CHD5 nedreguleres via promotor hypermethylering i gastrisk cancer

CHD5 nedreguleres via promotor hypermethylering i mavekræft
Abstract
Baggrund
Nonhistone kromosomale proteiner i koncert med histoner spiller en vigtig rolle i replikation og reparation af DNA og i reguleringen af ​​genekspression. Dereguleringen af ​​disse proteiner kan bidrage til udviklingen af ​​en række sygdomme, såsom cancer. Som nonhistone kromosomal protein, har chromodomain helicase DNA bindende protein 5 (CHD5) for nylig blevet identificeret som et produkt af en roman tumorsuppressorgen (GTS), fremme transskription af p19 INK4a
p16 ARF
. Inaktivering af CHD5 blev opnået dels gennem genetisk deletion da det er placeret i 1p36, en region hyppigt deleteret i humane tumorer. I denne undersøgelse, vi sigter mod at studere inddragelse af CHD5 gastrisk kræft, den anden mest almindelige kræftform i verden.
Metoder
CHD5 udtryk i et panel af gastriske cancerceller blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Methylering af CHD5 blev evalueret ved methylering specifik PCR og bisulfit genom sekventering. Effekten af ​​CHD5 på vækst af gastriske kræftceller blev testet af kolonidannelse assay.
Resultater
CHD5 ekspression blev nedreguleret i alle gastrisk kræft cellelinjer anvendt (100%, 7/7) og signifikant genoprettet efter farmakologisk demethylering. Methylering af CHD5 promotoren blev detekteret i alle syv gastriske cancer cellelinjer og i de fleste primære gastrisk carcinom undersøgte væv (73%, 11/15). Finally, ektopisk udtryk for CHD5 i gastric kræftceller medførte en betydelig vækst hæmning.
Conclusion
CHD5 was GTS epigenetisk nedreguleret i mavekræft.
Background
All eukaryote organismer har udviklet elaborate ways til emballering af DNA i kromatin gennem de dynamiske interaktioner af forskellige DNA-associerede proteiner. Sådan emballage er ikke kun vigtigt for oplagring af genetisk information med high fidelity og integritet, men også overførslen af ​​genetisk information fra DNA til RNA i en tæt kontrolleret måde. Proteiner, der binder til DNA til dannelse chromatin traditionelt opdelt i to generelle klasser: histoner og nonhistone kromosomale proteiner. Histoner er en gruppe af højt konserverede DNA-bindende proteiner og deres forskellige post-translationelle modifikationer, udgør den 'histon koden », der guider emballering af DNA eller chromatin remodeling. Den histon kode påbegyndes, vedligeholdes og fortolkes i vid udstrækning af nonhistone kromosomale proteiner [1-4]. For eksempel acetylering af lysinrester på histon tails af histonacetyltransferaser (hat) neutraliserer deres ladning og nedsætter affiniteten af ​​histoner med DNA, hvilket gør DNA tilgængeligt for transkriptionelle faktorer for at initiere gentranskription. Omvendt deacetylering af disse rester med histondeacetylaser (HDAC) genskaber denne affinitet og kan trække DNA fra transkriptionelle maskiner [5]. Foruden acetylering, phosphorylering og methylering af histon haler er vigtige for den dynamiske associering DNA med transkriptionelle maskineri og andre kromosomale proteiner [6-8]. Nonhistone kromosomale proteiner spiller vigtige roller i fortolkningen af ​​histon kode ved at danne kromatin remodeling komplekser. Både histoner og nonhistone kromosomale proteiner er vigtige for regulering af genekspression, DNA-replikation og DNA-reparation. De deregulering i ekspressionen og aktiviteten af ​​disse proteiner kan resultere i udviklingen af ​​en række sygdomme, såsom cancer [9-13].
I en nylig undersøgelse blev chromodomain helicase DNA-bindende protein 5 (CHD5) identificeret som en hidtil ukendt tumorsuppressorgen (GTS) i neuroblastom [14]. CHD5 tilhører en superfamilie af SWI2 /SnF2-relaterede ATPaser, en stor gruppe af nonhistone kromosomale proteiner. CHD5 koder for en unik kombination af funktionelle domæner, der består af to N-terminale chromodomains, efterfulgt af en SWI2 /SnF2-lignende ATPase /helicase domæne og et DNA-bindende domæne [14]. Ved at regulere chromatin struktur, kan CHD5 fremme ekspressionen af ​​p19 ARF der tjener til at stabilisere p53, tumor suppressor inaktiveret i mere end halvdelen af ​​humane cancere [15]. CHD5 er til stede i et gen locus (1p36.31) udgår i ca. 35% af neuroblastom [16]. CHD5 mentes tidligere at være specifikt udtrykkes i nervesystemet, men dens rolle i cancer i andre væv er begyndt at dukke [17]. CHD5 genet blev fundet signifikant slettet i gliom [18]. Bortset fra gendeletion, kan CHD5 undertrykkes ved andre mekanismer. I nogle tilfælde af neuroblastom, er der tegn på, at CHD5 ekspression epigenetisk undertrykkes af promotor hypermethylering [19], selv om denne observation ikke blev bekræftet af en anden undersøgelse [20]. For nylig er der fundet den CHD5 promotoren, der skal methyleres i små delmængder af bryst (4,4%), colon (10%), ovarie (15%) og gliom (17%) tumorer [17, 20], hvilket tyder epigenetisk inaktivering af CHD5 ved methylering kan spille en delvis rolle i tumorigenese i disse væv. Her fandt vi, at i modsætning til andre typer af kræft rapporteret hidtil, CHD5 var ofte hypermethyleret i gastrisk cancer (73% af tumorer og 100% cellelinjer). Den ektopiske udtryk for CHD5 i gastriske kræftceller ført til en betydelig væksthæmning. Denne slående korrelation af epigenetiske undertrykkelse af CHD5 og mavekræft foreslår en hidtil ukendt sammenhæng mellem dette TSG og gastrisk tumorigenese.
Metoder
Tissue kultur og RNA /DNA-ekstraktion
Alle gastrisk cancer cellelinier (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 og NCI-N87) blev opnået fra Riken Gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japan) og American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle cancer cellelinjer blev etableret fra carcinomer af gastriske epitelceller. Medmindre det specifikt er angivet, celler blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO 2, og 95% fugtighed. For farmakologisk demethylering blev celler behandlet med 5 pM 5-aza-2'-deoxycytidin (Aza) (Sigma, St. Louis, MO, USA) i tre på hinanden følgende dage [21]. Aza var genopfyldes hver 24 timer. En tilsvarende koncentration af vehikel (DMSO) blev anvendt som kontrol. For de primære væv, blev de normale gastriske væv defineret som ikke-inflammation og ikke-tumorvæv. Alle gastriske carcinoma væv er adenocarcinom væv. Total RNA og genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger.
Kvantitativ real time RT-PCR
revers transskription blev udført under anvendelse af 1 ug totalt RNA med revers transkription System (Promega, Madison , WI, USA). MRNA ekspressionsniveauer af CHD5 blev bestemt ved kvantitativ realtids-RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Glyceraldehyd-3-phosohate dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol af RNA integritet. Primere anvendt til CHD5 RT-PCR var CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC og CHD5-R:. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
Methylering specifik PCR (MSP)
Methylering status CHD5 blev bestemt ved MSP ved hjælp bisulfat modificeret genomisk DNA som template. Genomisk DNA blev behandlet med bisulfit med Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) ifølge protokollen tilvejebragt. MSP blev udført i 40 cykler med annealing temperatur ved 62 ° C, som tidligere beskrevet [22]. Methylering-specifikke primere var: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (fra -525 til -506 i forhold til transkriptionsstartsitet) og CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (fra -438 til -418), og unmethylation-specifikke primere var: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT og CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Alle primere blev bekræftet tidligere for ikke at forstærke nogen unbisulfited DNA
Bisulfite genom sekventering (BGS)
Bisulfite-behandlede DNA blev opformeret ved hjælp BGS primere, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (fra -724 til -701) og CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (fra -324 til -301). PCR-produkterne blev renset med ILLUSTRERET GFX ™ PCR og gel band rensning kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) og klonet ind pCR4-TOPO vektor til sekventering (Invitrogen). Mindst 6 kolonier blev tilfældigt valgt til plasmid ekstraktion og sekventering analyse.
Konstruktion af CHD5 ekspressionsplasmider
CHD5 ekspressionsplasmid blev konstrueret ved kloning af fuldlængde CHD5 åbne læseramme i mammale ekspressionsvektor pcDNA3.1. Den CHD5 åbne læseramme blev amplificeret fra normal mave cDNA under anvendelse high fidelity PFU DNA-polymerase (Invitrogen) og klonet ind i pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Efter sekventering validering blev insertet subklonet i pcDNA3.1 med restriktionsenzymerne Hind III og Xba I.
Kolonidannelse assay
forbigående transficerede AGS celler med tomme pcDNA3.1 eller pcDNA3.1-CHD5 blev anvendt til monolag kolonidannelse assayet. Celler blev dyrket natten over i en 12-brønds plade (1,0 x 10 5 /brønd) og transficeret med pcDNA3.1 eller CHD5-udtrykkende vektor ved anvendelse af lipofectamin ™ 2000 (Invitrogen). 48 timer senere, transfektanterne blev genudpladet i tre eksemplarer og dyrket i 10-15 dage i komplet RPMI1640 medium indeholdende G418 (400 ug /ml). Overlevende kolonier blev farvet med Gentian Violet efter methanol fiksering og kolonier, der overstiger vis størrelse (≥ 50 celler) blev talt. Forsøgene blev gentaget tre gange.
Resultater Salg Nedregulering af CHD5 ekspression i gastriske cancercellelinier
Ekspressionen af ​​CHD5 i gastrisk cancer cellelinjer blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Mens CHD5 var stærkt udtrykt i normal gastrisk væv, blev dens udtryk nedreguleret i alle 7 gastrisk cancer cellelinier (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 og NCI-N87 SNU1 og SNU16) (fig. 1). Figur 1 CHD5 nedreguleres i gastriske cancercellelinier. Ekspressionen af ​​CHD5 i gastrisk cancer cellelinjer blev bestemt ved RT-PCR. GAPDH blev anvendt til at normalisere CHD5 ekspression. Den normale mave væv (mave) blev anvendt som reference. Resultater af kvantitativ real-time RT-PCR blev vist i øvre panel og resultatet af konventionelle RT-PCR blev vist i nederste panel.
Promotor hypermethylering af CHD5 i gastrisk cancer-cellelinjer og primære gastriske carcinoma væv
Et typisk CpG Island (CGI) blev fundet omkring CHD5 exon 1 ved hjælp af følgende kriterier: GC-indhold > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, og længde > 500 bp (figur 2A.). status methylering af denne CGI i gastrisk cancer celler blev bestemt ved methylering specifikke PCR (MSP). Som vist i fig. 2B, hel eller delvis methylering blev påvist i alle 7 gastrisk cancer cellelinjer vi undersøgte. I overensstemmelse med de data om gastriske cellelinier blev CHD5 promotoren også methyleret i de fleste primære gastriske testede carcinoma væv (73%, 11/15) (fig. 2C). Vigtigt er, methylering af CHD5 promotoren var enten uopdaget eller svagt detekterbar i normale væv der støder op til tumorer i de samme patienter og i gastriske væv fra normale individer. Desuden blev methylering af CHD5 promotoren i gastrisk cancer-cellelinjer og gastriske carcinoma væv bekræftes ved bisulfit genom sekventering (BGS) (fig. 2D). Tilsammen blev CHD5 overvejende stumme i gastrisk cancer og promotor hypermethylering syntes at være den vigtigste mekanisme CHD5 silencing i tumorigenese af dette væv. Figur 2 CHD5 promotoren hypermethyleret i gastrisk cancer. A, CHD5 har en typisk CpG øen (CGI) omkring dens exon 1. CGI blev afbildet ved GeneTool program. Positionerne af BGS og MSP primere blev angivet som pile. B, status for methylering af CHD5 promotor i gastrisk cancer celler blev bestemt ved methylering specifik PCR. M: methylering; U: unmethylation. C, status for methylering af CHD5 promotoren i primære gastrisk cancer væv blev bestemt ved methylering specifik PCR som i B. Normale gastriske væv og tilstødende ikke-tumorvæv blev anvendt som kontroller. N1 og N2 er normale gastriske væv. T1 og T2 angiver gastriske carcinoma væv mens A1 og A2 betegner hosliggende ikke-tumorvæv. Repræsenteret resultater blev vist. D, Methylering af CHD5 promotor i gastrisk cancer cellelinjer og primære gastrisk karcinom væv blev bekræftet af BGS. Hver cirkel angiver en CpG websted og cirkler udfyldt sort repræsenterer methylerede CpG sites. En række af cirkler repræsenterer en enkelt koloni.
Opregulering af CHD5 udtryk efter Aza behandling
For yderligere at bekræfte promotor CGI hypermethylering-medieret CHD5 lyddæmpning i gastrisk cancer cellelinjer, CHD5 udtryk i AGS og Kato III før og efter demethyleringsreagens blev analyseret Aza behandling. Begge cellelinier udviser fuldstændig methylering af CHD5 promotoren. CHD5 ekspression i disse to cellelinjer blev forøget markant efter Aza-induceret demethylering af CHD5 promotoren (fig. 3A og 3B), hvilket viser, at CHD5 faktisk er epigenetisk tavs i gastrisk cancer. Figur 3 Farmakologisk demethylering reaktiverer CHD5 udtryk i gastrisk cancer cellelinjer. A, Relative CHD5 udtryk før og efter Aza behandling blev bestemt ved RT-PCR som i fig. 1. GAPDH blev anvendt til at normalisere skabelonen beløb. B er demethylering af CHD5 promotoren i AGS celler efter Aza behandling bekræftet af BGS som i fig. 2D.
Vækstinhibitorisk funktion af CHD5
tumorsuppressionsaktivitet ejendom CHD5 i gastriske cancerceller blev undersøgt ved en forstærkning af funktion strategi. Full åben læseramme (ORF) af CHD5 blev klonet i mammale ekspressionsvektor pcDNA3.1. Virkningen af ​​ektopisk CHD5 ekspression på væksten af ​​mavekræft celler AGS blev bestemt med monolag kolonidannelse assayet. Den tvungne ekspression af CHD5 i AGS celler blev bekræftet ved RT-PCR (fig. 4A). Antallet af dannede kolonier på pladen af ​​celler, der overudtrykker CHD5 var signifikant reduceret (p
< 0,01) (fig 4B og 4C.), Hvilket indikerer, at CHD5 kan undertrykke væksten af ​​gastriske cancerceller. Figur 4 CHD5 inhiberer vækst af gastrisk cancercellelinie AGS. Virkningen af ​​ektopisk CHD5 ekspression på tumorcellevækst blev undersøgt ved monolag kolonidannelse assayet. A, CHD5 ekspression i AGS-celler efter transfektion blev bestemt ved RT-PCR. Fotografiet af kolonier dannet af AGS celler transficeret med pcDNA3.1 (vektor) eller pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) blev vist i B. C, Kvantitative analyser af koloni-numre er vist som værdier for middelværdi ± standardafvigelse. P
værdier blev beregnet under anvendelse af t-test. Stjernen angiver statistisk signifikant forskel (p
< 0,01).
Diskussion
I løbet af de sidste mange år har mange GTS vist sig at være epigenetisk inaktiveret i gastrisk kræft, hvilket indikerer, at epigenetisk inaktivering af GTS er en større molekylære ændringer i processen med gastrisk carcinogenese [22-25]. I denne undersøgelse blev CHD5 identificeret som en anden potentiel TSG hvis epigenetisk inaktivering kan bidrage til gastrisk carcinogenese. Det blev ofte nedreguleret gennem promotor hypermethylering i gastrisk cancer cellelinjer. Den ektopiske ekspression af CHD5 førte til vækstinhibering af gastriske cancerceller, hvilket indikerer, at CHD5 fungerer som en TSG epigenetisk stumme i gastrisk cancer.
Promotor hypermethylering af CHD5 i cancer er blevet observeret i andre cancere [17, 20]. Imidlertid blev forekomsten af ​​CHD5 promotor-methylering i gastrisk cancer-cellelinjer og tumorer, fundet i denne undersøgelse at være relativt høj, sammenlignet med hyppigheden af ​​CHD5 methylering i andre cancere (generelt under 20%) [17, 20]. Selvfølgelig bør flere prøver anvendes til at bekræfte dette resultat med de samme MSP primere i de følgende undersøgelser. Ikke desto mindre vores fund tyder på, at CHD5 inaktivering kan være medieret af forskellige mekanismer i forskellige væv. Henviser CHD5 inaktiveres gennem kopiantal abnormitet i forskellige cancerformer [15, 16], komparativ genomisk hybridisering (CGH) indikerede, at 1p36, at CHD5-holdige gen locus, ikke signifikant ubalance i gastriske cancere [26]. I stedet som vist i denne undersøgelse, CHD5 synes at være bragt til tavshed overvejende af promotor hypermethylering i mavekræft.
Der er stigende tegn på, at hypermethylering fra TSG promotor er en af ​​de store molekylære ændringer i udviklingen af ​​kræft. Den høje forekomst af CHD5 promotor hypermethylering i mavekræft kan udforskes ikke kun som en gastrisk kræft diagnose, men også prognose forudsigelse. Til dette formål er det vigtigt at karakterisere CHD5 promotor-methylering i association med kliniske karakteristika, såsom alder, køn, H. pylori-infektion, tumorklassificering, Lauren klassificering og differentiering. I betragtning af, at den høje heterogenitet af primære gastrisk karcinom væv, methylering analyser med højere opløsning, såsom kvantitativ methylering specifik analyse ved hjælp sequenom eller Taqman real-time PCR vil være nyttigt at vurdere, om CHD5 promotor methylering er nyttigt for tidlig mavekræft opdagelse og prognose forudsigelse.
Selvom promotor methylering ofte inaktiverer CHD5 i gastrisk cancer cellelinjer, kan vi ikke udelukke tilstedeværelsen af ​​andre mekanismer for tabet funktion CHD5 i mavekræft. CHD5 ekspression er ekstremt lavt i MKN28 og SNU16 (fig. 1), men promotoren for CHD5 var kun delvis methyleret i disse to cellelinjer (fig. 2B), hvilket indikerer, at andre mekanismer kan være ansvarlige for inaktivering af CHD5 i nogle af gastrisk cancer cellelinjer.
Konklusion
CHD5 var ofte nedreguleret gennem promotor hypermethylering i gastriske kræftceller. Den ektopiske ekspression af CHD5 førte til vækstinhibering af gastriske cancerceller, hvilket indikerer, at CHD5 fungerer som et tumorsuppressorgen epigenetisk stumme i gastrisk cancer. Salg erklæringer
Anerkendelser
Vi takker Dr. Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University) for hans uvurderlige rådgivning og teknisk støtte. Beskrevet i dette papir arbejde blev delvist støttet af en bevilling fra Forsknings- Tilskud Rådet for Hongkong særlige administrative område, Kina (projekt nr CityU 160.508).
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 4 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.

• Den prognostiske virkning af epidermal vækstfaktor-receptor i patienter med metastatisk gastrisk cancer
• Laparoskopisk justerbar banded roux-en-y gastrisk bypass som en primær procedure for super-super-overvægtige (BMI > 60 kg /m2)