CHD5 nedregleras genom promotor hypermethylation i gastric cancer

CHD5 nedregleras genom promotor hypermethylation i magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Nonhistone kromosomala proteiner i samförstånd med histoner spelar viktiga roller i replikationen och reparation av DNA och i regleringen av genuttryck. Avregleringen av dessa proteiner kan bidra till utvecklingen av en mängd olika sjukdomar såsom cancer. Som nonhistone kromosomprotein har chromodomain helikas DNA-bindande protein 5 (CHD5) nyligen identifierats som produkten av en ny tumörsuppressorgen (GTS), främja transkriptionen av p19 ink4a och sälja P16 ARF
. Inaktivering av CHD5 uppnåddes delvis genom genetisk deletion eftersom det ligger i 1p36, en region raderas ofta i humana tumörer. I denna studie har vi som mål att studera engagemang CHD5 i magcancer, den näst vanligaste cancerformen i världen.
Metoder
CHD5 uttryck i en panel av gastric cancerceller bestämdes genom kvantitativ RT-PCR. Metylering av CHD5 utvärderades genom metylering specifik PCR och bisulfit sekvensering. Effekten av CHD5 på tillväxten av gastric cancerceller testades genom kolonibildningsanalys.
Resultat
CHD5 uttryck nedregleras i alla gastric cancercellinjer används (100%, 7/7) och signifikant återställd efter farmakologisk demetylering. Metylering av CHD5 promotorn detekterades i alla sju gastric cancercellinjer och i de flesta primära gastric karcinomvävnader undersöktes (73%, 11/15). Slutligen, ektopisk uttryck för CHD5 i gastric cancerceller ledde till en betydande tillväxthämning.
Slutsats
CHD5 var en TSG epigenetiskt nedregleras i magcancer.
Bakgrund
alla eukaryota organismer har utvecklat utstuderade sätt av förpacknings DNA i kromatin genom dynamiska samspelet mellan olika DNA-associerade proteiner. Sådana förpackningar är inte bara viktigt för förvaring av genetisk information med hög trohet och integritet, utan också överföring av genetisk information från DNA till RNA i en tätt kontrollerat sätt. Proteiner som binder till DNA för att bilda kromatin är traditionellt indelade i två allmänna klasser: histoner och nonhistone kromosomala proteiner. Histoner är en grupp av mycket konserverade DNA-bindande proteiner och deras olika posttranslationella modifieringar utgör "histon kod" som styr förpackningen av DNA eller kromatinremodellering. Histon kod initieras, upprätthålls och tolkas till stor del av nonhistone kromosomproteiner [1-4]. Till exempel acetylering av lysinrester på histon tails av histonacetyltransferas (hattar) neutraliserar deras laddning och minskar affiniteten av histoner med DNA, vilket gör DNA åtkomlig för transkriptionsfaktorer för att initiera gentranskription. Omvänt, den deacetylering av dessa rester av histondeacetylaser (HDAC) åter denna affinitet och kan ta DNA från transkriptionsmaskineriet [5]. Förutom acetylering, fosforylering och metylering av histon svansar är viktiga för dynamisk sammanslutning av DNA med transkriptionsmaskineriet och andra kromosomala proteiner [6-8]. Nonhistone kromosomala proteiner spelar viktiga roller i tolkningen av histon kod genom att bilda kromatinremodellering komplex. Både histoner och nonhistone kromosomala proteiner är viktig för regleringen av genuttryck, DNA-replikation och DNA-reparation. Avreglering i uttrycket och aktiviteten hos dessa proteiner kan leda till utvecklingen av en mängd olika sjukdomar såsom cancer [9-13].
I en nyligen genomförd studie chromodomain helikas DNA-bindande protein 5 (CHD5) identifieras som en ny tumörsuppressorgen (GTS) i neuroblastom [14]. CHD5 tillhör en superfamilj av SWI2 /SnF2-relaterade ATPaser, en stor grupp av nonhistone kromosomproteiner. CHD5 kodar en unik kombination av funktionella domäner bestående av två N-terminala chromodomains, följt av en SWI2 /SnF2-liknande ATPas /helikas domän och en DNA-bindande domän [14]. Genom att reglera kromatinstrukturen, kan CHD5 främja uttrycket av p19 arf som fungerar för att stabilisera p53, det tumörsuppressor inaktiveras i mer än hälften av humana cancerformer [15]. CHD5 är närvarande vid en gen lokus (1p36.31) utgår i ca 35% av neuroblastom [16]. CHD5 ansågs tidigare vara specifikt uttrycks i nervsystemet, men dess roll i cancer i andra vävnader börjar dyka upp [17]. CHD5 genen fann signifikant bort i gliom [18]. Bortsett från gendeletion, kan CHD5 undertryckas genom andra mekanismer. I vissa fall av neuroblastom, det finns bevis för att CHD5 uttryck epigenetiskt trycks av promotor hypermethylation [19], även om denna observation inte bekräftades av en annan studie [20]. Nyligen har CHD5 promotorn befunnits vara metyleras i små delmängder av bröst (4,4%), kolon (10%), äggstocks (15%) och gliom (17%) tumörer [17, 20], vilket tyder på epigenetisk tysta CHD5 genom metylering kan spela en partiell roll i tumörbildning i dessa vävnader. Här visade det sig att, i motsats till andra typer av cancer som hittills rapporterats, CHD5 var ofta hypermethylated i magcancer (73% av tumörer och 100% cellinjer). Ektopisk uttryck CHD5 i gastric cancerceller ledde till en betydande tillväxthämning. Denna slående korrelation av den epigenetiska undertryckande av CHD5 och magcancer antyder en tidigare okänt samband mellan denna TSG och gastric tumörbildning.
Metoder
Vävnadskultur och RNA /DNA-extraktion
Alla gastric cancercellinjer (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 och NCI-N87) erhölls från Riken Gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japan) och American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alla cancercellinjer etablerades från karcinom av gastric epitelceller. Det inte särskilt anges, celler odlades i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C med 5% CO 2, och 95% luftfuktighet. För farmakologisk demetylering, behandlades celler med 5 | iM 5-aza-2'-deoxicytidin (Aza) (Sigma, St Louis, MO, USA) under tre på varandra följande dagar [21]. Aza var fyllas med 24 timmars mellanrum. En ekvivalent koncentration av fordonet (DMSO) användes som kontroll. För de primära vävnaderna, var de normala gastriska vävnader definieras som icke-inflammation och icke-tumörvävnader. Alla magcancer vävnader adenokarcinom vävnader. Totalt RNA och genomiskt DNA extraherades med användning av Trizol-reagens (Invitrogen) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
Kvantitativ realtids-RT-PCR
Omvänd transkriptionsreaktion utfördes med användning av en | j, g av totalt RNA med omvänd transkription System (Promega, Madison , WI, USA). De mRNA-expressionsnivåer av den CHD5 bestämdes genom kvantitativ realtids-RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Glyceraldehyd-3-phosohate dehydrogenas (GAPDH) användes som en intern kontroll av RNA integritet. Primers som används för CHD5 RT-PCR var CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC och CHD5-R. Metylering specifik PCR (MSP) 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
metylering status CHD5 bestämdes av MSP hjälp av bisulfat modifierad genomisk DNA som mall. Genomisk DNA bisulfit behandlats med Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) i enlighet med det protokoll som avses. MSP genomfördes under 40 cykler med annealing temperatur vid 62 ° C, såsom beskrivits tidigare [22]. Metylering specifika primrar var: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (från -525 till -506 i förhållande till transkriptionsstartplatsen) och CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (från -438 till -418), och unmethylation specifika primers var: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT och CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Alla primers bekräftades tidigare för att inte förstärka något unbisulfited DNA
bisulfit sekvensering (BGS) Review bisulfit-behandlade DNA förstärktes med hjälp av BGS primers, CHD5-BF. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (från -724 till -701) och CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (från -324 till -301). PCR-produkterna renades med Illustra GFX ™ PCR och gel band reningskit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) och klonades i pCR4-TOPO vektor för sekvensering (Invitrogen). Minst 6 kolonier slumpmässigt vald för plasmid extraktion och sekvenseringsanalys.
Konstruktion av CHD5 expressionsplasmider
CHD5 expressionsplasmid konstruerades genom kloning av fullängds-CHD5 öppna läsramen in i däggdjursuttrycksvektorn pcDNA3.1. Den CHD5 öppna läsramen amplifierades från normal mage cDNA med användning av high fidelity PFU DNA-polymeras (Invitrogen) och klonades in pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Efter sekvense validering ades insatsen subklonades i pcDNA3.1 med restriktionsenzymerna Hind III och Xba I.
kolonibildningsanalys
transfekterades transient AGS-celler med tom pcDNA3.1 eller pcDNA3.1-CHD5 användes för monoskikt kolonibildningsanalys. Cellerna odlades över natten i en 12-brunnsplatta (1,0 x 10 5 /brunn) och transfekterades med pcDNA3.1 eller CHD5-uttrycksvektorn med användning av lipofektamin ™ 2000 (Invitrogen). 48 timmar senare, transfektantema var åter på platta i tre exemplar och odlades under 10-15 dagar i komplett RPMI 1640-medium innehållande G418 (400 | ig /ml). Överlevande kolonier färgades med Gentian Violet efter metanolfixering och kolonier som överskrider viss storlek (≥ 50 celler) räknades. Experimenten upprepades tre gånger.
Resultat
Nedreglering av CHD5 expression i gastriska cancercellinjer
uttryck av CHD5 i gastriska cancercellinjer bestämdes genom kvantitativ RT-PCR. Medan CHD5 var mycket uttryckt i mag vävnader, dess uttryck var nedregleras i alla 7 gastric cancercellinjer (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 och NCI-N87 SNU1 och SNU16) (Fig. 1). Figur 1 CHD5 nedregleras i gastriska cancercellinjer. Uttrycket av CHD5 i gastriska cancercellinjer bestämdes genom RT-PCR. GAPDH användes för att normalisera CHD5 expression. Den normala mage vävnad (magen) användes som referens. Resultat av kvantitativ realtids-RT-PCR visades i övre panelen och resultatet av konventionell RT-PCR visades i nedre panelen.
Promoter hypermethylation av CHD5 i magcancer cellinjer och primära gastriska karcinomvävnader Review, en typisk CpG Island (CGI) konstaterades runt CHD5 exon 1 med hjälp av följande kriterier: GC innehåll > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65 och längd > 500 bp (Fig 2A.). Metylering status denna CGI i gastric cancerceller bestämdes genom metylering specifik PCR (MSP). Såsom visas i fig. 2B, var helt eller delvis metylering upptäckt i alla 7 gastric cancercellinjer vi granskat. I överensstämmer med uppgifterna om gastric cellinjer, var CHD5 promotorn även metyleras i de flesta primära magkarcinom testade vävnader (73%, 11/15) (Fig. 2C). Viktigt är metylering av CHD5 promotorn var antingen oupptäckt eller svagt detekterbar i normala vävnader intill tumörerna hos samma patienter och i mag vävnader hos friska försökspersoner. Dessutom har metylering av CHD5 promotor i gastric cancercellinjer och magcancer vävnader bekräftas av bisulfit sekvensering (BGS) (Fig. 2D). Tagna tillsammans, var CHD5 predominately tystas i gastrisk cancer och promotor hypermetylering verkade vara den huvudsakliga mekanismen för CHD5 tysta i tumörgenes av denna vävnad. Figur 2 CHD5 promotor hypermethylated i magcancer. A, CHD5 har en typisk CpG-ö (CGI) runt sin exon 1. CGI ritades av GeneTool program. Positionerna för BGS och MSP-primrar anges som pilar. B, Metyleringen status CHD5 promotor i gastriska cancerceller bestämdes genom metylering specifik PCR. M: metylering; U: unmethylation. C, Metyleringen status CHD5 promotorn i primära gastriska cancervävnader bestämdes genom metylering specifik PCR såsom i B. Normala gastriska vävnader och intilliggande icke-tumörvävnader användes som kontroller. N1 och N2 är normala mag vävnader. T1 och T2 indikerar magcancer vävnader medan A1 och A2 representerar angränsande icke-tumörvävnader. Representerade resultat visades. D, Metylering av CHD5 promotor i magcancer cellinjer och primära gastriska karcinomvävnader bekräftades av BGS. Varje cirkel visar en CpG plats och cirklar fyllda i svart representerar metylerad CpG platser. En rad av cirklar representerar en enda koloni.
Uppreglering av CHD5 uttryck efter Aza behandling
För att ytterligare bekräfta promotor CGI hypermethylation medierad CHD5 tysta i gastric cancercellinjer, CHD5 uttryck i AGS och Kato III före och efter demetylering reagens Aza behandling analyserades. Båda cellinjerna uppvisar fullständig metylering av CHD5 promotorn. CHD5 expression i dessa två cellinjer ökade signifikant efter Aza-inducerad demetylering av CHD5 promotorn (fig. 3A och 3B), vilket visar att CHD5 faktiskt epigenetiskt tystas i magcancer. Figur 3 Farmakologisk demetylering aktiverar CHD5 uttryck i gastric cancercellinjer. A, Relativa CHD5 uttryck före och efter Aza behandling bestämdes genom RT-PCR som i Fig. 1. GAPDH användes för att normalisera mall beloppet. B, Demetylering av CHD5 promotor i AGS celler efter Aza behandlingen bekräftades genom BGS som i Fig. 2D.
Tillväxthämmande funktion CHD5
tumörsupression egendom CHD5 i gastriska cancerceller undersöktes med en vinst-of-funktion strategi. Fullständig öppen läsram (ORF) av CHD5 klonades in i däggdjursuttrycksvektorn pcDNA3.1. Effekten av ektopisk CHD5 expression på tillväxten av gastriska cancerceller AGS bestämdes med monoskikt kolonibildningsanalys. Den påtvingade expression av CHD5 i AGS-celler bekräftades genom RT-PCR (Fig. 4A). Antalet kolonier som bildats på plattan av celler som överuttrycker CHD5 reducerades signifikant (p
< 0,01) (fig 4B och 4C.), Vilket indikerar att CHD5 kan undertrycka tillväxten av gastriska cancerceller. Figur 4 CHD5 inhiberar tillväxten av magcancer-cellinjen AGS. Effekten av ektopisk CHD5 uttryck på tumörcelltillväxt undersöktes genom monoskiktet kolonibildningsanalys. A, CHD5 expression i AGS-celler efter transfektion bestämdes genom RT-PCR. Fotografiet av kolonier bildade av AGS-celler transfekterade med pcDNA3.1 (vektor) eller pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) visades i B. C, kvantitativa analyser av koloniantal visas som värden av medelvärde ± standardavvikelsen. P
värden beräknades med användning t-test. Asterisken indikerar statistiskt signifikant skillnad (p Hotel < 0,01).
Diskussion
Under de senaste åren har många GTS befunnits vara epigenetiskt inaktiv i magcancer, vilket tyder på att epigenetiska tysta GTS är en stora molekylära förändringar i processen av gastric cancer [22-25]. I denna studie var CHD5 identifierats som en annan potentiell TSG vars epigenetiska inaktive kan bidra till gastric cancer. Det var ofta nedregleras genom promotor hypermethylation i gastric cancercellinjer. Den ektopiska uttrycket av CHD5 ledde till tillväxthämning av gastriska cancerceller, vilket tyder på att CHD5 fungerar som en TSG epigenetiskt tystas i magcancer.
Promoter hypermetylering av CHD5 i cancer har observerats i andra cancerformer [17, 20]. Emellertid var incidensen av CHD5 promotor metylering i magcancer cellinjer och tumörer i denna studie att vara relativt hög, jämfört med frekvensen av CHD5 metylering i andra cancerformer (i allmänhet under 20%) [17, 20]. Naturligtvis bör fler prover användas för att bekräfta detta resultat med samma MSP primers i följande studier. Ändå föreslår vår slutsats att CHD5 inaktive kan förmedlas av olika mekanismer i olika vävnader. Medan CHD5 inaktiveras genom kopietal abnormitet i olika typer av cancer [15, 16], jämförande genomisk hybridisering (CGH) indikerade att 1p36, den CHD5 innehållande genlocus, inte signifikant obalans i gastric cancer [26]. Istället, som visas i denna studie verkar CHD5 att tystas huvudsakligen av promotor hypermethylation i magcancer. Review Det finns växande bevis för att hypermetylering av TSG-promotorn utgör ett större molekylära förändringar i cancerutveckling. Den höga förekomsten av CHD5 promotor hypermethylation i magcancer kan utforskas inte bara som en gastric cancerdiagnos men också prognos förutsägelse. För detta ändamål är det viktigt att karakterisera CHD5 promotor metylering i samband med kliniska egenskaper, såsom ålder, kön, H. pylori-infektion, tumörgrad, Lauren klassificering och differentiering. Med tanke på att den höga heterogeniteten av primära gastriska karcinomvävnader, metylering analyser med högre upplösning, såsom kvantitativ metylering specifik analys med hjälp av Sequenom eller Taqman realtids-PCR kan vara till hjälp för att bedöma huruvida CHD5 promotor metylering är användbar för tidig magcancer upptäckt och prognos förutsägelse.
Även promotor metylering inaktiverar ofta CHD5 i gastric cancercellinjer, kan vi inte utesluta förekomsten av andra mekanismer för förlustfunktionen av CHD5 i magcancer. CHD5 uttryck är extremt låg i MKN28 och SNU16 (Fig. 1), dock promotorn för CHD5 var endast delvis metylerad i dessa två cellinjer (Fig. 2B), vilket indikerar att andra mekanismer kan vara ansvariga för att tysta CHD5 i vissa av gastric cancercellinjer.
Slutsats
CHD5 var ofta nedregleras genom promotor hypermethylation i gastric cancerceller. Den ektopiska uttrycket av CHD5 ledde till tillväxthämning av gastriska cancerceller, vilket tyder på att CHD5 fungerar som en tumörsuppressorgen epigenetiskt tystas i magcancer.
Förklaringar
Tack
Vi tackar Dr. Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Run Run Shaw sjukhus, Zhejiang University) för hans ovärderliga råd och teknisk support. Det arbete som beskrivs i detta dokument har delvis stöd av ett bidrag från rådets forskningsbidrag av den speciella administrativa regionen Hongkong, Kina (Projekt nr CityU 160.508).
Författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan är länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Författaroriginalfilen för figur 4 Konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.

• Den prognostiska effekter epidermal tillväxtfaktorreceptor hos patienter med magsäckscancer
• Laparoscopic justerbara bandad roux-en-y gastric bypass som en primär förfarande för super-super-feta (BMI > 60 kg /m2)