CHD5 je dolje regulira promotora Hipermetilacija u želučanom cancer

CHD5 je dolje regulira promotora Hipermetilacija kod raka želuca pregled apstraktne pregled pozadine
Nonhistone kromosomskih proteina u dogovoru s histona igraju važnu ulogu u replikaciji i popravak DNA te u regulaciji ekspresije gena. Deregulacija tih proteina može doprinijeti razvoju raznih bolesti kao što je rak. Kao nonhistone kromosomske proteina, chromodomain helikazna DNA vezujući protein 5 (CHD5) nedavno je identificiran kao proizvod supresor gena roman tumora (TSG), promicanje transkripciju P19 ink4a pregled i P16 Arf pregled. Inaktivacija CHD5 postignuta djelomice genetskim brisanje jer se nalazi u 1p36, području često izbrisani humanih tumora. U ovom istraživanju, cilj nam je proučiti uključenost CHD5 kod raka želuca, drugi najčešći oblik raka u svijetu.
Metode
izraz CHD5 u vijeću od želučanih stanica raka su određena kvantitativnom RT-PCR. Metilacija CHD5 je procijenjena metilacije specifičan PCR i bisulfita genoma sekvenciranje. Učinak CHD5 na rast stanica želuca raka testirala se ispitivanjem formiranja kolonija. Pregled Rezultati
CHD5 ekspresije podregulirani u svim želučanih staničnim linijama raka koriste (100%, 7/7) i značajno obnavljaju nakon farmakološka demetiliranje. Metilacija CHD5 promotor je otkriven u svim sedam želučanih staničnim linijama karcinoma iu većini osnovnih tkiva karcinoma želuca ispitana (73%, 11/15). Konačno, ektopično izraz CHD5 u želučanim stanicama raka dovelo do značajne inhibicije rasta. Pregled Zaključak pregled CHD5 bio TSG epigenetically dolje regulirana raka želuca. Pregled Pozadina pregled svih eukariotskih organizama razvile složene načine ambalažnog DNK u kromatina kroz dinamične interakcije različitih DNK povezan s proteinima. Takvo pakiranje je važno ne samo za skladištenje genetičke informacije s visokom vjernosti i poštenja, ali i prijenos genetskih informacija od DNA na RNA u čvrsto kontrolirani način. Proteini koji se vežu na DNA u kromatina tradicionalno su podijeljeni u dvije glavne klase: histona i nonhistone kromosomskih proteina. Histoni su skupina vrlo očuvanih vezanja DNA proteina i njihove različite post-translacijske modifikacije čine 'histona kod' koji vodi pakiranje DNA ili modeliranjem kromatina. Histon kod je pokrenut, održavati i tumači uglavnom nonhistone kromosomskih proteina [1-4]. Na primjer, acetiliranje lizinskih na histon repa pomoću histon acetiltransferaze (HATs) neutralizira njihove naboj i smanjuje afinitet histona s DNA, što DNK dostupna za transkripcijske faktore za inicijaciju transkripcije gena. S druge strane, deacetiliranja tih ostataka po histon deacetilaze (HDACs) vraća ovaj afinitet i može povući DNA iz transkripcijski mehanizam [5]. Osim acetilacije, fosforilacije i metilacije histon repa su važni za dinamičku organizaciji DNA transkripcijski mehanizam i drugim kromosomskim proteina [6-8]. Nonhistone kromosomske proteini imaju važnu ulogu u tumačenju histona kod formiranjem modeliranjem kromatina komplekse. Oba histoni i nonhistone kromosomske proteini su važni za regulaciju ekspresije gena, replikacija DNA i popravak DNA. U deregulations na ekspresiju i aktivnost tih proteina može dovesti do razvoja različitih bolesti kao što je karcinom [9-13].
U nedavnom istraživanju chromodomain helikazu DNA vezujući protein 5 (CHD5) identificiran je kao novi tumor supresorski gen (TSG) u neuroblastoma [14]. CHD5 pripada nadobitelji SWI2 /SNF2 vezanih ATPases, jedne veće grupe nonhistone kromosomskih proteina. CHD5 kodira jedinstvenu kombinaciju funkcionalnih domena koji se sastoji od dvije N-terminalne chromodomains, nakon čega slijedi SWI2 /SNF2 nalik ATPaze /uzvojnice domene i domene DNA-binding [14]. Reguliranjem kromatina strukturu, CHD5 može promicati izražavanje P19 Arf koji funkcionira stabilizirati p53, tumorski supresor deaktiviran u više od polovice karcinoma u ljudi [15]. CHD5 je prisutan na položaju gena (1p36.31) briše se u oko 35% neuroblastoma [16]. CHD5 ranije mislio da se posebno izražava u živčani sustav, ali je njegova uloga u slučaju raka u ostalim tkivima počinje oporavljati [17]. CHD5 gen pronađen je značajno izbrisati glioma [18]. Osim brisanja gena, CHD5 može se potisnuti drugim mehanizmima. U nekim slučajevima neuroblastoma, postoje dokazi da CHD5 izraz epigenetically je potisnut od strane promotora Hipermetilacija [19], iako je to zapažanje nije potvrdio drugoj studiji [20]. Nedavno je CHD5 promotor Nađeno je da se metilirati u malim podskupovima dojke (4,4%), karcinom debelog crijeva (10%), jajnika (15%) i gliom (17%) tumora [17, 20], sugerirajući epigenetičku odsutnost CHD5 metilacija može igrati djelomičnu ulogu u nastanku tumora u tim tkivima. Ovdje smo otkrili da je, za razliku od drugih tipova raka sada prijavljenih, CHD5 često je hypermethylated kod raka želuca (73% tumora i 100% staničnih linija). Ektopijsku ekspresija CHD5 u želučanim stanicama raka dovela do značajne inhibicije rasta. Ova upadljiva korelacija od epigenetičke suzbijanje CHD5 i raka želuca ukazuje na dosad nepoznat odnos između ove TSG i želučane tumorigenezi.
Metode
Kultura tkiva i RNA /DNA ekstrakcije pregled svih želučanih staničnim linijama karcinoma (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 i NCI-N87) dobiveni su iz Riken banka gena (Tsukuba, Ibaraki, Japan) i American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Sve stanične linije raka utvrđene su iz karcinoma želuca epitelnim stanicama. Osim ako nije posebno navedeno, stanice su uzgojene u RPMI 1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma na 37 ° C s 5% CO 2 i 95% vlage. Farmakološkog demetilacije, stanice su tretirane s 5 uM 5-aza-2'-deoksicitidina (aza) (Sigma, St. Louis, MO, USA) tijekom tri uzastopna dana [21]. Aza se obnavlja svakih 24 sata. Ekvivalent koncentracija nosača (DMSO) je korišten kao kontrola. Za primarnih tkiva, normalne želučani tkiva se definira kao ne-upala i ne-tumorskih tkiva. Svi tkiva karcinoma želuca su adenokarcinoma tkiva. Ukupna RNA i genomska DNA je ekstrahirana pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača.
Kvantitativna RT-PCR
reakcije reverzne transkripcije je izveden korištenjem 1 ug ukupne RNA s sustava reverzne transkripcije (Promega, Madison , WI, USA). Razina ekspresije mRNA iz CHD5 određena kvantitativnom u realnom vremenu RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Gliceraldehid-3-phosohate dehidrogenaze (GAPDH) je korišten kao interna kontrola integriteta RNA. Početnice korištene za CHD5 RT-PCR su CHD5-F 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC i CHD5-R. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG pregled Metilacija specifičan PCR (MSP) pregled metilacije status CHD5 je određena MSP koristeći modificirani bisulfatne genomske DNA kao šablonu. Genomska DNA bisulfit tretirane s Zymo DNK modifikacije opreme (Zymo Research, Orange, CA, USA) prema protokolu. MSP se provodi tijekom 40 ciklusa s temperaturom žarenja na 62 ° C, kao što je prethodno opisano [22]. Metilacije specifični primeri: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (od -525 do -506 u odnosu na početno mjesto transkripcije) i CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (od -438 do -418) i unmethylation specifične klice su: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT i CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Svi primeri su ranije potvrdili su za ne pojačava bilo unbisulfited DNA
bisulfit genom sekvenciranje (BGS)
bisulfita liječenih DNA pojačava se BGS primera, CHD5-BF. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (od -724 do -701) i CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (od -324 do -301). PCR produkti su pročišćeni s ilustracija GFX ™ PCR i kit pročišćavanje gel pojas (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sweden) i kloniran u pCR4-TOPO vektor za sekvenciranje (Invitrogen). Najmanje 6 kolonije su nasumce izabrani za ekstrakciju plazmida i sekvenciranje analiza. Pregled Izgradnja CHD5 ekspresije plazmida
CHD5 plazmida ekspresije je konstruiran kloniranja pune duljine CHD5 otvorenom okviru čitanja na izraz vektoru sisavca pcDNA3.1. CHD5 otvoreni okvir čitanja povećan je iz normalnog želuca cDNA koristeći visoku vjernost Pfu DNA polimeraza (Invitrogen) i klonira u pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Nakon sekvenciranja validacije, umetak je subklonirana u pcDNA3.1 restrikcijskim enzimima HindIII i XbaI I.-pregled Colony formiranje Test
Prijelazno transficirane AGS stanice s praznim pcDNA3.1 or pcDNA3.1-CHD5 korišteni su za monosloja test formiranja kolonija. Stanice su preko noći kultivirane u 12-jažica (1,0 x 10 5 /jažici), transfektirane s pcDNA3.1 ili CHD5 eksprimirajuće vektor pomoću lipofektamina ™ 2000 (Invitrogen). 48 sata kasnije, transfektanti su ponovno stavljene u triplikatu i uzgajani 10-15 dana u kompletnom mediju RPMI1640 koji sadrži G418 (400 ug /ml). Preživjeli kolonije su obojeni gorčica Violet nakon metanol fiksacija i kolonije koje prelaze određenu veličinu (≥ 50 stanice) su izbrojani. Eksperimenti su ponovljeni tri puta. Rezultati pregled
podreguliranjem CHD5 ekspresije u želučanom staničnim linijama raka
Ekspresija CHD5 u želučanim staničnim linijama raka je određena kvantitativnom RT-PCR. Dok CHD5 je vrlo izražena u normalnim želučanog tkiva, njegovi izrazi su dolje kod svih 7 želučanih staničnim linijama karcinoma (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 i NCI-N87 SNU1 i SNU16) (Sl. 1). Slika 1 je CHD5 podregulirani u želučanim staničnim linijama raka. Ekspresija CHD5 u želučanim staničnim linijama raka određena je pomoću RT-PCR. GAPDH korišten za normalizaciju izraz CHD5. Normalne želuca tkiva (želudac) je korišten kao referenca. Rezultati kvantitativnog realnom vremenu RT-PCR je prikazano na gornjoj ploči i rezultat konvencionalnih RT-PCR je prikazano u donjoj ploči. Pregled promotor Hipermetilacija od CHD5 u želučanim staničnih linija raka i primarnog tkiva karcinoma želuca
Tipični CpG Island (CGI) pronađeno je oko CHD5 eksona 1 koristeći sljedeće kriterije: GC sadržaja > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, a dužina > 500 bp (slika 2A).. Metilacija status ove CGI u želučanih stanica raka je određena metilacije specifičan PCR (MSP). Kao što je prikazano na slici. 2B, potpuno ili djelomično metilacije je otkriven u svim 7 želučanih staničnim linijama karcinoma smo ispitati. U skladu s podacima o staničnim linijama želučanog je CHD5 promotora također je metiliran u većini tkiva karcinoma primarno želuca testirani (73%, 11/15) (Sl. 2C). Važno je, metiliranje CHD5 promotor je ili neotkriven ili slabo detektirati u normalnim tkivima susjedna tumora istog pacijenta i želučanom tkiva normalnih osoba. Osim toga, metilacija CHD5 promotora u želučanom staničnih linija raka i želučane tkiva karcinoma je potvrđena bisulfita genoma sekvenciranje (BGS) (Sl. 2d). Uzeti zajedno, CHD5 pretežno su utihnuli u rak želuca i promotor Hipermetilacija čini se da je glavni mehanizam CHD5 utišavanje u nastanku tumora ovog tkiva. Slika 2 CHD5 promotor hypermethylated kod raka želuca. A, CHD5 ima tipičnu otok CpG (CGI) oko svoje eksona 1. CGI je prikazana grafički GeneTool program. Položaji BGS i MSP primera su označeni kao strelice. B, Metilacija status CHD5 promotora u stanicama raka želuca je određena metilacije specifičnom PCR. M: metilacije; U: unmethylation. C, Metilacija status CHD5 promotora u primarnim želučanom tkivu karcinoma određuje se metilacije specifičnom PCR kao u B. normalnim želučanom tkivu i susjednim ne-tumorskih tkiva su korišteni kao kontrola. N1 i N2 su normalni želučane tkiva. T1 i T2 ukazuju želučanog tkiva karcinoma, dok su A1 i A2 predstavljaju susjedne ne-tumorskih tkiva. Zastupljene su rezultati prikazani. D Metilacija CHD5 promotora u želučanom staničnih linija raka i primarnog tkiva karcinoma želuca potvrđena je BGS. Svaki krug označava jedan CpG stranica i krugovi su ispunili crnom predstavljaju metilirani CpG mjesta. Jedan red krugova predstavlja jednu koloniju.
Doreguliranjem ekspresije CHD5 nakon aza liječenje pregled Kako bi se dalje potvrdila promoter CGI Hipermetilacija posredovane CHD5 utišavanje u želučanom staničnim linijama raka, CHD5 izrazi u AGS i Kato III prije i nakon demetilitanog reagensa analizirani su aza tretman. Obje stanične linije pokazuju potpunu metilacije CHD5 promotora. CHD5 ekspresije ovih dviju staničnih linija značajno povećala nakon aza-induciranu demetilacijom CHD5 promotora (Sl. 3A i 3B), koji pokazuju da CHD5 doista epigenetically silenced u raka želuca. Slika 3. Farmakološki demetilacija aktivira ekspresiju CHD5 u želučanom staničnim linijama raka. A, Relativni CHD5 izrazi prije i poslije tretmana aza određene su pomoću RT-PCR, kao na slici. 1. GAPDH korišten za normalizaciju iznos predloška. B, dcmctilacija CHD5 promotora u AGS stanica nakon aza tretmana je potvrdio BGS kao na slici. 2D. Pregled inhibitorni Rast funkcija CHD5 pregled suzbijanje tumora imovine CHD5 u želučanih stanica raka je istražen u dobitak-of-funkcije strategije. Potpuno otvoreni okvir čitanja (ORF) u CHD5 je klonirana u ekspresijskom vektoru sisavca pcDNA3.1. Učinak izvanmaternične CHD5 izražavanja na rast želučanih stanica raka AGS je određena testom formiranja jednoslojni kolonija. Prisilno ekspresija CHD5 u AGS stanicama je potvrđena pomoću RT-PCR (Sl. 4A). Broj kolonija formirana na ploču pomoću stanica koje prekomjerno eksprimiraju CHD5 je značajno smanjena (p pregled < 0,01) (Slika 4B i 4C)., Što znači da se mogu CHD5 suprimira rast želučanih stanica raka. Slika 4 CHD5 inhibira rast raka želuca stanične linije AGS. Učinak ektopične CHD5 ekspresije na rast tumorskih stanica ispitana je testom formiranja kolonije monosloj. A, CHD5 ekspresija u stanicama nakon transfekcije AGS određena je pomoću RT-PCR. Fotografija kolonija formiranih AGS stanicama zaraženim s pcDNA3.1 (vektor) ili pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) je prikazano u B. C, Kvantitativna analiza brojeva kolonije su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. P pregled vrijednosti izračunate su pomoću Studentovog t-testa. Zvjezdica označava statistički značajnu razliku (p izvoznici < 0,01). Pregled Rasprava
Tijekom proteklih nekoliko godina, mnogi TSGs su pronađeni biti epigenetically inaktivirano kod raka želuca, što znači da epigenetičko utišavanje od TSGs je jedan glavnih molekulskih promjena u procesu karcinogeneze želučanog [22-25]. U ovom istraživanju, CHD5 je identificiran kao još jedan potencijalni TSG čije epigenetičko inaktivacije može doprinijeti želučane karcinogeneze. Često je podregulira do promotora Hipermetilacija u želučanom staničnim linijama raka. Ektopijsku izraz CHD5 dovela je do inhibicije rasta želučanih stanica raka, što pokazuje da djeluje kao CHD5 TSG epigenetically silenced u želuca. Pregled promotor Hipermetilacija od CHD5 u karcinomu je kod ostalih vrsta raka [17, 20]. Međutim, učestalost CHD5 promotora metilacije u želučanom staničnih linija raka i tumora, pronađen je u ovoj studiji biti relativno velika u usporedbi s učestalošću CHD5 metiliranjem u drugih vrsta raka (obično ispod 20%) [17, 20]. Naravno, više uzoraka treba koristiti kako bi potvrdili ovaj rezultat s istim MSP klica u sljedećim studijama. Ipak, naš nalaz sugerira da CHD5 inaktivacija može biti posredovan preko drugačijih mehanizama u različitim tkivima. Dok CHD5 inaktivira kroz broj kopija abnormalnosti u različitim oblicima raka [15, 16], usporedni genomska hibridizacija (CHG) ukazuju da 1p36 je CHD5 koji sadrži gen lokusa, nije značajno neuravnotežena u želučanim raka [26]. Umjesto toga, kao što je prikazano u ovom istraživanju, CHD5 Čini se da je ušutkan pretežno od strane promotora Hipermetilacija u rak želuca. Pregled, Sve je više dokaza da Hipermetilacija TSG promotora predstavlja jedan od glavnih molekularnih promjena u razvoju raka. Visoka incidencija CHD5 promotora Hipermetilacija kod raka želuca može se istražiti ne samo kao dijagnoze raka želuca, ali i prognozom predviđanja. U tom smislu, važno je obilježiti CHD5 promotor metilacije u suradnji s kliničkim karakteristikama, kao što su dob, spol, H. pylori infekcije, tumora razred, Lauren klasifikacije i diferencijacije. S obzirom da je visoka heterogenost osnovnih tkiva karcinoma želuca, metilacije analizira s većom rezolucijom, kao što su kvantitativna metilacije specifične analize koristeći sequenom ili Taqman realnom vremenu PCR će biti korisne za procjenu je li CHD5 promotor metilacije je korisno za rano želučane otkrivanja raka i predviđanja prognoze. pregled, iako promotor metilacije često deaktivira CHD5 u želučanom staničnim linijama karcinoma, ne možemo isključiti prisutnost drugih mehanizama za funkciju gubitka CHD5 u raka želuca. CHD5 izraz je izuzetno niska u MKN28 i SNU16 (sl. 1), međutim, promotor CHD5 je samo djelomično metilirani u ove dvije stanične linije (sl. 2b), što znači da su drugi mehanizmi mogu biti odgovorna za prigušenje CHD5 u nekim želučanih staničnim linijama karcinoma. pregled Zaključak pregled CHD5 često je reguliran dolje kroz promotora Hipermetilacija u želučanih stanica raka. Ektopijsku izraz CHD5 dovelo do inhibicije rasta želučanih stanica raka, što znači da CHD5 djeluje kao supresor gena tumora epigenetically ušutkan u rak želuca.
Izjavama pregled Zahvale pregled Zahvaljujemo dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Runrun Shaw bolnica, Zhejiang University) za svoje neprocjenjive savjete i tehničku podršku. U radu je opisano u ovom radu je djelomično podržan od strane grant od Vijeća potpora za istraživanja Hong Kong Posebnog upravnog područja, Kina (Projekt br CityU 160508).
Autora originalne dostavljeni datoteke za slike
Ispod su linkovi na autora originalnih dostavljenih datoteka za slike. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg autora izvorna datoteka za Slika 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg autorskim izvorne datoteke za sliku 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg autorskim izvorne datoteke na Slici 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg autorskim izvorne datoteke za Slika 4 suprotstavljenih interesa
Autori izjavljuju da nema suprotstavljenih interesa. pregled

• Prognostička utjecaj receptor faktora rasta u bolesnika s metastatskim karcinomom želuca
• Laparoskopska podesiva povezan Roux-en-Y želučani zaobići kao primarni postupak za super-super-debeli (indeks tjelesne mase do 60 kg /m2)