CHD5 van leszabályozott keresztül promoter hipermetiláció a gyomor cancer

CHD5 van leszabályozott keresztül promoter hipermetiláció gyomorrákban katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa Nonhistone kromoszómális fehérjékkel összehangoltan hisztonokra fontos szerepet játszanak a replikációt és a javító DNS és a génexpresszió szabályozásában. A dereguláció ezen fehérjék hozzájárulnak a különböző betegségek, mint a rák. Ennek nonhistone kromoszómális fehérje, chromodomain helikáz DNS-kötő fehérje 5 (CHD5) nemrégiben azonosították, mint a termék egy új tumor szupresszor gén (TSG), elősegítve a transzkripcióját p19 INK4a
és P16 ARF katalógusa. Inaktiválása CHD5 sikerült elérni részben a genetikai törlését, mivel ez található a 1p36, egy régió gyakran vágva a humán tumorokban. Ebben a vizsgálatban a célunk, hogy tanulmányozzuk a bevonása CHD5 gyomorrákban, a második leggyakoribb daganat világszerte. Katalógusa módszerek
CHD5 kifejezést a testület a gyomorrák sejtek esetében az kvantitatív RT-PCR. Metilezése CHD5 úgy értékeltük metiláció specifikus PCR és biszulfit genom szekvenciájának. A hatás a CHD5 a növekedésre gyomorrák-sejtek úgy vizsgáltuk telepképző assay.
Eredménye
CHD5 expressziót alulszabályozott minden gyomorrák használt sejtvonalak (100%, 7/7), és szignifikánsan után helyreáll farmakológiai demetilációt. Metilálása CHD5 promoter volt kimutatható minden hét gyomor rákos sejtvonal és a legtöbb primer gyomor karcinóma vizsgált szövetben (73%, 11/15). Végül, ectopiás expresszióját CHD5 gyomorrákban sejtek vezetett jelentős növekedés gátlást. Katalógusa Következtetés katalógusa CHD5 volt TSG epigenetikusan lefelé szabályozni a gyomorrák. Katalógusa Háttér Tanuld az összes eukarióta élőlények fejlődtek bonyolult módon a csomagolási DNS kromatin keresztül dinamikus kölcsönhatások különböző DNS-asszociált fehérjék. Az ilyen csomagolás nem csak az fontos, a tárolás, a genetikai információ nagy hűség és a tisztesség, hanem a genetikai információ átadását származó DNS RNS-egy szigorúan ellenőrzött módon. Fehérjék, amelyek kötődnek a DNS-hez alkotnak kromatin hagyományosan osztva két általános osztályokba: hisztonok és nonhistone kromoszomális fehérjéket. A hisztonok egy csoportja erősen konzervált DNS-kötő fehérjék és azok különböző poszttranszlációs módosítások képezi a "hiszton kód", hogy vezeti a csomagolás az DNS vagy kromatin átalakítás. A hiszton kód kezdeményezi, karbantartott és értelmezett nagyrészt nonhistone kromoszómális fehérjékkel [1-4]. Például az acetilezés a lizin maradékok hiszton farka hiszton-acetiltranszferáz (HAT) semlegesíti a töltésüket, és csökkenti az affinitása a hisztonok DNS-sel, így a DNS hozzáférhetővé transzkripciós faktorok, hogy kezdeményezzen gén transzkripciót. Fordítva, a dezacetilezési e maradványok által hiszton dezacetilázok (HDAC-k) visszaállítja ez az affinitás és visszavonja a DNS-transzkripciós mechanizmus [5]. Amellett, hogy acetiláció, foszforiláció és metilációs hiszton farkuk fontos a dinamikus társulásának DNS transzkripciós gépek és más kromoszómális fehérjékkel [6-8]. Nonhistone kromoszómális fehérjékkel fontos szerepet játszanak az értelmezése hiszton kód alkotó kromatin átalakítás komplexek. Mind a hisztonok és nonhistone kromoszómális proteinek fontos a génexpresszió szabályozásában, a DNS-replikáció és DNS-javítás. A deregulációs az expressziója és aktivitása ezen fehérjék vezethet a fejlesztés különböző betegségek, mint a rák [9-13].
Egy nemrégiben készült tanulmány, chromodomain helikáz DNS-kötő fehérje 5 (CHD5) azonosították, mint a újszerű tumor szupresszor gén (TSG) neuroblasztóma [14]. CHD5 tartozik szupercsaládjához SWI2 /SnF2 kapcsolatos ATP, egy nagy csoportja nonhistone kromoszómális fehérjékkel. CHD5 kódol egy egyedülálló kombinációja funkcionális domének, amely két N-terminális chromodomains, majd egy SWI2 /SnF2-szerű ATPáz /helikáz dómén és egy DNS-kötő domént [14]. Azzal, hogy szabályozza a kromatin struktúráját, CHD5 elősegítheti a kifejezés a p19 ARF, hogy a funkciók, hogy stabilizálja a p53, a tumor szupresszor inaktiválódik több mint fele a humán rákok [15]. CHD5 van jelen génlókusz (1p36.31) törölve mintegy 35% -a neuroblasztóma [16]. CHD5 korábban gondolták, hogy specifikusan expresszálódó az idegrendszerben, de a szerepe a rák más szövetekben kezd kialakulni. [17] CHD5 gént szignifikánsan törölni glioma [18]. Eltekintve a gén deléció, CHD5 elnyomható más mechanizmusok. Egyes esetekben a neuroblasztóma, vannak bizonyítékok, hogy a CHD5 expresszió epigenetikusan elnyomható promóter hipermetiláció [19], bár ez a megfigyelés nem erősítette meg egy másik tanulmányban [20]. Az utóbbi időben a CHD5 promotert Úgy találtuk, hogy metilezendő kis részhalmaza mell (4,4%), a vastagbél (10%), a petefészek (15%) és a glioma (17%) tumorok [17, 20], ami arra utal epigenetikus csendesítése CHD5 metilezést játszhat részleges szerepet tumorigenezisben ezekben a szövetekben. Itt azt találtuk, hogy, szemben a más típusú rák jelentett eddig CHD5 volt gyakran hipermetilációja gyomorrák (73% a tumorok és a 100% sejtvonalak). A méhen kívüli kifejezése CHD5 gyomorrákban sejtek vezetett jelentős növekedés gátlást. Ez a feltűnő korrelációja epigenetikus elnyomása CHD5 és gyomorrák javasol egy korábban ismeretlen összefüggés e TSG és gyomorrák tumorigenezis.
Methods
szövettenyészetben, és az RNS /DNS-extrakció
Minden gyomor rákos sejtvonalak (AGS, Kato III MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 és NCI-N87) szereztünk be a Riken Génbank (Tsukuba, Ibaraki, Japán) és az American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Minden rákos sejtvonalak alakultak karcinómákban gasztrikus epiteliális sejtek. Hacsak kifejezetten nem jelezzük, a sejteket RPMI 1640 tápközegben (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérumot, 37 ° C-on, 5% CO 2, és 95% -os páratartalom mellett. Farmakológiai demetilezési, sejteket kezeltünk 5 jiM 5-aza-2'-dezoxicitidin (AZA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) három egymást követő napon. [21] Aza-ben feltöltik 24 óránként. Egy ekvivalens koncentráció a jármű (DMSO) alkalmazunk kontrollként. Az elsődleges szövetek, a normál gyomor szöveteket definiált nem-gyulladás és a nem tumoros szövetekben. Minden gyomorrák szövetek adenocarcinoma szövetekben. A teljes RNS és genomikus DNS-t extraháltuk Trizol reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai.
Kvantitatív valós idejű RT-PCR
reverz transzkripciós reakciót végeztünk 1 ug össz-RNS-t reverz transzkripció rendszer (Promega, Madison , WI, USA). Az mRNS expressziós szintek a CHD5 határoztuk meg kvantitatív, valós idejű RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Gliceraldehid-3-phosohate dehidrogenáz (GAPDH) használtunk belső kontrollként az RNS integritását. Használt primereket CHD5 RT-PCR-rel CHD5-F 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC és CHD5-R: 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG.
Metiiációspecifikus PCR-t (MSP)
metiiációs státusának CHD5 határoztuk meg MSP segítségével biszulfát módosított genomiális DNS templátként. Genomiális DNS-t hidrogén-szulfit-kezelt Zymo DNS-módosító Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) protokoll szerint, feltéve. MSP végeztük 40 cikluson lágyítási hőmérséklet 62 ° C-, a korábban leírtak [22]. Metilezés-specifikus primerek a következők voltak: CHD5M-F 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (-tól -525 hogy -506 képest a transzkripciós starthelyet) és CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (-tól -438 hogy -418), és unmethylation-specifikus primerek a következők voltak: CHD5U-F 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT és CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Minden primereket megerősítette korábban nem erősítésére bármilyen unbisulfited DNS.
Bisulfite genom szekvenálása (BGS) hotelben Bisulfite kezelt DNS-t amplifikáljuk BGS alapozók, CHD5-BF: 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (-tól -724 hogy -701) és CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (-tól -324 hogy -301). A PCR-termékeket tisztítottuk Illustra GFX ™ PCR és gélen tisztítási kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Svédország), és beklónoztuk pCR4-TOPO vektorba szekvenálásra (Invitrogen). Legalább 6 telepeket véletlenszerűen választottuk plazmid extrakció és szekvenálási analízis.
Építése CHD5 expressziós plazmidok
A CHD5 expressziós plazmidot klónozásával a teljes hosszúságú CHD5 nyitott leolvasási keret emlős expressziós vektorba pcDNA3.1. A CHD5 nyitott leolvasási keret amplifikáltuk a normál gyomor cDNS nagy pontosságú Pfu DNS-polimeráz (Invitrogen), és beklónoztuk pcDNA-Topo4 (Invitrogen). Miután szekvenálás érvényesítés, az inszertet szubklónoztuk pcDNA3.1 a HindlII-mal és Xbal
telepképző assay
tranziensen transzfektált AGS sejtek üres pcDNA3.1 vagy pcDNA3.1-CHD5 használtak egyrétegű telepképző assay. A sejteket egy éjszakán át tenyésztettük egy 12 lyukú lemez (1,0 × 10 5 /lyuk), és transzfektált pcDNA3.1 vagy a CHD5-t expresszáló vektorral Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). 48 órával később, a transzfektánsokat újra szélesztjük három párhuzamosban tenyésztjük 10-15 napig komplett RPMI1640 tápközegben, amely G418-at (400 ng /ml). A túlélő telepeket megfestjük enciánkék után metanol fixálás és a telepeket meghaladó bizonyos méretet (≥ 50 sejt) megszámoltuk. A kísérleteket háromszor megismételtük.
Eredmények
down-regulációja CHD5 expresszió gyomor rákos sejtvonalakban
expresszióját CHD5 a gyomor rákos sejtvonalakban határoztuk meg kvantitatív RT-PCR-rel. Míg CHD5 ben erősen expresszálódik normális gyomor- szövetekben, a kifejezéseket alulszabályozott mind a 7 gyomor rákos sejtvonalak (AGS, Kato III MKN28, MKN45 és NCI-N87 SNU1 és SNU16) (ábra. 1). 1. ábra CHD5 van lefelé szabályozni a gyomor rákos sejtvonalak. A kifejezés a CHD5 a gyomor rákos sejtvonalakban határoztuk meg RT-PCR-rel. GAPDH használták, hogy normalizálja a CHD5 kifejezést. A normál gyomor szövet (gyomor) használtunk, mint a referencia. Eredményei kvantitatív real-time RT-PCR-t mutatja be a felső panel és az eredmény a hagyományos RT-PCR során kimutatták, alsó panel. Katalógusa Promoter hipermetiláció CHD5 gyomorrákban sejtvonalak és primer gyomor carcinoma szövetekben
Egy tipikus CpG-sziget (CGI) környékén találták CHD5 exon 1 a következő kritériumok alapján: GC hatóanyag-tartalma 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0.65, és a hossz > 500 bp (2A.). A metilációs állapotát a CGI gyomor rákos sejtekben határoztuk meg metiláció specifikus PCR (MSP). Ábrán látható. 2B, teljes vagy részleges metiláció kimutatható volt az összes 7 gyomor rákos sejtvonalak megvizsgáltuk. Az adatokkal összhangban a gyomor-sejtvonalak, a CHD5 promotert is metilezzük a legtöbb primer gyomor karcinóma vizsgált szövetben (73%, 11/15) (ábra. 2C). Fontos, metilezése a CHD5 promoter volt, vagy nem, vagy gyengén detektálható a normál szövetekben szomszédos a tumorok az azonos betegek és a gyomor szövetekben a normál alanyok. Sőt, metilezése CHD5 promoter gyomorrák sejtvonalakon és gyomorkarcinóma szövetekben igazoltuk biszulfit genom szekvenálása (BGS) (ábra. 2D). Mindent összevetve, CHD5 ben túlnyomórészt elhallgattatta a gyomorrák és promoter hipermetiláció úgy tűnt, hogy a fő mechanizmus a CHD5 hangtompító a tumorigenezisben ennek a szövetnek. 2. ábra CHD5 promoter hipermetiláltnak gyomorrák. A, CHD5 tipikus CpG-szigetre (CGI) körül exon 1 CGI-t ábrázoltuk GeneTool programot. A pozíciók BGS MSP primereket jelzett nyilak. B, A metilációs állapotát CHD5 promoter gyomor rákos sejtekben határoztuk meg metiláció specifikus PCR-rel. M: metiláció; U: unmethylation. C, A metilációs állapotát CHD5 promoter primer gyomorrák szövetekben határoztuk meg metiláció specifikus PCR, mint a B Normál gyomor szövetek és a szomszédos nem-daganatos szöveteket használtunk kontrollként. N1 és N2 normális gyomor- szövetekben. T1 és T2 jelzik gyomorkarcinóma szövetekben, miközben az A1 és A2 képviselik szomszédos, nem-tumor szövetekben. Képviselt eredményeket mutattak. D, metilálása CHD5 promoter gyomorrák sejtvonalakban és primer gyomor karcinóma szövetek igazoltuk BGS. Minden kör jelzi egy CpG hely és körök kitöltött fekete képviselik metilezett CpG helyek. Egy sor körök jelentése egyes kolónia.
Up-regulációját CHD5 expresszió után Aza kezelés
Annak további igazolására, a promoter CGI hipermetiláció-mediált CHD5 hangtompító a gyomor rákos sejtvonalban, a CHD5 kifejezések AGS és Kato III előtt és után demetilációja reagens Aza kezelés elemezték. Mindkét sejtvonal mutatnak teljes metilezésével a CHD5 promóter. CHD5 kifejezés ebben a két sejtvonalat jelentősen megnövekedett után Aza-indukált demetilezzük CHD5 promoter (ábra. A 3A és 3B ábrák), amelyek igazolják, hogy CHD5 valóban epigenetikusan némítják a gyomorrák. 3. ábra Farmakológiai demetilációja visszakapcsolja CHD5 kifejezés a gyomorrák sejtvonalakon. A, Relatív CHD5 kifejezések előtt és után Aza kezelés határoztuk meg RT-PCR, mint az ábrán látható. 1. GAPDH arra használták, hogy normalizálja a templát mennyisége. B, demetilezését CHD5 promoter AGS sejtekben után Aza kezelés megerősítette BGS mint látható. 2D.
Növekedést gátló funkciója CHD5 katalógusa tumorszupressziós tulajdonát CHD5 gyomorrákban sejtekben vizsgáltuk a nyereség-of-function stratégia. Teljes nyitott leolvasási keret (ORF) CHD5 kiónoztuk emlős expressziós vektorba pcDNA3.1. A hatás a ektopikus CHD5 expresszió növekedését gyomorrák sejtek AGS határoztuk meg egyrétegű telepképző assay. Az erőltetett expressziója CHD5 AGS sejtekben igazoltuk RT-PCR-rel (4A.). A telepek számát kialakítva a lemezen sejtek túl-expresszáló CHD5 szignifikánsan csökkent (p
< 0,01) (ábra. 4B és 4C), jelezve, hogy CHD5 elnyomhatja a növekedést a gyomor rákos sejteket. 4. ábra CHD5 gátolja a gyomorrák sejtvonal AGS. A hatás a méhen kívüli CHD5 kifejezés tumorsejt növekedés vizsgálta az egyrétegű telepképző assay. A, CHD5 expresszió AGS sejtekben a transzfekció után úgy határoztuk meg, RT-PCR-rel. A fénykép képződött telepek által AGS transzfektált sejtek pcDNA3.1 (vektor) vagy pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) volt látható a B. C, mennyiségi analízise kolónia számok jelennek értékek átlag ± standard deviáció. P
értékeket számoltunk Student-féle t-teszt. A csillag azt jelzi, statisztikailag szignifikáns különbséget (p
< 0,01).
Megbeszélés
Az elmúlt néhány évben számos HKT már megállapították, hogy epigenetikusan inaktivált a gyomorrák, jelezve, hogy epigenetikus csendesítése HKT egyik jelentős molekuláris változások a folyamat a gyomor karcinogenezis [22-25]. Ebben a vizsgálatban, CHD5 azonosították, mint egy másik potenciális TSG akinek epigenetikai inaktiválása hozzájárulhat a gyomor karcinogenezis. Ezt gyakran leszabályozott keresztül promoter hipermetiláció gyomorrákban sejtvonalak. Az ektopikus expressziója CHD5 vezetett a növekedés gátlását gyomorrák-sejtek, jelezve, hogy CHD5 működik, mint egy TSG epigenetikusan hangtompítós gyomorrákban.
Promoter hipermetiláció CHD5 rákos figyelték meg egyéb rákok [17, 20]. Azonban az előfordulási gyakorisága a CHD5 promoter metiláció a gyomorrák sejtvonalakon és tumorok találtak ebben a vizsgálatban, hogy viszonylag magas, összehasonlítva a gyakorisága CHD5 metilezés más rákos megbetegedések (általában 20% alatti) [17, 20]. Természetesen több mintát kell használni, hogy erősítse meg ezt az eredményt az azonos MSP láncindítók a következő vizsgálatokban. Mindazonáltal, a mi a felfedezés azt sugallja, hogy a CHD5 inaktiválás lehet által közvetített különböző mechanizmusok különböző szövetekben. Mivel CHD5 inaktiválódik keresztül kópiaszám rendellenesség különböző rákokban [15, 16], az összehasonlító genomiális hibridizáció (CGH) jelezte, hogy 1p36, a CHD5 tartalmazó génlókusz, szignifikánsan nem kiegyensúlyozatlan a gyomor rákos megbetegedések [26]. Ehelyett, ahogy ebben a tanulmányban, CHD5 tűnik hallgattatni túlnyomórészt a promoter hipermetiláció gyomorrákban.
Egyre több bizonyíték van, hogy hipermetiláció TSG promoter jelenti az egyik legfontosabb molekuláris változásokat a rák kialakulásához. A magas előfordulási CHD5 promoter hipermetiláció gyomorrákban lehet tárni nemcsak gyomorrák diagnózis, hanem prognózis előrejelzést. Ebből a célból fontos, hogy jellemezze a CHD5 promoter metiláció társítva klinikai jellemzőkkel, mint az életkor, a nem, a H. pylori fertőzés, tumor grade, Lauren osztályozás és differenciálódását. Tekintettel arra, hogy a nagy heterogenitása elsődleges gyomorrák szövetek metiláció elemzések nagyobb felbontású, mint a mennyiségi metiláció specifikus analízis Sequenom vagy Taqman valós idejű PCR hasznos lesz annak értékelésére, hogy CHD5 promoter metiláció hasznos korai gyomorrák kimutatására és a prognózis előrejelzést.
Bár promoter metiláció gyakran inaktiválja CHD5 gyomorrákban sejtvonalak, nem zárható ki a jelenlévő más mechanizmusok elvesztése funkciója CHD5 gyomorrákban. CHD5 kifejezés rendkívül alacsony MKN28 és SNU16 (ábra. 1), azonban a promoter CHD5 csak részben volt metilezett e két sejtvonal (ábra. 2B), jelezve, hogy más mechanizmusok felelős lehet a hangtompító a CHD5 néhány a gyomor rákos sejtvonalak. katalógusa Következtetés katalógusa CHD5 gyakran volt leszabályozott keresztül promoter hipermetiláció gyomorrákban sejtekben. Az ektopikus expressziója CHD5 vezetett növekedésgátlás a gyomor rákos sejtek, jelezve, hogy CHD5 működik, mint egy tumorszuppresszor gén epigenetikusan hangtompítós gyomorrákban.
Nyilatkozatokat
Köszönetnyilvánítás
Köszönjük Dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Run Run Shaw Kórház, Zhejiang University) az ő értékes tanácsokat és technikai támogatást. A munka jelen dokumentumban leírt részben támogatott a támogatás a kutatási pályázatok Tanács a Hongkong Különleges Közigazgatási Terület, Kína (Project No. CityU 160508). Katalógusa A szerzők eredeti beküldötteknek képeket
Lentebb linkek a szerzők eredeti beküldötteknek képeket. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg A szerzők eredeti fájlt az 1. ábra szerinti 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg A szerzők eredeti fájl 2. ábrán 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg A szerzők eredeti fájl 3. ábra 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg A szerzők eredeti fájl 4. ábra Érdekütközés
A szerzők kijelentik, hogy nincs versengő érdekek. katalógusa

• A prognosztikai hatását epidermális növekedési faktor receptor be metasztatikus gyomorrák
• A laparoszkópos állítható pántos Roux-Y gyomor bypass elsődleges eljárást a szuper-szuper-elhízott (testtömeg-index > 60 kg /m2)