CHD5 wird herunterreguliert durch Promotor-Hypermethylierung im Magen-cancer

CHD5 wird herunterreguliert durch Promotor-Hypermethylierung in Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Nonhistone chromosomale Proteine ​​zusammen mit Histonen spielen eine wichtige Rolle bei der Replikation und Reparatur von DNA und bei der Regulation der Genexpression. Die Deregulierung dieser Proteine ​​können zur Entwicklung einer Vielzahl von Krankheiten, wie Krebs beitragen. Als nonhistone Chromatinprotein hat Chromodomäne Helikase DNA-bindendes Protein 5 (CHD5) als das Produkt eines neuartigen Tumorsuppressorgen (TSG), die Förderung der Transkription von p19 INK4a
und p16 kürzlich identifiziert arf
. Die Inaktivierung von CHD5 wurde zum Teil durch genetische Deletion erreicht, da es in 1p36 befindet, eine Region, häufig in menschlichen Tumoren gelöscht. In dieser Studie wollen wir die Beteiligung von CHD5 bei Magenkrebs zu studieren, die zweithäufigste Krebsart weltweit.
Methoden
CHD5 Ausdruck in einem Panel von Magenkrebszellen durch quantitative RT-PCR bestimmt. Die Methylierung von CHD5 wurde durch methylierungsspezifische PCR und Bisulfit-Genom-Sequenzierung untersucht. Die Wirkung von CHD5 auf das Wachstum von Magenkrebszellen durch Koloniebildungstest getestet.
Ergebnisse
CHD5 Expression wurde in allen Magenkrebszelllinien verwendet,-down geregelt (100%, 7/7) und signifikant wiederhergestellt, nachdem pharmakologische Demethylierung. Methylierung von CHD5 Promotor wurde in allen sieben Magenkrebszelllinien und in der Mehrzahl der primären Magenkarzinom untersuchten Geweben (73%, 11/15) nachgewiesen. Schließlich zu einer signifikanten Hemmung des Wachstums führte die ektopische Expression von CHD5 in Magenkrebszellen.
Fazit
CHD5 war ein TSG epigenetisch herunterreguliert bei Magenkrebs.
Hintergrund
allen eukaryotischen Organismen haben aufwendige Weise entwickelt DNA in Chromatin durch die dynamischen Wechselwirkungen verschiedener DNA-assoziierten Proteine ​​des Verpackens. Eine solche Verpackung ist in einer streng kontrollierten Weise nicht nur wichtig für die Speicherung von genetischer Information mit hoher Genauigkeit und Integrität, sondern auch den Transfer von genetischer Information von der DNA zu RNA. Proteine, die an DNA binden Chromatin zu bilden, sind traditionell in zwei allgemeine Klassen unterteilt: Histone und nonhistone chromosomale Proteine. Histone sind eine Gruppe von hochkonservierten DNA-Bindungsproteine ​​und ihre verschiedenen posttranslationalen Modifikationen bilden die "Histon-Code", der die Verpackung von DNA oder Chromatin-Remodeling führt. Die Histon-Code initiiert wird, gehalten und interpretiert weitgehend durch nonhistone chromosomale Proteine ​​[1-4]. Zum Beispiel neutralisiert die Acetylierung von Lysinresten auf Histonschwänze von Histonacetyltransferasen (HATs) ihre Ladung und verringert die Affinität von Histonen mit DNA, DNA zugänglich für die Transkriptionsfaktoren machen Gen-Transkription zu initiieren. Im Gegensatz dazu, diese Affinität stellt die Deacetylierung dieser Rückstände von Histon-Deacetylasen (HDACs) und DNA von Transkriptionsmaschinerie zurückziehen kann [5]. Zusätzlich zur Acetylierung, Phosphorylierung und Methylierung von Histonen sind wichtig für die dynamische Assoziation von DNA mit Transkriptionsmaschinerie und andere chromosomale Proteine ​​[6-8]. Nonhistone chromosomale Proteine ​​spielen eine wichtige Rolle bei der Interpretation von Histon-Code von Chromatin-Remodeling-Komplexe bilden. Beide Histone und nonhistone chromosomale Proteine ​​sind wichtig für die Regulation der Genexpression, DNA-Replikation und DNA-Reparatur. Die Deregulation der Expression und Aktivität dieser Proteine ​​in der Entwicklung einer Vielzahl von Krankheiten, wie Krebs [9-13] führen könnte.
Wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie Chromodomäne Helicase DNA bindendes Protein 5 (CHD5) identifiziert als Roman Tumorsuppressorgen (TSG) in Neuroblastom [14]. CHD5 gehört zu einer Superfamilie von SWI2 /Snf2 bezogenen ATPase, eine wichtige Gruppe von nonhistone chromosomalen Proteinen. CHD5 kodiert, eine einzigartige Kombination von funktionellen Domänen, bestehend aus zwei N-terminalen Chromodomäne, gefolgt von einem SWI2 /SnF2 artigen ATPase /Helicase-Domäne und einer DNA-Bindungsdomäne [14]. Durch die Chromatinstruktur regulieren kann CHD5 die Expression von p19 fördern arf, dass die Funktionen von p53 zu stabilisieren, die Tumor-Suppressor in mehr als der Hälfte der menschlichen Krebserkrankungen inaktiviert [15]. CHD5 liegt an einem Gen-Locus (1p36.31) in etwa 35% des Neuroblastoms gelöscht [16]. CHD5 wurde bisher angenommen, spezifisch im Nervensystem exprimiert zu werden, aber seine Rolle in Krebs in anderen Geweben beginnt zu entstehen [17]. CHD5 Gen wurde deutlich gelöscht in Gliom [18] gefunden. Neben Gendeletion kann CHD5 durch andere Mechanismen unterdrückt werden. In einigen Fällen von Neuroblastom, gibt es Hinweise darauf, dass CHD5 Expression epigenetically von Promotor hypermethylation unterdrückt wird [19], obwohl diese Beobachtung nicht von einer anderen Studie [20] wurde bestätigt. Vor kurzem hat die CHD5 Promotor gefunden worden, in kleinen Teilmengen von Brust methyliert werden (4,4%), Kolon (10%), Eierstock- (15%) und Gliom (17%) Tumoren [17, 20], was darauf hindeutet epigenetische Silencing CHD5 durch Methylierung kann eine gewisse Rolle bei der Tumorentstehung in diesen Geweben spielen. Dabei fanden wir, dass, im Gegensatz zu anderen Krebsarten berichtet bisher CHD5 in Magenkrebs häufig hypermethylated war (73% der Tumoren und 100% Zelllinien). Die ektopische Expression von CHD5 in führte Magenkrebszellen zu einer signifikanten Hemmung des Wachstums. Diese auffällige Korrelation der epigenetischen Unterdrückung von CHD5 und Magenkrebs schlägt vor, eine bisher unbekannte Beziehung zwischen dieser TSG und Magen-tumorigenesis.
Methods
Magenkrebszelllinien (AGS, Kato Gewebekultur und RNA /DNA-Extraktion in alle länder III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 und NCI-N87) wurden von Riken Gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japan) und American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) erhalten. Alle Krebszelllinien wurden von Karzinomen von Magenepithelzellen etabliert. Wenn nicht speziell angegeben, kultivierten Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mit 10% fötalem Rinderserum bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Für pharmakologische Demethylierung wurden die Zellen mit 5 &mgr; M 5-Aza-2'-Desoxycytidin (Aza) (Sigma, St. Louis, MO, USA) für drei aufeinanderfolgenden Tagen behandelt [21]. Aza wurde alle 24 Stunden wieder aufgefüllt. Eine äquivalente Konzentration des Fahrzeugs (DMSO) wurde als Kontrolle verwendet. Für die Primärgewebe wurden die normalen Magen-Gewebe als nicht-Entzündung und Nicht-Tumorgewebe definiert. Alle Magenkarzinomgewebe sind Adenokarzinom Gewebe. Die Gesamt-RNA und genomische DNA wurde mit Trizolreagenz (Invitrogen) extrahiert gemäß den Anweisungen des Herstellers. Quantitative Echtzeit-RT-PCR Bei
Transkriptionsreaktion umkehren wurde unter Verwendung von 1 &mgr; g Gesamt-RNA mit Reverse Transkription-System (Promega, Madison , WI, USA). Die mRNA-Expression von der CHD5 wurden durch quantitative Echtzeit-RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) bestimmt. Glyceraldehyd-3-phosohate Dehydrogenase (GAPDH) wurde als interne Kontrolle der RNA-Integrität verwendet. Die verwendeten Primer für CHD5 RT-PCR waren CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC und CHD5-R:. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
Methylierungs spezifische PCR (MSP)
Methylierungsstatus von CHD5 von MSP mit Hydrogensulfat modifizierte genomische bestimmt wurde DNA als Matrize. Genomische DNA wurde mit Bisulfit-behandelter DNA Zymo Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) nach dem Protokoll vorgesehen. MSP wurde bei 62 ° C, für 40 Zyklen mit Glühtemperatur durchgeführt, wie zuvor beschrieben [22]. Methylierungsspezifische Primer waren: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (von -525 bis -506 relativ zur Transkriptionsstartstelle) und CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (von -438 bis -418) und unmethylation spezifische Primer waren: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT und CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Alle Primer wurden bisher bestätigt für keine unbisulfited Amplifikation von DNA
Bisulfit-Sequenzierung des Genoms (BGS)
Bisulfit-behandelte DNA wurde unter Verwendung von BGS-Primern amplifiziert, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (von -724 bis -701) und CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (von -324 bis -301). PCR-Produkte wurden mit Illustra GFX ™ PCR und Gel Band Purification Kit gereinigt (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Schweden) und kloniert in pCR4-TOPO-Vektor für die Sequenzierung (Invitrogen). Mindestens 6 Kolonien wurden zur Plasmid-Extraktion und Sequenzierungsanalyse zufällig ausgewählt.
Konstruktion von Expressionsplasmiden CHD5
Der CHD5 Expressionsplasmid durch Klonierung der full-length CHD5 offenen Leserahmen in Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3.1 konstruiert. Der CHD5 offene Leserahmen wurde von der normalen Magen-cDNA unter Verwendung von High-Fidelity-PFU-DNA-Polymerase (Invitrogen) und kloniert in pcDNA-TOPO4 (Invitrogen) verstärkt. Nach der Sequenzierung Validierung wurde das Insert in pcDNA3.1 mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I.
Koloniebildungstest für einschichtige
Transient transfizierte AGS Zellen mit leeren pcDNA3.1 oder pcDNA3.1-CHD5 wurden verwendet subkloniert Koloniebildungstest. Zellen wurden über Nacht in einer 12-Well-Platte kultiviert (1,0 × 10 5 /Vertiefung) und transfiziert mit pcDNA3.1 oder CHD5-exprimierenden Vektor unter Verwendung von Lipofectamin ™ 2000 (Invitrogen). 48 Stunden später wurden die Transfektanten erneut ausplattiert und in dreifacher Ausführung kultiviert 10-15 Tage in komplettem RPMI 1640-Medium, das G418 (400 ug /ml). Die überlebenden Kolonien wurden gefärbt mit Gentianaviolett nach Methanol Fixierung und Kolonien Überschreiten bestimmter Größe (≥ 50 Zellen) wurden gezählt. Die Experimente wurden dreimal wiederholt.
Ergebnisse | Down-Regulation der CHD5 Expression in Magenkrebs-Zelllinien
Die Expression von CHD5 in Linien Magenkrebszellen durch quantitative RT-PCR bestimmt. Während CHD5 hoch im normalen Magengewebe exprimiert wurde, wurden seine Ausdrücke in allen 7 Magenkrebszelllinien (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 und NCI-N87 SNU1 und SNU16) herunterreguliert (Abb. 1). Abbildung 1 CHD5 wird herunterreguliert bei Magenkrebs-Zelllinien. Die Expression von CHD5 in Magenkrebszelllinien wurde mittels RT-PCR bestimmt. GAPDH wurde verwendet, um die CHD5 Ausdruck zu normalisieren. Der normale Magengewebe (Magen) wurde als Referenz verwendet. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR in Echtzeit wurde in der oberen Platte und das Ergebnis der konventionellen RT-PCR wurde in unteren Platte.
Promoter Hypermethylierung von CHD5 bei Magenkrebs-Zelllinien und primären Magenkarzinom Gewebe
Eine typische gezeigt 55%, ObsCpG /ExpCpG >; GC-Gehalt >0,65 und die Länge > 500 bp (Fig. 2A): CpG-Insel (CGI) wurde um CHD5 Exon 1 anhand der folgenden Kriterien gefunden. Der Methylierungsstatus dieser CGI bei Magenkrebs-Zellen wurde durch Methylierung spezifischer PCR (MSP) bestimmt. Wie in gezeigt. 2B, vollständige oder teilweise Methylierung wurde in allen sieben Magenkrebszelllinien entdeckten wir untersucht. In Übereinstimmung mit den Daten über Magenzelllinien wurde die CHD5 Promotor auch in der Mehrzahl der primären Magenkarzinom getesteten Geweben (73%, 11/15) (Fig. 2C) methyliert. Wichtig war, Methylierung des CHD5 Promotor entweder unerkannten oder nur schwach nachweisbar in normalen Geweben benachbart zu den Tumoren des gleichen Patienten und in Magengewebe von gesunden Personen. Außerdem Methylierung von CHD5 Promotor bei Magenkrebs-Zelllinien und Magenkarzinom Gewebe wurde durch Bisulfit-Sequenzierung des Genoms (BGS) bestätigt (Abb. 2D). Zusammengenommen wurde CHD5 vorwiegend im Magen-Krebs zum Schweigen gebracht und Promotor-Hypermethylierung erschien der Hauptmechanismus der CHD5 Silencing in tumorigenesis dieses Gewebes zu sein. Abbildung 2 CHD5 Promotor wird in Magenkrebs hypermethyliert. A, hat CHD5 eine typische CpG-Insel (CGI) um seine Exon 1. CGI wurde von GeneTool Programm aufgetragen. Die Positionen von BGS und MSP-Primer wurden als Pfeile angedeutet ist. B, der Methylierungsstatus des CHD5 Promoter bei Magenkrebs-Zellen wurde durch Methylierung spezifischer PCR bestimmt. M: Methylierung; U: unmethylation. C, der Methylierungsstatus von CHD5 Promotors in primären Geweben Magenkrebs wurde durch methylierungsspezifische PCR wie in B. Normalmagengewebe und angrenzenden Nicht-Tumorgewebe wurden als Kontrollen verwendet, bestimmt. N1 und N2 sind normale Magengewebe. T1 und T2 zeigen an Magenkarzinom Gewebe während A1 und A2 angrenzenden Nicht-Tumorgeweben darstellen. Vertreten Ergebnisse wurden gezeigt. D, Methylierung von CHD5 Promotor bei Magenkrebs-Zelllinien und primären Magenkarzinom Gewebe wurde von BGS bestätigt. Jeder Kreis zeigt eine CpG-und in den schwarz ausgefüllten Kreise stellen CpG methyliert. Eine Reihe von Kreisen stellt eine einzelne Kolonie.
Hochregulation von CHD5 Expression nach Aza Behandlung
weiter an den Promotor CGI-Hyper-vermittelte CHD5 Silencing bei Magenkrebs-Zelllinien, CHD5 Ausdrücke in AGS und Kato III bestätigen vor und nach Demethylierungsmittel wurden Aza Behandlung analysiert. Beide Zelllinien zeigen vollständige Methylierung des CHD5 Promotors. CHD5 Expression in diesen zwei Zelllinien wurden nach der Aza-induzierte Demethylierung von CHD5 Promotors (Fig. 3A und 3B) deutlich erhöht, was zeigt, dass tatsächlich CHD5 epigenetically in Magenkrebs verstummt. Abbildung 3 Pharmakologische Demethylierung reaktiviert CHD5 Expression in Magenkrebs-Zelllinien. A, Relative CHD5 Ausdrücke vor und nach der Aza-Behandlung wurden durch RT-PCR, wie in Fig bestimmt. 1. GAPDH wurde verwendet, um die Vorlage Menge zu normalisieren. B, Demethylierung von CHD5 Promotor in AGS-Zellen nach der Aza-Behandlung wurde wie in Fig von BGS bestätigt. 2D.
Wachstum hemmende Funktion von CHD5
Die Tumorunterdrückungseigenschaft CHD5 bei Magenkrebs-Zellen wurde durch einen Gewinn-of-function-Strategie untersucht. Vollständige offene Leserahmen (ORF) von CHD5 wurde in Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3.1 einkloniert. Die Wirkung der ektopischen Expression CHD5 auf das Wachstum von Magenkrebszellen AGS wurde mit einschichtigen Koloniebildungstest bestimmt. Die erzwungene Expression von CHD5 in AGS-Zellen wurde durch RT-PCR (Fig. 4A) bestätigt. Die Anzahl der Kolonien auf der Platte, gebildet durch Zellen überexprimieren CHD5 wurde signifikant verringert (p
< 0,01) (Fig 4B und 4C.), Was darauf hinweist, dass CHD5 das Wachstum von Magenkrebszellen unterdrücken kann. Abbildung 4 CHD5 hemmt das Wachstum von Magenkrebs-Zelllinie AGS. Die Wirkung von ektopischen CHD5 Expression auf Tumorzellwachstum wurde von der einschichtigen Koloniebildungstest untersucht. A, CHD5 Expression in AGS-Zellen nach der Transfektion wurde durch RT-PCR bestimmt. Die Fotografie von Kolonien, die von AGS-Zellen transfiziert mit pcDNA3.1 (Vektor) oder pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) wurde in B. C, Quantitative Analysen der Koloniezahlen sind gezeigt als Werte der Mittelwert ± Standardabweichung gezeigt gebildet. P
Werte wurden mit Student-t-Test berechnet. Der Stern zeigt statistisch signifikante Differenz (p
< 0,01).
Diskussion
In den vergangenen Jahren haben viele gtS gefunden worden epigenetisch inaktiviert bei Magenkrebs zu sein, was darauf hinweist, dass epigenetische Silencing gtS ist ein der wichtigsten molekularen Veränderungen im Prozess der Magen Karzinogenese [22-25]. In dieser Studie wurde CHD5 als ein anderes Potential TSG deren epigenetische Inaktivierung identifiziert magen Karzinogenese beitragen. Es wurde häufig in Magenkrebs-Zelllinien durch Promotor-Hypermethylierung herunterreguliert. Die ektopische Expression von CHD5 führte zur Wachstumshemmung von Magenkrebszellen, was darauf hinweist, dass CHD5 fungiert als TSG epigenetically in Magenkrebs Schweigen gebracht.
Promoter hypermethylation of CHD5 in Krebs in anderen Krebsarten beobachtet worden [17, 20]. Jedoch wurde das Auftreten von CHD5 Promotormethylierung in Magenkrebszelllinien und Tumoren in dieser Studie relativ hoch, verglichen mit der Frequenz von CHD5 Methylierung in anderen Krebsarten (in der Regel unter 20%) [17, 20]. Natürlich sollten mehrere Proben verwendet werden, um dieses Ergebnis mit den gleichen Primern MSP in den folgenden Studien bestätigen. Dennoch schlägt unsere Feststellung, daß CHD5 Inaktivierung könnte durch verschiedene Mechanismen in verschiedenen Geweben vermittelt werden. Während CHD5 durch Kopienzahl Anomalie bei verschiedenen Krebsarten inaktiviert wird [15, 16], angegeben vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), dass 1p36, die CHD5 haltigen Locus Gen ist nicht signifikant in Magenkrebs unausgewogen [26]. Stattdessen wird, wie in dieser Studie gezeigt, erscheint CHD5 überwiegend bei Magenkrebs durch Promotor-Hypermethylierung zum Schweigen gebracht werden.
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Hypermethylierung von TSG-Promotor eines der wichtigsten molekularen Veränderungen in der Entwicklung von Krebs darstellt. Die hohe Inzidenz von CHD5 Promotor-Hypermethylierung in Magenkrebs kann nicht nur als Magenkrebs Diagnose untersucht werden, sondern auch Vorhersage Prognose. Zu diesem Zweck ist es wichtig, die CHD5 Promotor-Methylierung in Verbindung mit klinischen Merkmalen, wie Alter, Geschlecht, H. pylori-Infektion, Tumorgrad, Lauren Klassifizierung und Unterscheidung zu charakterisieren. Da die hohe Heterogenität der primären Magenkarzinom Gewebe, Methylierung mit höherer Auflösung analysiert wie quantitative methylierungsspezifische Analyse unter Verwendung von Sequenom oder TaqMan real-time PCR wird hilfreich sein, zu beurteilen, ob CHD5-Promotor-Methylierung für Magenfrühkarzinomen Erkennung und Prognose Vorhersage nützlich ist.
Obwohl häufig Promotor-Methylierung CHD5 bei Magenkrebs-Zelllinien inaktiviert, können wir nicht die Anwesenheit anderer Mechanismen für die Verlustfunktion von CHD5 bei Magenkrebs auszuschließen. CHD5 Expression ist extrem niedrig in MKN28 und SNU16 (Fig. 1), der Promotor des CHD5 jedoch nur in diesen beiden Zellinien partiell methylierten war (Fig. 2B), was darauf hinweist, dass andere Mechanismen für die Silencing CHD5 in einigen verantwortlich sein können bei Magenkrebszellen von Magenkrebs-Zelllinien.
Fazit
CHD5 war häufig durch Promotor-Hypermethylierung herunterreguliert. Die ektopische Expression von CHD5 führte zur Hemmung des Wachstums von Magenkrebszellen, was darauf hinweist, dass CHD5 Funktionen als Tumor-Suppressor-Gen epigenetisch bei Magenkrebs zum Schweigen gebracht.
Erklärungen
Danksagung
Wir danken Dr. Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University) für seine wertvolle Ratschläge und technische Unterstützung. Die Arbeiten in diesem Papier beschrieben wurde durch einen Zuschuss aus dem Forschungsstipendien Rat der Hong Kong Special Administrative Region, China (Projekt Nr CityU 160508).
Autoren Original vorgelegt Dateien für Bilder teilweise unterstützt
Unten sind die Links zu den Original eingereichten Dateien für Bilder der Autoren. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Autoren Originaldatei für Abbildung 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Authors 'Original-Datei für 4 Konkurrierende Interessen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

• Die prognostische Bedeutung der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor in Patienten mit metastasierendem Magenkrebs
• Die laparoskopische verstellbare gebändert Roux-en-Y-Magenbypass als primäres Verfahren für die super-super-fettleibig (Body-Mass-Index > 60 kg /m2)