CHD5 подавляется через гиперметилированием промотора при раке желудка

CHD5 подавляется через гиперметилированием промотора при раке желудка
Аннотация
Справочная информация
негистоновых хромосомных белков во взаимодействии с гистонов играют важную роль в репликации и репарации ДНК и в регуляции экспрессии генов. Дерегуляция этих белков может внести свой вклад в развитие различных заболеваний, таких как рак. В качестве негистоновых хромосомного белка, связывание chromodomain хеликаза ДНК белка 5 (CHD5) недавно был идентифицирован как продукт супрессоров гена романа опухоли (TSG), способствуя транскрипции р19 INK4a
и p16 ARF
. Инактивация CHD5 была достигнута частично за счет генетического удаления, поскольку она находится в 1p36, область часто удаляется в опухолях человека. В данном исследовании мы стремимся изучить причастность CHD5 при раке желудка, второй наиболее распространенной формой рака во всем мире.
Методы
выражение CHD5 в панели клеток рака желудка определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР. Метилирование CHD5 оценивали путем метилирования специфической ПЦР и бисульфита секвенирования генома. Эффект CHD5 на рост клеток рака желудка была проверена путем анализа колониеобразования.

Результаты экспрессии CHD5 подавлялась во всех желудочных линий раковых клеток использовали (100%, 7/7) и значительно восстанавливается после того, как фармакологическая деметилирования. Метилирование CHD5 промотора был обнаружен во всех семи желудочных линий раковых клеток и в большинстве первичных тканей карциномы желудка, исследовали (73%, 11/15). Наконец, эктопическая экспрессия CHD5 в желудочном раковых клеток привело к существенному торможению роста.
Заключение
CHD5 был TSG эпигенетически вниз регулируется при раке желудка.
Предпосылки
всех эукариотических организмов разработали сложные способы упаковки ДНК в хроматин через динамические взаимодействия различных ДНК-ассоциированных белков. Такая упаковка не только для хранения генетической информации с высокой точностью и целостности, но и передачу генетической информации от ДНК к РНК в жестко контролируемой манере. Белки, которые связываются с ДНК с образованием хроматина традиционно делятся на два основных класса: гистонов и негистоновых хромосомными белками. Гистоны группа высоко консервативны ДНК связывающих белков и их различные посттрансляционные модификации представляют собой "гистонов код", который направляет упаковку ДНК или хроматина. Код гистонов инициируется, поддерживается и интерпретированы в основном негистоновых хромосомными белками [1-4]. Например, ацетилирование остатков лизина на гистонов по гистонацетилтрансфераза (HATS) нейтрализует их заряд и уменьшает сродство гистонов с ДНК, что делает ДНК доступными для транскрипционных факторов для инициации транскрипции гена. И наоборот, деацетилирование эти остатки гистондезацетилаз (HDACs) восстанавливает этот сродством и может вывести ДНК из транскрипционного аппарата [5]. В дополнение к ацетилирование, фосфорилирование и метилирование гистонов имеют важное значение для динамической ассоциации с ДНК транскрипционного аппарата и другими хромосомными белками [6-8]. Негистоновых хромосомные белки играют важную роль в интерпретации гистона кода путем формирования структуры хроматина комплексов. Оба гистонов и негистоновые хромосомные белки играют важную роль в регуляции экспрессии генов, репликации ДНК и репарации ДНК. В дерегулирования в экспрессии и активности этих белков может привести к развитию различных заболеваний, таких как рак [9-13].
В недавнем исследовании, chromodomain хеликаза ДНК-связывающий белок 5 (CHD5) был идентифицирован как Новый ген-супрессор (ТСГ) в нейробластомы [14]. CHD5 относится к надсемейства SWI2 /SNF2 связанных с АТФаз, одной крупной группой негистоновых хромосомных белков. CHD5 кодирует уникальную комбинацию функциональных доменов, состоящих из двух N-концевых chromodomains, за которым следует SWI2 /SNF2-АТФазы, как домен /геликазу и ДНК-связывающего домена [14]. Регулируя структуру хроматина, CHD5 может способствовать экспрессии p19 ARF, что функции для стабилизации р53, подавитель опухоли инактивируется более половины злокачественных опухолей человека [15]. CHD5 присутствует в локус гена (1p36.31) удален примерно в 35% от нейробластомы [16]. CHD5 Ранее считалось быть специфически экспрессируется в нервной системе, но его роль в раке в других тканях начинают появляться [17]. Ген CHD5 был найден значительно удален в глиомы [18]. Помимо делеции гена, CHD5 могут быть подавлены с помощью других механизмов. В некоторых случаях нейробластома, существуют доказательства того, что выражение CHD5 эпигенетически подавляется гиперметилированием промотора [19], хотя это наблюдение не было подтверждено другом исследовании [20]. В последнее время, промотор CHD5 было установлено, метилировать в небольших подмножеств молочной железы (4,4%), ободочной кишки (10%), рак яичников (15%) и опухолей глиомы (17%) [17, 20], что указывает эпигенетическую сайленсинг CHD5 метилирования может играть частичную роль в онкогенеза в этих тканях. Здесь мы обнаружили, что, в отличие от других видов рака сообщалось до сих пор, было CHD5 часто гиперметилированы рака желудка (73% опухолей и 100% клеточных линий). Эктопическая экспрессия CHD5 в раковых клетках желудка привело к значительному торможению роста. Это поразительное соотношение эпигенетического подавления CHD5 и рака желудка свидетельствует о ранее неизвестных связь между этим TSG и желудочных онкогенеза.
Методы
культуры ткани и РНК /Выделение ДНК
Все желудочных линий раковых клеток (AGS, Като III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 и NCI-N87) были получены из банка генов Riken (Цукуба, Ибараки, Япония) и американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, VA, США). Все линии клеток рака были созданы из карцином эпителиальных клеток желудка. Если специально не указано особо, клетки культивировали в среде RPMI 1640 (фирма Invitrogen, Carlsbad, CA, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С с 5% CO <суб> 2 и 95% влажности. Для фармакологической деметилирования, клетки обрабатывали 5 мкМ 5-аза-2'-дезоксицитидин (AZA) (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в течение трех последовательных дней [21]. Аза пополняется каждые 24 часа. Эквивалентная концентрация транспортного средства (ДМСО), использовали в качестве контроля. Для получения первичных тканей, нормальные желудочные ткани были определены как не воспаление и неопухолевых тканей. Все ткани желудка карциномы являются аденокарциномы ткани. Общую РНК и геномную ДНК экстрагировали с использованием реагента тризола (Invitrogen) в соответствии с инструкцией изготовителя.
Количественные в режиме реального времени RT-PCR
реакции обратной транскрипции проводили с использованием 1 мкг общей РНК с системы транскрипции перевернутое (Promega, Madison , WI, USA). Уровни экспрессии мРНК CHD5 определялись с помощью количественной в реальном времени ОТ-ПЦР SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Глицеральдегид-3-phosohate-дегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве внутреннего контроля целостности РНК. Праймеры, используемые для CHD5 RT-PCR были CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC и CHD5-R:.
5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG метилирования специфической ПЦР (ПНС)
метилирования статус CHD5 определялось МПВ с использованием бисульфита модифицированный геномный ДНК в качестве матрицы. Геномную ДНК бисульфит обрабатывали Zymo ДНК Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) в соответствии с прилагаемым протоколом. СМП проводили в течение 40 циклов с температурой отжига при 62 ° С, как описано ранее [22]. Метилирования праймерами были: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (от -525 до -506 относительно стартового сайта транскрипции) и CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (от -438 до -418), и unmethylation конкретных праймеры были: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT и CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Все праймеры были подтверждены ранее для амплификации не любой unbisulfited ДНК
бисульфита секвенирование генома (BGS)
бисульфит обработанной ДНК амплифицировали с использованием праймеров BGS, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (от -724 до -701) и CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (от -324 до -301). ПЦР-продукты очищали с Illustra GFX ™ ПЦР и набор для очистки гель-группа (GE Healthcare науки о жизни, Упсала, Швеция) и клонировали в pCR4-TOPO вектор для секвенирования (Invitrogen). По крайней мере, 6 колоний были выбраны случайным образом для извлечения плазмиды и анализа секвенирования.
Конструирование плазмид экспрессии CHD5
Выражение CHD5 плазмиду конструировали путем клонирования полноразмерного CHD5 открытой рамки считывания в экспрессирующий вектор млекопитающего пкДНК3.1. CHD5 открытая рамка считывания амплифицировали из кДНК нормального желудка с использованием высокой точностью БОЕ ДНК-полимеразы (Invitrogen) и клонировали в pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). После проверки секвенирования вставки субклонировали в пкДНК3.1 ферментами рестрикции Hind III и Xba I.
Анализ образования колоний
трансфицированы AGS клетки с пустым пкДНК3.1 или pcDNA3.1-CHD5 использовались для монослоя колонии формирование анализа. Клетки культивировали в течение ночи в 12-луночный планшет (1,0 × 10 5 /лунку) и трансфицировали пкДНК3.1 или вектором CHD5-экспрессирующие с использованием липофектамина ™ 2000 (Invitrogen). Через 48 часов трансфектанты были повторно высевали в трех повторах и культивировали в течение 10-15 дней в полной среде RPMI1640, содержащей G418 (400 мкг /мл). Выжившие колонии окрашивали генцианвиолету после метанола фиксации и колонии, превышающие определенный размер (≥ 50 клеток) подсчитывали. Эксперименты повторяли три раза.
Результаты
понижающей регуляции экспрессии CHD5 в желудочном линиях раковых клеток
Выражение CHD5 в желудочном линиях раковых клеток определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР. В то время как CHD5 была высоко выражена в нормальных тканях желудка, его выражения понижающей регуляции во всех 7 желудочных линий раковых клеток (AGS, Като III, MKN28, MKN45 и NCI-N87 SNU1 и SNU16) (рис. 1). Рисунок 1 CHD5 подавляется в желудочном линиях раковых клеток. Выражение CHD5 в желудочном линиях раковых клеток определяли с помощью ОТ-ПЦР. GAPDH использовали для нормализации экспрессии CHD5. Нормальная ткань желудка (желудок) был использован в качестве ссылки. Результаты количественного в режиме реального времени RT-PCR было показано в верхней панели и результат обычной ОТ-ПЦР было показано в нижней панели.
Promoter гиперметилирование CHD5 в желудочном линиях раковых клеток и первичных желудочных тканей карциномы
Типичным CpG острова (CGI) был найден около CHD5 экзона 1 с использованием следующих критериев: GC содержание > 55%, ObsCpG /ExpCpG &GТ; 0,65, а длина > 500 пар оснований (рис 2А.). Статус метилирования этого CGI в желудочном раковых клеток определяли с помощью метилирования специфической ПЦР (ПНС). Как показано на рис. 2B, полное или частичное метилирование была обнаружена во всех 7 желудочных линий раковых клеток, которые мы исследовали. В соответствии с данными о желудочных клеточных линиях, промотор CHD5 был также метилируется в большинстве первичных желудочных тканей карциномы тестируемых (73%, 11/15) (рис. 2С). Важно отметить, что метилирование промотора CHD5 был либо незамеченной или слабо обнаруживается в нормальных тканях, прилегающих к опухоли одних и тех же пациентов, так и в тканях желудка нормальных субъектов. Более того, метилирование CHD5 промотора в желудочном линиях раковых клеток желудка и тканей карциномы была подтверждена бисульфита секвенирование генома (БГС) (рис. 2D). Взятые вместе, CHD5 был подавлен в основном рака желудка и промоутер гиперметилирование оказался основным механизмом CHD5 глушителей в онкогенеза этой ткани. Рисунок 2 CHD5 промотор гиперметилированы при раке желудка. А, CHD5 имеет типичный остров CpG (CGI) вокруг своей экзон 1. CGI была построена по программе GeneTool. Позиции BGS и праймеров MSP указаны в виде стрелок. Б, статус метилирования CHD5 промотора в желудочном раковых клеток определяли с помощью метилирования специфической ПЦР. М: метилирование; U: unmethylation. С, статус метилирования CHD5 промотора в первичных желудочных раковых тканей определяли с помощью метилирования специфической ПЦР, как в B. нормальных желудочных тканей и прилегающих тканей неопухолевых использовали в качестве контролей. N1 и N2 являются нормальными желудочные ткани. Т1 и Т2 указывают на желудочные ткани карциномы в то время как А1 и А2 представляют собой соседние ткани неопухолевые. Представлены результаты были показаны. D, метилирование промотора CHD5 в желудочном линиях раковых клеток и первичных тканей желудка карциномы была подтверждена BGS. Каждый круг указывает на один сайт и круги, заполненные в черном CpG представляют собой метилируется сайты CpG. Один ряд окружностей представляет собой одну колонию.
, CHD5 выражения в AGS и Като III до и повышающей регуляции экспрессии CHD5 после лечения Аза
Для дальнейшего подтверждения промотор CGI гиперметилирование опосредованной CHD5 глушителей в желудочном линиях раковых клеток после того, как реагент деметилирования лечения Аза были проанализированы. Обе клеточные линии демонстрируют полное метилирование промотора CHD5. Выражение CHD5 в этих двух клеточных линий были значительно увеличены после Аза-индуцированной деметилирования CHD5 промотора (фиг. 3A и 3B), демонстрируя, что CHD5 действительно эпигенетически замолчать при раке желудка. Рисунок 3 Фармакологический деметилирования реактивирует экспрессию CHD5 в желудочном линиях раковых клеток. А, относительные выражения CHD5 до и после лечения Аза определяли с помощью ОТ-ПЦР, как на фиг. 1. GAPDH использовали для нормализации количества шаблонов. B, Деметилированием CHD5 промотора в клетках AGS после лечения Аза была подтверждена BGS, как на рис. 2D.
Ингибирующее рост функция CHD5
подавление опухоли свойство CHD5 в желудочном раковых клеток исследовали с помощью стратегии усиления из-функции. Полная открытая рамка считывания (ORF) из CHD5 был клонирован в экспрессирующий вектор млекопитающего пкДНК3.1. Влияние эктопической экспрессии CHD5 на рост клеток рака желудка AGS определяли с помощью анализа образования монослоя колонии. Принудительная экспрессия CHD5 в AGS клетках была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР (фиг. 4А). Число колоний, образованных на пластине клетками сверхэкспресирующим CHD5 была значительно снижена (р
≪ 0,01) (рис 4В и 4С.), Что указывает, что CHD5 может подавлять рост клеток рака желудка. Рисунок 4 CHD5 ингибирует рост клеток рака желудка линии AGS. Влияние эктопической экспрессии CHD5 на рост опухолевых клеток исследовали с помощью анализа образования монослоя колонии. А, выражение CHD5 в клетках AGS после трансфекции определяли с помощью ОТ-ПЦР. Фотография колоний, образованных AGS клеток, трансфицированных пкДНК3.1 (вектор) или пкДНК3.1-CHD5 (CHD5) было показано в Б. С, количественный анализ числа колоний показаны как значения средних ± стандартное отклонение. P
значения были рассчитаны с использованием Т-теста студента. Звездочка указывает на статистически значимое различие (р &
Лт; 0,01).
Обсуждение
За последние несколько лет многие TSGs были признаны эпигенетически инактивируется при раке желудка, что свидетельствует о том, что эпигенетические глушение TSGs является одним основных молекулярных изменений в процессе канцерогенеза желудка [22-25]. В данном исследовании CHD5 был идентифицирован в качестве еще одного потенциального TSG которого эпигенетическое инактивация может внести свой вклад в желудочном канцерогенезе. Это часто вниз регулируется через промоутера гиперметилированием в желудочном линиях раковых клеток. Эктопическая экспрессия CHD5 приводило к ингибированию роста клеток рака желудка, что указывает, что функции CHD5 как TSG эпигенетически подавлен в рак желудка.
Promoter гиперметилирование CHD5 при раке наблюдается у других видов рака [17, 20]. Тем не менее, заболеваемость CHD5 метилирования промотора в желудочном линий раковых клеток и опухолей была обнаружена в данном исследовании, чтобы быть относительно высоким, по сравнению с частотой CHD5 метилирования в других раковых заболеваний (как правило, ниже 20%) [17, 20]. Конечно, больше образцов следует использовать для подтверждения этого результата с теми же праймерами MSP в следующих исследованиях. Тем не менее, наши данные свидетельствуют о том, что инактивацию CHD5 могут быть опосредованы различными механизмами в различных тканях. В то время как CHD5 инактивируется через число копий в ненормальности различных видов рака [15, 16], сравнительная геномная гибридизация (CGH) показал, что 1p36, то CHD5 содержащего ген локуса, не значительно несбалансированным в рака желудка [26]. Вместо этого, как показано в этом исследовании, по-видимому, CHD5 молчать преимущественно промоутер гиперметилированием при раке желудка.
Существует все больше доказательств того, что гиперметилирование TSG промотор представляет собой один из основных молекулярных изменений в развитии рака. Высокая частота CHD5 гиперметилированием промотора при раке желудка можно исследовать не только как желудочное диагностики рака, но и прогностической прогноз. С этой целью важно, чтобы охарактеризовать CHD5 метилирования промоторов в сочетании с клиническими характеристиками, такими как возраст, пол, хеликобактерной инфекции, степень злокачественности, классификации Lauren и дифференциации. Принимая во внимание, что высокая гетерогенность первичных желудочных тканей карциномы, метилирование анализ с более высоким разрешением, таких как количественное метилирования специфического анализа с использованием Sequenom или Taqman ПЦР в реальном времени будет полезно оценить, насколько полезно для раннего желудка обнаружения рака и прогнозирования прогноза CHD5 промотора метилирования.
Хотя промоутер метилирование часто инактивирует CHD5 в желудочном линиях раковых клеток, мы не можем исключить наличие других механизмов для функции потерь CHD5 при раке желудка. Выражение CHD5 чрезвычайно низка в MKN28 и SNU16 (рис. 1), тем не менее, промотор CHD5 был лишь частично метилированной в этих двух клеточных линий (фиг. 2б), указывая, что другие механизмы могут быть ответственны за глушителей CHD5 в некоторых желудочных линий раковых клеток.
Заключение
CHD5 был часто вниз регулируется через промоутера гиперметилированием в раковых клетках желудка. Эктопическая экспрессия CHD5 привело к торможению роста клеток рака желудка, что свидетельствует о том, что функции CHD5 как ген-супрессор опухолей эпигенетически притихли при раке желудка.
Declarations
Благодарности
Мы выражаем благодарность д-ру Hongchuan Джин (Исследовательский центр биомедицины, сэр Шао Ифу больницы, Zhejiang University) за его неоценимые советы и техническую поддержку. Работа, описанная в данной статье была частично поддержана грантом Совета по научно-исследовательских грантов Гонконга Специальный административный район, Китай (проект № CityU 160508). Оригинальные представленные файлы для авторов изображений для изображения Ниже ссылки на исходные файлы представленных авторов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Авторского 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg авторов исходного файла для Рисунок 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Авторского исходного файла для Рисунок 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Авторского исходного файла для фигурного 4 конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что они нет конкурирующих интересов.

• Прогностическое влияние рецептора эпидермального фактора роста у больных с метастатическим cancer
• Лапароскопическая регулируемая ленточная Roux-ан-у желудочного шунтирования в качестве первичной процедуры д…