CHD5 is down-gereguleerd door de promotor hypermethylatie in de maag cancer

CHD5 is down-gereguleerd door de promotor hypermethylatie bij maagkanker
Abstracte achtergrond
Nonhistone chromosomale eiwitten in overleg met histonen spelen een belangrijke rol in de replicatie en reparatie van DNA en in de regulatie van genexpressie. De deregulering van deze eiwitten kan bijdragen aan de ontwikkeling van een verscheidenheid van ziekten zoals kanker. Als nonhistone chromosomaal eiwit heeft chromodomain helicase DNA-bindend eiwit 5 (CHD5) heeft onlangs geïdentificeerd als het product van een nieuw tumor suppressor gen (GTS), het bevorderen van de transcriptie van p19 Ink4a Kopen en p16 arf
. De inactivatie van CHD5 werd bereikt mede door middel van genetische schrappen omdat het is gelegen in 1p36, een regio vaak verwijderd in menselijke tumoren. In deze studie willen we de betrokkenheid van CHD5 bij maagkanker, de tweede meest voorkomende kanker wereldwijd te bestuderen.
Methods
CHD5 expressie in een panel van maagkanker cellen werden bepaald door kwantitatieve RT-PCR. De methylering van CHD5 werd geëvalueerd door methylatie specifieke PCR en bisulfiet genoom. Het effect van CHD5 op de groei van maagkanker cellen werd getest door kolonievorming assay.
Resultaten
CHD5 expressie down-gereguleerd in alle maagkanker cellijnen (100%, 7/7) en significant hersteld na farmacologische demethylering. Methylering van CHD5 promoter werd gedetecteerd in alle zeven maagkanker cellijnen en in de meeste primaire maagcarcinoom onderzochte weefsels (73%, 11/15). Tot slot, ectopische expressie van CHD5 bij maagkanker cellen geleid tot een aanzienlijke groeiremming.
Conclusie
CHD5 was een TSG epigenetisch down-gereguleerd bij maagkanker. Achtergrond
Alle eukaryote organismen ingewikkelde manieren ontwikkeld verpakking DNA in chromatine met de dynamische interactie van verschillende DNA-geassocieerde eiwitten. Dergelijke verpakking is niet alleen van belang voor de opslag van genetische informatie met hoge betrouwbaarheid en integriteit, maar ook de overdracht van genetische informatie van DNA naar RNA in een goed gecontroleerde manier. Eiwitten die binden aan DNA om chromatine worden traditioneel onderverdeeld in twee algemene klassen: histonen en nonhistone chromosomale eiwitten. Histonen zijn een groep van zeer geconserveerde DNA bindingseiwitten en hun verschillende posttranslationele modificaties vormen de "histoncode" uit de verpakking van DNA of chromatine hermodellering begeleidt. De histone code wordt geïnitieerd, onderhouden en geïnterpreteerd grotendeels door nonhistone chromosomale eiwitten [1-4]. Bijvoorbeeld, de acetylering van lysineresidu op histone staarten van histon-acetyltransferase (HAT) neutraliseert hun lading en vermindert de affiniteit van histonen met DNA, waardoor DNA toegankelijk voor de transcriptionele factoren om gentranscriptie te initiëren. Omgekeerd, de deacetylering van deze residuen op histon deacetylase (HDAC) herstelt deze affiniteit en kan DNA onttrekken transcriptieapparaat [5]. Naast acetylering, fosforylering en methylering van histon staarten zijn belangrijk voor de dynamische associatie van DNA met transcriptionele machines en andere chromosomale eiwitten [6-8]. Nonhistone chromosomale eiwitten spelen een belangrijke rol bij de interpretatie van histone code door het vormen van chromatine remodeling complexen. Zowel histonen en nonhistone chromosomale eiwitten zijn belangrijk voor de regulatie van genexpressie, DNA replicatie en DNA herstel. De deregulering van de expressie en activiteit van deze eiwitten kan leiden tot de ontwikkeling van een verscheidenheid van ziekten zoals kanker [9-13].
In een recente studie, chromodomain helicase DNA bindingseiwit 5 (CHD5) werd geïdentificeerd als nieuwe tumor suppressor gen (GTS) in neuroblastoom [14]. CHD5 behoort tot een superfamilie van SWI2 /SNF2-gerelateerde ATPasen, een belangrijke groep nonhistone chromosomale eiwitten. CHD5 codeert voor een unieke combinatie van functionele domeinen uit twee N-terminale chromodomains, gevolgd door een SWI2 /SNF2-achtige ATPase /helicase domein en een DNA bindend domein [14]. Door het regelen chromatinestructuur, kan CHD5 de expressie van p19 bevorderen arf die functies p53 het tumor suppressor geïnactiveerd in meer dan de helft van de menselijke kankers [15] stabiliseren. CHD5 aanwezig is in een gen locus (1p36.31) geschrapt in ongeveer 35% van neuroblastoom [16]. CHD5 werd eerder gedacht dat specifiek tot expressie gebracht in het zenuwstelsel, maar de rol bij kanker in andere weefsels begint te ontstaan ​​[17]. CHD5 gen werd gevonden significant verwijderd in glioma [18]. Naast gendeletie kan CHD5 worden onderdrukt door andere mechanismen. In sommige gevallen van neuroblastoom, zijn er aanwijzingen dat CHD5 expressie epigenetisch promoter onderdrukt door hypermethylering [19], hoewel deze waarneming niet werd bevestigd door een ander onderzoek [20]. Onlangs heeft de CHD5 promoter bleek te zijn gemethyleerd in kleine subsets van de borst (4,4%), colon (10%), eierstokkanker (15%) en glioma (17%) tumoren [17, 20], wat suggereert epigenetische inactivatie van CHD5 door methylatie kan een gedeeltelijke rol in tumorvorming in deze weefsels. Hier hebben wij, in tegenstelling tot andere kankersoorten tot dusverre gerapporteerd CHD5 was vaak hypermethylated bij maagkanker (73% van de tumoren en 100% cellijnen). De ectopische expressie van CHD5 bij maagkanker cellen tot een significante groeiremming. Deze opvallende correlatie van de epigenetische onderdrukking van CHD5 en maagkanker suggereert een voorheen onbekende relatie tussen deze TSG en de maag het ontstaan ​​van tumoren.
Methods
Weefselkweek en RNA /DNA-extractie Leer Alle maagkanker cellijnen (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 en NCI-N87) werden verkregen bij Riken Gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japan) en de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle kanker cellijnen werden gevestigd uit carcinomen van de maag epitheelcellen. Tenzij specifiek aangegeven, cellen werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 ° C met 5% CO 2, en 95% vochtigheid. Farmacologische demethylering, werden de cellen behandeld met 5 uM 5-aza-2'-deoxycytidine (Aza) (Sigma, St Louis, MO, USA) gedurende drie opeenvolgende dagen [21]. Aza werd elke 24 uur ververst. Het equivalent daarvan van de drager (DMSO) werd als controle gebruikt. Voor de primaire weefsels werden de normale gastrische weefsels gedefinieerd als niet-ontsteking en niet-tumorweefsels. Alle maagcarcinoom weefsels adenocarcinoom weefsels. Totaal RNA en genomisch DNA werd geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant.
Kwantitatieve real time RT-PCR
omgekeerde transcriptiereactie werd uitgevoerd met 1 pg totaal RNA met omgekeerde transcriptiesysteem (Promega, Madison , WI, USA). Het mRNA expressieniveaus van de CHD5 werden bepaald door kwantitatieve real-time RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Glyceraldehyde-3-phosohate dehydrogenase (GAPDH) als een interne controle RNA integriteit. Primers gebruikt voor CHD5 RT-PCR waren CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC en CHD5-R:. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
methylatie specifieke PCR (MSP)
Methylering status van CHD5 werd bepaald door het gebruik van MSP bisulfaat gewijzigd genomische DNA als de matrijs. Genomisch DNA werd bisulfiet behandeld met Zymo DNA Modificatie Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) volgens het protocol verschaft. MSP werd uitgevoerd gedurende 40 cycli met hybridisatietemperatuur uitgevoerd bij 62 ° C, zoals eerder beschreven [22]. Methylatie-specifieke primers waren: CHD5M-F: 5'- GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (van -525 tot -506 ten opzichte van de transcriptie- startsite) en CHD5M-R: 5'- GAAACTTAACGAACCCGAACG (van -438 tot -418) en unmethylation specifieke primers waren: CHD5U-F: 5'- GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT en CHD5U-R: 5'- TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Alle primers werden eerder bevestigd voor het niet het versterken van elke unbisulfited DNA
bisulfiet genome sequencing (BGS)
bisulfiet behandeld DNA werd versterkt met behulp van BGS primers, CHD5-BF. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (van -724 tot -701) en CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (van -324 tot -301). PCR producten werden gezuiverd met Illustra GFX ™ PCR en gel band zuiveringskit (GE Healthcare life science, Uppsala, Zweden) en gekloneerd in pCR4-TOPO vector voor sequentiebepaling (Invitrogen). Tenminste 6 kolonies werden willekeurig gekozen plasmide extractie en sequentieanalyse.
CHD5 Constructie van expressieplasmiden Ondernemingen De CHD5 expressieplasmide werd geconstrueerd door klonering van het volledige lengte CHD5 open leesraam in zoogdierlijke expressievector pcDNA3.1. De CHD5 open afleesraam werd geamplificeerd van de normale maag cDNA met behulp van high fidelity PFU DNA polymerase (Invitrogen) en gekloond in pcDNA-Topo4 (Invitrogen). Na sequencing validatie werd de insert gesubkloneerd in pcDNA3.1 met de restrictie-enzymen Hind III en Xba I.
Kolonie vorming assay
transient getransfecteerd AGS cellen met lege pcDNA3.1 of pcDNA3.1-CHD5 werden gebruikt voor monolaag kolonievorming assay. Cellen werden 's nachts gekweekt in een 12-well plaat (1,0 x 10 5 /putje) en getransfecteerd met pcDNA3.1 of-CHD5 expressie vector met gebruik van Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). 48 uur later, de transfectanten werden opnieuw uitgeplaat in drievoud en gedurende 10-15 dagen in compleet RPMI 1640 medium dat G418 (400 ug /ml). Overlevende kolonies werden gekleurd met Gentiaan Violet na methanol fixatie en kolonies boven een bepaalde grootte (≥ 50 cellen) werden geteld. De experimenten werden driemaal herhaald.
Resultaten
down-regulatie van expressie in CHD5 maagkanker cellijnen Ondernemingen De expressie van CHD5 bij maagkanker cellijnen werd bepaald door kwantitatieve RT-PCR. Terwijl CHD5 werd sterk tot expressie gebracht in normale gastrische weefsels werden de uitdrukkingen downgereguleerd in alle 7 maagkanker cellijnen (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 en NCI-N87 SNU1 en SNU16) (Fig. 1). Figuur 1 CHD5 is down-gereguleerd bij maagkanker cellijnen. De expressie van CHD5 bij maagkanker cellijnen werd bepaald door RT-PCR. GAPDH werd gebruikt om de expressie CHD5 normaliseren. De normale weefsel maag (maag) werd gebruikt als referentie. De resultaten van kwantitatieve real-time RT-PCR werd getoond in bovenste paneel en het resultaat van de conventionele RT-PCR werd getoond in onderste paneel.
Promotor hypermethylatie van CHD5 bij maagkanker cellijnen en primaire maagcarcinoom weefsels
Een typische CpG Island (CGI) werd gevonden in de buurt CHD5 exon 1 hand van de volgende criteria: GC inhoud > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, en de lengte > 500 bp (figuur 2A.). De methyleringsstatus van de CGI bij maagkanker cellen werd bepaald door methylatie specifieke PCR (MSP). Zoals getoond in Fig. 2B, volledige of gedeeltelijke methylering werd gedetecteerd in alle 7 maagkanker cellijnen we onderzocht. In overeenstemming met de gegevens op gastrische cellijnen, werd de promotor CHD5 ook gemethyleerd in de meeste primaire maagcarcinoom weefsels getest (73%, 11/15) (Fig. 2C). Belangrijk, methylering van de CHD5 promoter ofwel ongemerkt of zwak detecteerbaar in normale weefsels grenzend aan de tumors van dezelfde patiënten en gastrische weefsels van normale patiënten. Bovendien methylering van CHD5 promotor bij maagkanker cellijnen en maagcarcinoom weefsels werd bevestigd door bisulfiet genoom (BGS) (Fig. 2D). Bij elkaar genomen, werd CHD5 voornamelijk het zwijgen opgelegd bij maagkanker en promotor hypermethylatie bleek de belangrijkste mechanisme van CHD5 zwijgen in het ontstaan ​​van tumoren van dit weefsel zijn. Figuur 2 CHD5 promotor gehypermethyleerd bij maagkanker. A, CHD5 heeft een typisch CpG eiland (CGI) rond zijn exon 1. CGI werd uitgezet door GeneTool programma. De posities van BGS en MSP primers werden aangeduid met pijlen. B, de methylatiestatus van CHD5 promotor bij maagkanker cellen werd bepaald door methylatie specifieke PCR. M: methylering; U: unmethylation. C, de methylatiestatus van CHD5 promoter in primaire maagkanker weefsels werd bepaald door methylatie specifieke PCR zoals in B. Normale gastrische weefsels en naburige niet-tumorweefsels werden gebruikt als controles. N1 en N2 zijn normale gastrische weefsels. T1 en T2 geven maagcarcinoom weefsels terwijl A1 en A2 vertegenwoordigen naburige niet-tumorweefsels. Vertegenwoordigd resultaten werden getoond. D, Methylering van CHD5 promotor bij maagkanker cellijnen en primaire maagcarcinoom weefsels werd bevestigd door BGS. Elke cirkel geeft een CpG plaats en cirkels ingevuld zwarte vertegenwoordigen gemethyleerd CpG sites. Een rij van cirkels vertegenwoordigt een enkele kolonie.
Up-regulatie van CHD5 expressie na Aza behandeling Belgique Om de promotor CGI-hypermethylering gemedieerde CHD5 silencing bij maagkanker cellijnen verder te bevestigen, CHD5 uitdrukkingen in AGS en Kato III vóór en na demethylering reagens Aza behandeling geanalyseerd. Beide cellijnen vertonen volledige methylering van de CHD5 promoter. CHD5 expressie in deze twee cellijnen waren significant verhoogd na Aza-geïnduceerde demethylering van CHD5 promoter (Fig. 3A en 3B), waaruit blijkt dat CHD5 inderdaad epigenetisch zwijgen bij maagkanker. Figuur 3 Farmacologische demethylering reactiveert CHD5 expressie bij maagkanker cellijnen. Een Relative CHD5 uitdrukkingen voor en na Aza behandeling werden bepaald met RT-PCR zoals in Fig. 1. GAPDH werd gebruikt om de hoeveelheid template normaliseren. B, demethylering van CHD5 promoter in AGS Aza cellen na behandeling werd bevestigd door BGS zoals in Fig. 2D.
Groei remmende functie van CHD5
tumor suppressor eigenschap CHD5 bij maagkanker cellen werd onderzocht door een gain-of-function strategie. Volledige open leesraam (ORF) van CHD5 werd gekloneerd in zoogdierlijke expressievector pcDNA3.1. Het effect van ectopische CHD5 expressie op de groei van maagkanker cellen AGS werd bepaald monolaag kolonievorming assay. De geforceerde expressie van CHD5 in AGS cellen werd bevestigd door RT-PCR (Fig. 4A). Het aantal gevormde koloniën op de plaat door cellen overexpressie CHD5 werd significant verlaagd (p
< 0,01) (Figuur 4B en 4C.), Wat aangeeft dat CHD5 de groei van maag-kankercellen kan onderdrukken. Figuur 4 CHD5 remt de groei van maagkanker cellijn AGS. Het effect van ectopische expressie CHD5 op tumorcelgroei werd onderzocht door de monolayer assay kolonievorming. A, CHD5 AGS expressie in cellen na transfectie werd bepaald door RT-PCR. De foto van kolonies gevormd door AGS cellen getransfecteerd met pcDNA3.1 (vector) of pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) werd getoond in B. C, kwantitatieve analyses van kolonie getallen zijn weergegeven als gemiddelde waarden ± standaardafwijking. P
waarden werden berekend onder toepassing van t-test van Student. De asterisk geeft statistisch significant verschil (p Restaurant < 0,01).
Discussie
In de afgelopen jaren zijn veel GTS gevonden epigenetisch geïnactiveerd bij maagkanker te zijn, wat aangeeft dat epigenetische silencing van GTS is een grote moleculaire veranderingen in het proces van maagkanker [22-25]. In deze studie werd CHD5 geïdentificeerd als een potentiële TSG waarvan epigenetische inactivatie kan bijdragen aan maagkanker. Het werd vaak down-gereguleerd door de promotor hypermethylatie bij maagkanker cellijnen. De ectopische expressie van CHD5 tot de groeiremming van maagkanker cellen, wat aangeeft dat CHD5 functioneert als een TSG epigenetisch zwijgen bij maagkanker.
Promotor hypermethylatie van CHD5 bij kanker is waargenomen bij andere vormen van kanker [17, 20]. De incidentie van CHD5 promoter methylering bij maagkanker cellijnen en tumoren gevonden in deze studie relatief hoog is, vergeleken met de frequentie van methylering CHD5 andere kankers (gewoonlijk onder 20%) [17, 20]. Natuurlijk zou meer monsters gebruikt om dit resultaat met dezelfde MSP primers in de volgende studies bevestigen. Niettemin onze bevinding suggereert dat CHD5 inactivering kan worden gemedieerd door verschillende mechanismen in verschillende weefsels. CHD5 dat is geïnactiveerd door middel kopieaantal abnormaliteit bij verschillende kankersoorten [15, 16], vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) gaf aan dat 1p36, het CHD5 bevattende locus niet significant onevenwichtig maagkanker [26]. In plaats daarvan, zoals in dit onderzoek, CHD5 lijkt voornamelijk worden uitgezet door promoter hypermethylering bij maagkanker.
Er zijn steeds meer aanwijzingen dat Hypermethylering van TSG promotor is een van de belangrijkste moleculaire veranderingen in de ontwikkeling van kanker. De hoge incidentie van CHD5 promotor hypermethylatie bij maagkanker kan worden onderzocht niet alleen als maagkanker diagnose maar ook prognose voorspelling. Daartoe is het belangrijk om de CHD5 promoter methylatie karakteriseren in verband met klinische kenmerken, zoals leeftijd, geslacht, H. pylori infecties, tumorgraad, Lauren classificatie en differentiatie. Aangezien de hoge heterogeniteit van primair maagcarcinoom weefsels, methylatie analyse met hogere resolutie zoals kwantitatieve methylatie specifieke analyse met Sequenom of Taqman real-time PCR zal nuttig zijn om te beoordelen of CHD5 promoter methylatie is nuttig voor vroege maagkanker opsporing en prognose voorspelling.
Hoewel promoter methylering vaak inactiveert CHD5 bij maagkanker cellijnen, kunnen we niet op de aanwezigheid van andere mechanismen voor het verlies functie van CHD5 bij maagkanker te sluiten. CHD5 expressie extreem laag in MKN28 en SNU16 (fig. 1), maar de promotor van CHD5 slechts gedeeltelijk gemethyleerd in beide cellijnen (Fig. 2B), hetgeen aangeeft dat andere mechanismen verantwoordelijk zijn voor de onderdrukking van CHD5 in sommige kunnen van maagkanker cellijnen.
Conclusie
CHD5 was vaak down-gereguleerd door de promotor hypermethylatie bij maagkanker cellen. De ectopische expressie van CHD5 leidde tot groeiremming van maagkanker cellen, wat aangeeft dat CHD5 functioneert als een tumor suppressor gen epigenetisch zwijgen opgelegd bij maagkanker.
Verklaringen
Dankwoord
Wij danken Dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Run Run Shaw Ziekenhuis, Zhejiang University) voor zijn waardevol advies en technische ondersteuning. Het werk beschreven in dit document werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie ​​van de Onderzoeksraad Subsidies van de Hong Kong Special Administrative Region, China (Project No. CityU 160.508). Origineel ingediende dossiers
Authors 'voor beelden
Hieronder staan ​​de links naar originele ingediende dossiers van de auteurs voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Authors' 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Auteurs originele bestand voor figuur 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Authors 'originele bestand voor figuur 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Authors' originele bestand voor figuur 4 Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat zij hebben geen concurrerende belangen.

• De prognostische impact van epidermale groeifactor receptor bij patiënten met gemetastaseerde maagkanker
• Laparoscopische verstelbare gestreepte Roux-en-Y gastric bypass als primaire procedure voor de super-super-obesitas (body mass index > 60 kg /m2)