att möjliggöra justering för ålder och kön i en västerländsk population från Brasilien. Eftersom duodenalsår och magcancer är ömsesidigt uteslutande sjukdomar, och CAG Review, en är en riskfaktor för båda sjukdomarna utvärderade vi även om antalet Epiya C segment av stammar som isolerats från patienter med duodenalsår skilde sig från de stammar isolerade från mag cancerpatienter. Eftersom gastric atrofiska och metaplastiska förändringar - precancerous lesions - leda till försämring av produktionen av pepsinogen I (PGI) med chefen och slemhinnor hals celler i corpus och fundic körtlar, utvärderade vi om det ökade antalet Epiya C motiv var associerad med serum pepsinogen nivåer.
Resultat
egenskaperna hos patienterna visas i tabell 1. närvaron av H. pylori
-specifika ure
A och 16S rRNA
lyckades bekräftades genom PCR i alla studerade stammar och CAG Review, en PCR var positiva, med åtminstone en av den metod som används i alla strains.Table 1 Patient egenskaper och distribution av CagA Epiya genotyper enligt H. pylori
-associated sjukdomar
vid gastrit 136 (%)
Magcancer 188 (%)
Duodenalsår 112 (%)
vid medelålder (SD) Review 52,5 (16,9) Review 62,3 (13,9) Review 43,5 (15,1) katalog manligt kön
48 (35,3) Review 114 (60,6)
53 (47,3) Review Epiya-AB
3 (2,2) Review 3 (1,6) Review 4 (3,6) Review Epiya-ABC
108 (79,4) Review 107 (56,9) Review 93 (83,0) Review Epiya-ABCC
21 (15,4) Review 65 (34,6) Review 15 (13,4) Review Epiya-ABCCC
4 (3,0)
13 (6,9) Review 0 (0,0) Review SD, standardavvikelse
Fastställande av CagA Epiya mönstrar iphone PCR-förstärkta produkter från alla CAG
A-positiva stammar visade tydliga mönster i 3'-variabla regionen av cag
A. En elektroforesgel som representerar de olika CagA Epiya typer visas i Figur 1. den PCR-resultat bekräftades genom sekvensering på sjuttio fem slumpmässigt utvalda PCR-produkter från patienter i varje grupp. Figur 1 Elektrofores av representativa prover med vart och ett av CagA Epiya typer ses hos patienter med H. pylori -associated sjukdomar. Kolumn 1: 100 bp standard; Kolumn 2: Epiya-AB; Kolumnerna 3, 8, 11, och 12: Epiya-ABC; Kolumn 4: Epiya-ABC + -ABCCC; Kolumnerna 5 och 13: Epiya-ABCC; Kolumn 6: Epiya ABCCC; Kolumn 7: Epiya-ABCC + -ABCCC; Kolumn 9: Epiya-ABC + -ABCC + -ABCCC; Kolumn 10:. Epiya-ABC + -ABCC
nr Epiya D hittades i H.pylori
stammar studerades. Fördelningen av Epiya genotyper visas i tabell 1.
associering mellan antalet Epiya C segment och magcancer och tolvfingertarmen
kolonisering av H. pylori
CagA-positiva stammar som har två eller tre Epiya C motiv var mer frekvent (p < 10 -3) i magcancer (78/188, 41,5%) än i gastrit (25/136, 18,4%) patienter. Föreningen förblev starkt betydande även efter justering för ålder och kön med hjälp av logistisk regression (tabell 2). Det Hosmer-Lemeshow test visade god kondition av modellen (Chi-kvadrat = 3,98, 8 frihetsgrader, p = 0,86, med 10 steg). Annars hade antalet Epiya C segment inte förknippar med duodenalsår (tabell 2) .table två associering mellan antalet CagA Epiya C motiv och H. pylori
-associated sjukdomar
vid univariat analys
multivariat analys
vid p
ELLER

95% CI
p
Magcancer Omdömen - Stigande ålder Hotel < 10-3
1,04
1,03-1,06 Hotel < 10-3 Omdömen - kvinnligt kön Hotel < 10-3
0,29
0,18-0,48 Hotel < 10-3 Omdömen - Högrisk Epiya (ABCC eller ABCCC) Hotel < 10-3
3,08
1,74-5,45 Hotel <
10-3 Duodenalsår Omdömen - Stigande ålder Hotel < 10-3
1,03
1,02-1,05 Hotel < 10-3 Omdömen - kvinnligt kön
0,04
1,26
0,73-2,18
0,41 Omdömen - Högrisk Epiya (ABCC eller ABCCC) katalog 0,29 Omdömen -
- -
Hosmer-Lemeshow test visade god kondition av modellen av magcancer (8 frihetsgrader, p = 0,86, med 10 steg) och duodenalsår (8 frihetsgrader, p = 0,25, med 10 steg).
eftersom det kan vara spekulerat att antalet Epiya C motiv ökar med stigande ålder, konstruerade vi också en modell med antalet Epiya C är den beroende variabeln och ålder, kön och H. pylori
-associated sjukdomar som oberoende covariables. Ökade Epiya C segment inte förknippar med åldern (p = 0,13), kön (p = 0,66) och duodenalsår (p = 0,29), men förblev i samband med magcancer (p < 10 -3, OR = 2,81; 95% CI = 1.64 -. 4.82) associering mellan bland kolonisering och sjukdomar
blandad stam infektion observerades i 57 (13,08%) patienter och det var betydligt vanligare hos patienter med magsäckscancer (38/188
, 20,2%) än i de med gastrit (14/136, 10,3%) med en eller magcancer av 2,21 (95% CI = 1,10-4,50). Annars var blandad infektion mindre frekvent hos duodenalsårspatienter (5/112, 4,5%) med en tendens till en negativ association (p = 0,09) associering mellan antalet Epiya C segment och serum PGI nivåer <.
Br> Den pepsinogen i serumnivåer var signifikant högre (p = 0,01) i tolvfingertarmen (medelvärde 161,67 ± 102,36 pg /L) än i gastrit (100,37 ± 70,85 pg /L). sälja The patienter infekterade av CagA stammar som har två eller tre Epiya C segment visade sänkta nivåer av PGI i jämförelse med de med infektion av CagA-stammar som besitter ≤ 1 Epiya C segmentet (duodenalsår: 179,67 ± 83,30 vs. 67,01 ± 34,30, respektive, p = 0,02 och gastrit: 109,26 ± 85,61 vs. 57,55 ± 34,61, respektive, p = 0,01) associering mellan antalet Epiya C upprepningar och gastric histologiska förändringar och tumörklassificering
Ökat antal Epiya C-segment.
var associerad med närvaron av precancerösa lesioner, antingen atrofi ( p = 0,04) eller tarm metaplasi (p = 0,007), men inte med de andra histologiska parametrar. Dessutom gjorde infektion av stammar som bär ökade Epiya C motiv inte förknippar med intestinal eller diffus tumörtyp (p = 0,34).
Diskussion
I denna studie, genom att utvärdera ett stort antal patienter, visade vi att de infekterade av CagA-positiva H. pylori
stammar som har mer än en Epiya C motiv är på tre gånger-faldigt ökad risk att utveckla magcancer. Styrkan i vår studie inkluderar tillräcklig provstorlek, identifiering av stammar med hjälp av PCR med bekräftelse genom sekvensering och justering för confoundingfaktorer av logistisk regressionsanalys.
CagA anses vara en viktig bakterie virulensfaktor i samband med både gastrisk adenokarcinom och duodenalsår sjukdom [2, 5, 11, 12, 26]. Antalet och mönstret av fosforylering motiv tycks ytterligare skikta riskerna med enskilda stammar [18, 27].
Det har visats att H. pylori
CagA Epiya mönster har en betydande geografisk variation och noga följa mönster historiska human migreringar. Epiya D är en karakteristisk asiatisk Epiya mönster som i stort sett inte förekommer i västra H. pylori
stammar [28]. Brasilian bildar en unik västerländska befolkningen eftersom, trots de många ursprung och den därav mångfald av fenotypisk utseende, har det skett en avsevärd grad av interetnisk avel och därmed de flesta individer kan inte tillskrivas någon av de grundande grupperna på grundval av genetisk bakgrund, snarare de bär omkring 33% av gener från var och en av de stora tävlingarna som historiskt består landet (kaukasier, afrikaner och indianer) [29]. Mot denna bakgrund skulle det förväntas att hitta några CagA Epiya D i vår H. pylori
stammar, eftersom det har upptäckts bland indianer (i linje med teorin att initialt människor från Asien befolkade Amerika migrerar från Östasien ), men vi inte upptäcka någon Epiya D i vår befolkning.
Tyvärr finns det få studier med avseende på sambandet mellan Epiya C nummer och H. pylori
associerade sjukdomar i väst populationer med överensstämmande resultat bland dem. Basso et al
. [19] visade att större antal Epiya C segment var associerad med magcancer i en kaukasiska populationen från Italien, i likhet med resultaten av Yamaoka et al
. [18] utvärdera amerikanska patienter från Texas. Annars var inget samband observerades när colombianska patienter utvärderades i Yamaoka studie [18] i enlighet med de resultat som Acosta et al
. [22], medan Sicinschi et al
. [21] observerade samband mellan ökad Epiya C segment och precancerous lesions. Även icke-avgörande resultat publiceras av Argent et al
. [20] utvärdera 44 stammar från afrikanska patienter författarna visade tendens för association mellan CagA med två eller flera Epiya C segment och magcancer.
Dessa skillnader kan förklaras av olika studiedesign, urvalsstorleken, populationer och geografisk spridning av H . pylori
markörer för patogenitet, i förhållande till CagA Epiya mönster, understryker behovet av att studera olika geografiska regioner. sälja resultaten från denna studie visade att större antal Epiya C segment är associerad med magcancer och med pre -malignant lesioner, atrofi och intestinal metaplasi av corpus slemhinnan i den grupp av patienter med gastrit. I överensstämmelse med dessa resultat visade vi också att serumkoncentrationen av PGI var dubbelt minskade i patienter infekterade med cag Review, en-positiva stammar med två eller tre Epiya C motiv. Eftersom SGB utsöndras av huvudceller och slemhinnor hals celler i corpus och fundic körtlar, serum SGB nivåer återspeglar den funktionella och morfologiska status oxyntic magslemhinnan; alltså, gastric atrofiska /metaplastiska förändringar leder till minskad SGB serumnivåer [30, 31]. Även corpus slemhinnan av patienter med H. pylori
duodenalsår är antingen milt eller inte inflammerad, SGB serumnivåerna sjunker också i duodenalsårspatienter infekterade av stammar som innehåller högre antal Epiya C-segment.
Resultaten med denna studie att stärka den potentiella rollen av CagA polymorfism i utvecklingen av magcancer i överensstämmelse med resultaten från tidigare studier [18, 19]. Vi kan dock inte utesluta att den genetiska konstitution värden, mer än bakteriestam kan predisponera för atrofisk gastrit och H. pylori
stammar som bär allt fler Epiya C upprepningar skulle ha en fördel gentemot andra stammar i kolonisera nya gastric miljön eller alternativt en mer komplext samspel av båda mekanismerna.
med avseende på tolvfingertarmen, även resultaten från studierna är disharmoniska [19, 25]. Våra resultat är i överensstämmelse med de som rapporterats av Basso et al
. [19] som också inte hittar association mellan sjukdomen och antalet Epiya C-segment i en italiensk population. Noterbart var ingen patient med duodenalsår av vår kohort koloniserades av CagA som har tre Epiya C-segment. Som framgår av Yamaoka et al
. [18], är det möjligt att stammar med högre antal Epiya C-segment kan vara mindre motståndskraftiga mot syran [18].
Vi utvärderade även om kolonisering av olika stammar (blandad infektion) skulle kunna förknippas med sjukdomsutfall. Vi fann att patienter med ventrikelcancer signifikant oftare koloniserade av blandade stammar, medan patienter med duodenalsår hade en trend mot mindre bland kolonisering. En möjlighet är att patienter med magcancer skulle ha områden av magslemhinnan som visar cancer transformation, omväxlande med områden av atrofi, intestinal metaplasi, dysplasi, och normal slemhinna, var och en av dem representerar mikromiljöer som skulle vara selektivt fördelaktigt att blandinfektioner [32, 33 ].
slutsatser
Sammanfattningsvis fann vi att infektion av H. pylori
CagA-positiva stammar som hyser flera Epiya C upprepar associeras med gastric precancerous lesions och magcancer, men inte med duodenalsår i en etniskt skiftande, blandas, Western befolkning.
Även infektion av H. pylori CAG
A-positiva stammar är en riskfaktor för ömsesidigt uteslutande sjukdomar, magcancer och tolvfingertarmen, CagA stammar som har högre antal Epiya C segment var i samband med magcancer, men inte med duodenalsår.
Högre antal Epiya C segment var också förenad med gastric precancerous lesions som framgår av histologiska gastric atrofiska och metaplastiska förändringar och minskade serumnivåer av pepsinogen I.
Metoder
patienter
Vi ingår 436 patienter infekterade med cag Review, en positiva stammar av H. pylori
(188 med magsäckscancer, 112 med tolvfingertarmen och 136 med gastrit), bland dem som lämnades in till endoskopi till klargöra ursprunget för symptom relaterade till den övre mag-tarmkanalen eller som genomgick gastric operation för att avlägsna magcancer vid Universitetssjukhuset /UFMG, Luxemburgo, och Mario Penna sjukhus, i Belo Horizonte, Brasilien. De flesta av de medföljande personer (> 80%) var av låg socioekonomisk nivå med liknande kulturella vanor, och alla var född i Minas Gerais stat med samma etniska bakgrund, ca 33% av portugisiska, 33% av indian och 33% av afrikansk anor, homogent närvarande i varje ämne [29].
studien godkändes av institutionella etiska kommittéer och informerat samtycke erhölls från alla patienter. Transport, kultur, och mikrobiologisk identifiering av de bakterieisolat utfördes såsom tidigare beskrivits [34, 35].
Histologi
I gruppen av gastrit och duodenalsårspatienter, endoskopiska biopsiprov av antral och oxyntic magslemhinna erhölls för histologisk och mikrobiologisk undersökning. Antral och oxyntic biopsiprover fixerades i 10% formalin och inbäddades i paraffin, och 4-um-tjocka histologiska sektioner färgades med carbolfuchsin för H. pylori
undersökning [35] och hematoxycilin och eosin för histologisk utvärdering enligt den uppdaterade Sydney System [36]. I gruppen av patienter med ventrikelcancer ades de fragment som erhållits från magen avlägsnades genom gastrektomi efter att ha öppnat den längs den större krökningen inom en timme efter resektion. Tumören klassificerades enligt Lauren [37] Extraktion av bakteriellt DNA
Bakterie-DNA som erhållits från 60 mm petriskål tillväxt.
Extraherades med användning av QIAmp (QIAGEN, Hilden, Tyskland) kit enligt tillverkarens rekommendationer med mindre modifieringar . Destillerat vatten användes som ett reaktionskontroll. DNA-koncentrationen bestämdes genom spektrofotometri med användning av Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, NC) och lagrades vid -20 ° C tills Amplifiering av H. pylori
-specifika ure
A och 16S rRNA br> gener
närvaron av specifika ure Review, en och 16S rRNA
gener utvärderades enligt Clayton et al.
[38] och Fox et al
. [39] respektive. Standard Tx30a H. pylori
stam användes som en positiv kontroll, och en Escherichia coli och destillerat vatten
stammen båda används som negativa kontroller.
Termocykler GeneAmp PCR-system 9700 (Applied Biosystems, Foster City , CA) användes för alla reaktioner. De amplifierade produkterna genomgick elektrofores i 2% agarosgel, färgades med etidiumbromid och analyserades i en ultraviolett ljus transilluminator.
Amplifiering av cag Review, en gen
cag Review, en genen amplifierades medelst av två tidigare beskrivna primerpar [40, 41]. En H. pylori
stam från vår samling (1010-1095), känd för att vara CAG
A-positiv, användes som en positiv kontroll, och Tx30a H. pylori
stam som saknar cag Review, en och destillerat vatten till båda används som negativa kontroller. H.pylori
stammar ansågs vara CAG
A-positiv när åtminstone en av de två reaktionerna var positiva.
Amplifiering av 3'-variabla regionen av cag Review, en Hus Till PCR-amplifieringen av 3'-variabla regionen hos den cag Review, en gen (som innehåller de Epiya sekvenser), 20 till 100 ng DNA tillsattes till 1% Taq DNA-polymeras-buffertlösning (KCl 50 mM och Tris-HCl 10 mM), 1,5 mM MgCl 2, 100

• Bristen på enighet mellan tonometric och magsaft partiell koldioxidtryck
• Nedreglering av bindvävstillväxtfaktor hämmar tillväxten och invasion av gastriska cancerceller och dämpar peritoneal dissemination