CHD5 es el regulado a través de la hipermetilación del promotor en el cáncer gástrico

CHD5 es el regulado a través de la hipermetilación del promotor en el cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

proteínas cromosómicas no histona en concierto con las histonas juegan un papel importante en la replicación y reparación del ADN y en la regulación de la expresión génica. La desregulación de estas proteínas puede contribuir al desarrollo de una variedad de enfermedades tales como el cáncer. Como una proteína nonhistone cromosómico, proteína de unión a ADN helicasa chromodomain 5 (CHD5) recientemente se ha identificado como el producto de un gen supresor de tumor novela (TSG), la promoción de la transcripción de p19 ink4a
y p16 arf
. La inactivación de CHD5 se logró en parte a través de la eliminación genética ya que se encuentra en 1p36, una región frecuentemente elimina en tumores humanos. En este estudio, nuestro objetivo es estudiar la implicación de CHD5 en el cáncer gástrico, el segundo cáncer más común en todo el mundo.
Métodos
expresión CHD5 en un panel de células de cáncer gástrico fueron determinados por RT-PCR cuantitativa. La metilación de CHD5 se evaluó mediante PCR específica de metilación y la secuenciación del genoma de bisulfito. El efecto de CHD5 sobre el crecimiento de células de cáncer gástrico se puso a prueba mediante un ensayo de formación de colonias.
Resultados
expresión CHD5 se había reducido regulado en todas las líneas celulares de cáncer gástrico utilizado (100%, 7/7) y restaurados de manera significativa después desmetilación farmacológica. se detectó metilación del promotor CHD5 en todas las siete líneas celulares de cáncer gástrico y en la mayoría de los tejidos de carcinoma gástrico primario examinados (73%, 11/15). Por último, la expresión ectópica de CHD5 en células de cáncer gástrico llevado a una inhibición significativa del crecimiento.
Conclusión
CHD5 era una ETG epigenetically el regulado en el cáncer gástrico.
Antecedentes
Todos los organismos eucariotas han desarrollado formas elaboradas de empaquetamiento del ADN en la cromatina a través de las interacciones dinámicas de diversas proteínas asociadas al ADN. Tal envase es importante no sólo para el almacenamiento de la información genética con alta fidelidad y la integridad, sino también la transferencia de la información genética del ADN al ARN de una manera fuertemente controlada. Las proteínas que se unen al ADN para formar la cromatina se dividen tradicionalmente en dos clases generales: las histonas y proteínas cromosómicas no histónicas. Las histonas son un grupo de unión al ADN de proteínas altamente conservadas y de sus diversas modificaciones post-traduccionales constituyen el "código de histonas 'que guía el envasado de ADN o remodelación de la cromatina. El código de histonas se inicia, mantiene y se interpreta en gran medida por las proteínas cromosómicas nonhistone [1-4]. Por ejemplo, la acetilación de residuos de lisina en colas de las histonas por histona acetiltransferasas (HAT) neutraliza su carga y disminuye la afinidad de las histonas con el ADN, haciendo ADN accesible para factores de transcripción para iniciar la transcripción de genes. Por el contrario, la desacetilación de estos residuos por histona desacetilasas (HDACs) restaura esta afinidad y se puede retirar el ADN de maquinaria transcripcional [5]. Además de la acetilación, la fosforilación y la metilación de la histona colas son importantes para la asociación dinámica de ADN con la maquinaria transcripcional y otras proteínas cromosómicas [6-8]. proteínas cromosómicas nonhistone juegan un papel importante en la interpretación de código de histonas mediante la formación de complejos de remodelación de la cromatina. Ambos histonas y proteínas cromosómicas no histónicas son importantes para la regulación de la expresión de genes, la replicación del ADN y la reparación del ADN. Las desregulaciones en la expresión y la actividad de estas proteínas podría resultar en el desarrollo de una variedad de enfermedades tales como el cáncer [9-13].
En un estudio reciente, la proteína de unión a ADN helicasa chromodomain 5 (CHD5) se identificó como una nuevo gen supresor de tumores (TSG) en neuroblastoma [14]. CHD5 pertenece a una superfamilia de ATPasas relacionados con SNF2 SWI2 /, un grupo importante de proteínas cromosómicas nonhistone. CHD5 codifica una combinación única de dominios funcionales que consisten en dos chromodomains N-terminal, seguido de un SNF2-como dominio SWI2 /ATPasa /helicasa y un dominio de unión a ADN [14]. Mediante la regulación de la estructura de cromatina, CHD5 puede promover la expresión de p19 arf que funciona para estabilizar p53, el supresor de tumor inactivado en más de la mitad de los cánceres humanos [15]. CHD5 está presente en un locus del gen (1p36.31) suprimido en alrededor del 35% de neuroblastoma [16]. CHD5 se pensaba previamente que se expresa específicamente en el sistema nervioso, pero su papel en el cáncer en otros tejidos está empezando a surgir [17]. gen CHD5 se encontró eliminado significativamente en glioma [18]. Además de la supresión de genes, CHD5 puede ser suprimida por otros mecanismos. En algunos casos de neuroblastoma, hay evidencia de que la expresión CHD5 se epigenetically suprimida por hipermetilación del promotor [19], aunque esta observación no se confirmó en otro estudio [20]. Recientemente, el promotor CHD5 se ha encontrado para ser metilado en pequeños subconjuntos de mama (4,4%), colon (10%), de ovario (15%) y glioma (17%) tumores [17, 20], lo que sugiere silenciamiento epigenético de CHD5 por metilación puede jugar un papel en la tumorigénesis parcial en estos tejidos. Aquí, se encontró que, a diferencia de otros tipos de cáncer reportados hasta ahora, era CHD5 frecuencia hypermethylated en el cáncer gástrico (73% de los tumores y líneas celulares de 100%). La expresión ectópica de CHD5 en células de cáncer gástrico llevó a una inhibición del crecimiento significativa. Esta correlación llamativa de la supresión de la epigenética y el cáncer gástrico CHD5 sugiere una relación previamente desconocida entre este TSG y la tumorigénesis gástrico.
Métodos
El cultivo de tejidos y ARN /extracción de ADN
Todas las líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, snu1, SNU16 y NCI-N87) se obtuvieron a partir de Riken gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japón) y American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Todas las líneas celulares de cáncer se establecieron a partir de carcinomas de células epiteliales gástricas. A menos que se indique específicamente, las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C con 5% de CO 2, y 95% de humedad. Para desmetilación farmacológica, las células fueron tratadas con 5 M 5-aza-2'- desoxicitidina (AZA) (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) durante tres días consecutivos [21]. Aza se reponía cada 24 horas. Una concentración equivalente de vehículo (DMSO) se utilizó como control. Para los tejidos primarios, los tejidos gástricos normales se definen como tejidos no la inflamación y no tumorales. Todos los tejidos de carcinoma gástrico son tejidos de adenocarcinoma. El ARN total y el ADN genómico fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR
inversa reacción de transcripción se realizó utilizando 1 g de ARN total con el sistema de transcripción inversa (Promega, Madison , WI, EE.UU.). Los niveles de expresión de ARNm de la CHD5 se determinaron por tiempo real de RT-PCR SYBR Green Mix Kit maestro cuantitativa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Gliceraldehído-3-phosohate deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como un control interno de la integridad del ARN. Los cebadores utilizados para CHD5 RT-PCR fueron CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC y CHD5-R:. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
PCR específica de metilación (MSP)
estado de metilación de CHD5 se determinó mediante el uso de MSP modificado bisulfato genómico DNA como molde. El ADN genómico se-bisulfito tratados con Zymo ADN Modificación Kit (Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo proporcionado. MSP se llevó a cabo durante 40 ciclos con la temperatura de recocido a 62 ° C, como se describe anteriormente [22]. cebadores específica de metilación fueron: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (-525 a -506 con relación al sitio de inicio de transcripción) y CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (-438 a -418), y específico de no metilación cebadores fueron: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT y CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Todos los cebadores fueron confirmadas previamente para no amplificar cualquier ADN unbisulfited
la secuenciación del genoma de bisulfito (BGS)
tratado con bisulfito de ADN se amplificó utilizando cebadores de BGS, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (-724 a -701) y CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (-324 a -301). Los productos de PCR fueron purificados con Illustra GFX ™ PCR y kit de purificación de gel de banda (ciencias de la vida GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y se clonaron en el vector pCR4-TOPO para la secuenciación (Invitrogen). Al menos 6 colonias se seleccionaron al azar para la extracción de plásmido y análisis de secuenciación.
Construcción de plásmidos de expresión CHD5 comentario El plásmido de expresión CHD5 se construyó por clonación del marco de lectura abierto de longitud completa CHD5 en mamíferos pcDNA3.1 vector de expresión. El marco de lectura abierto CHD5 se amplificó a partir de ADNc de estómago normal el uso de alta fidelidad Pfu ADN polimerasa (Invitrogen) y se clonó en pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Después de la validación de secuenciación, el inserto se subclonó en pcDNA3.1 con las enzimas de restricción Hind III y Xba I.
ensayo de formación de colonias de
transfectadas transitoriamente células AGS con pcDNA3.1 vacío o pcDNA3.1-CHD5 se utilizaron para la monocapa ensayo de formación de colonias. Las células se cultivaron durante la noche en una placa de 12 pocillos (1,0 x 10 5 /pocillo) y se transfectaron con el vector pcDNA3.1 o CHD5 expresan utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). 48 horas más tarde, los transfectantes fueron re-sembraron por triplicado y se cultivaron durante 10-15 días en medio RPMI 1640 completo que contiene G418 (400 mg /ml). Las colonias supervivientes se tiñeron con violeta de genciana después de la fijación metanol y colonias que superen determinado tamaño (≥ 50 células) se contaron. Los experimentos se repitieron tres veces.
Resultados
descenso de regulación de la expresión CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico
La expresión de CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico se determinó por RT-PCR cuantitativa. Mientras CHD5 fue altamente expresado en los tejidos gástricos normales, sus expresiones se redujeron regulado en todas las 7 líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 y NCI-N87 snu1 y SNU16) (Fig. 1). Figura 1 CHD5 es el regulado en líneas celulares de cáncer gástrico. La expresión de CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico se determinó por RT-PCR. GAPDH se utilizó para normalizar la expresión CHD5. El tejido del estómago normal (estómago) se utilizó como referencia. Resultados de cuantitativa en tiempo real RT-PCR se muestran en el panel superior y el resultado de la RT-PCR convencional se muestra en el panel inferior.
Hipermetilación del promotor de CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico y los tejidos de carcinoma gástrico primario
Una típica isla CpG (CGI) fue encontrado alrededor de CHD5 exón 1 utilizando los siguientes criterios: contenido de GC > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, y la longitud > 500 pb (Fig. 2A). El estado de metilación de esta CGI en células de cáncer gástrico se determinó mediante PCR específica de metilación (MSP). Como se muestra en la Fig. 2B, se detectó metilación total o parcial en todos 7 líneas celulares de cáncer gástrico que examinamos. En consonancia con los datos en líneas de células gástricas, el promotor CHD5 también fue metilado en la mayoría de los tejidos de carcinoma gástrico primario analizadas (73%, 11/15) (Fig. 2C). Es importante destacar que la metilación del promotor CHD5 era o no detectada o débilmente detectable en los tejidos normales adyacentes a los tumores de los mismos pacientes y en los tejidos gástricos de sujetos normales. Por otra parte, la metilación del promotor de CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico y los tejidos de carcinoma gástrico fue confirmada por la secuenciación del genoma de bisulfito (BGS) (Fig. 2D). Tomados en conjunto, CHD5 fue silenciado predominantemente en el cáncer gástrico y la hipermetilación del promotor parecía ser el principal mecanismo de silenciamiento CHD5 en la tumorigénesis de este tejido. promotor CHD5 Figura 2 se hypermethylated en el cáncer gástrico. A, CHD5 tiene una típica isla CpG (CGI) en torno a su exón 1. CGI fue trazada por el programa GeneTool. Las posiciones de BGS y MSP cebadores se indican como flechas. B, el estado de metilación del promotor de CHD5 en células de cáncer gástrico se determinó mediante PCR específica de metilación. M: metilación; U: no metilación. C, el estado de metilación del promotor de CHD5 en tejidos de cáncer gástrico primario se determinó mediante PCR específica de metilación como en B. tejidos gástrica normal y tejidos no tumorales adyacentes se utilizaron como controles. N1 y N2 son los tejidos gástricos normales. T1 y T2 indican los tejidos de carcinoma gástrico, mientras que A1 y A2 representan tejidos no tumorales adyacentes. Se muestran los resultados representados. D, la metilación del promotor de CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico y los tejidos de carcinoma gástrico primario fue confirmada por BGS. Cada círculo indica un sitio y círculos rellenos en negro representan CpG metilado sitios CpG. Una fila de círculos representa una sola colonia.
Sobre regulación de la expresión CHD5 después del tratamiento Aza
Para confirmar aún más el promotor hipermetilación CGI mediada por silenciamiento CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico, expresiones CHD5 en AGS y Kato III antes y después de reactivo de desmetilación se analizaron tratamiento Aza. Ambas líneas celulares presentan metilación completa del promotor CHD5. expresión CHD5 en estas dos líneas celulares se incrementaron significativamente después de la desmetilación inducida por Aza de promotor CHD5 (Fig. 3A y 3B), demostrando que es, en efecto CHD5 epigenetically silenciado en cáncer gástrico. Figura 3 desmetilación farmacológico se reactiva la expresión CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico. A, expresiones CHD5 relativa antes y después del tratamiento Aza se determinaron por RT-PCR como en la Fig. 1. GAPDH se utilizó para normalizar la cantidad de plantilla. B, La desmetilación del promotor en las células AGS CHD5 después del tratamiento Aza fue confirmada por BGS como en la Fig. 2D.
Función inhibidora del crecimiento de CHD5
La propiedad de supresión tumoral CHD5 en células de cáncer gástrico fue investigado por una estrategia de ganancia de función. Marco completo de lectura abierto (ORF) de CHD5 se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1 mamíferos. El efecto de la expresión CHD5 ectópico en el crecimiento de células de cáncer gástrico AGS se determinó con el ensayo de formación de colonias monocapa. La expresión forzada de CHD5 en células AGS fue confirmada por RT-PCR (Fig. 4A). El número de colonias formadas en la placa por las células que sobreexpresan CHD5 se redujo significativamente (p
< 0,01) (Fig 4B y 4C.), Lo que indica que CHD5 puede suprimir el crecimiento de células de cáncer gástrico. Figura 4 CHD5 inhibe el crecimiento de la línea celular de cáncer gástrico AGS. El efecto de la expresión CHD5 ectópico en el crecimiento de células tumorales se investigó mediante el ensayo de formación de colonias monocapa. A, expresión en células AGS CHD5 después de la transfección se determinó por RT-PCR. La fotografía de colonias formadas por células AGS transfectadas con pcDNA3.1 (vector) o pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) se muestra en B. C, análisis cuantitativos de número de colonias se muestran como valores de la media ± desviación estándar. P
valores se calcularon utilizando la prueba t de Student. El asterisco indica diferencia estadísticamente significativa (p Hotel < 0,01).
Discusión En los últimos años, muchos ETG se han encontrado para ser inactivado epigenético en cáncer gástrico, lo que indica que el silenciamiento epigenético de las ETG es uno de alteraciones moleculares importantes en el proceso de la carcinogénesis gástrica [22-25]. En este estudio, CHD5 se identificó como otro TSG potencial cuya inactivación epigenética puede contribuir a la carcinogénesis gástrica. Fue con frecuencia el regulado a través de la hipermetilación del promotor en líneas celulares de cáncer gástrico. La expresión ectópica de CHD5 llevó a la inhibición del crecimiento de células de cáncer gástrico, indicando que las funciones CHD5 como un TSG epigenetically silenciados en el cáncer gástrico.
Hipermetilación del promotor de CHD5 en el cáncer se ha observado en otros tipos de cáncer [17, 20]. Sin embargo, se descubrió que la incidencia de CHD5 promotor de la metilación en líneas celulares de cáncer gástrico y tumores en este estudio a ser relativamente alta, en comparación con la frecuencia de metilación CHD5 en otros tipos de cáncer (generalmente por debajo de 20%) [17, 20]. Por supuesto, más muestras deben ser utilizados para confirmar este resultado con los mismos cebadores MSP en los siguientes estudios. Sin embargo, nuestro hallazgo sugiere que la inactivación CHD5 podría estar mediada por mecanismos diferentes en diferentes tejidos. Mientras que CHD5 se inactiva a través del número de copias anormalidad en diversos tipos de cáncer [15, 16], la hibridación genómica comparada (CGH) indicaron que 1p36, el locus del gen que contiene CHD5-, no está desequilibrado de forma significativa en el cáncer gástrico [26]. En lugar de ello, como se muestra en este estudio, CHD5 parece ser silenciados por hipermetilación del promotor predominantemente en el cáncer gástrico.
Hay una creciente evidencia de que la hipermetilación del promotor de TSG representa una de las alteraciones moleculares importantes en el desarrollo del cáncer. La alta incidencia de CHD5 hipermetilación del promotor en el cáncer gástrico puede ser explorado no sólo como un diagnóstico de cáncer gástrico sino también prognosis predicción. Con este fin, es importante para caracterizar la metilación promotor CHD5 en asociación con características clínicas, tales como la edad, el género, la infección por H. pylori, el grado del tumor, la clasificación de Lauren y la diferenciación. Teniendo en cuenta que la gran heterogeneidad de los tejidos de carcinoma gástrico primario, los análisis de metilación con una resolución más alta, tales como el análisis específico de metilación cuantitativa utilizando Sequenom o TaqMan PCR en tiempo real será útil para evaluar si el promotor CHD5 metilación es útil para la detección del cáncer gástrico precoz y la predicción del pronóstico. a pesar de que la metilación del promotor
frecuencia inactiva CHD5 en líneas celulares de cáncer gástrico, no podemos excluir la presencia de otros mecanismos para la función de pérdida de CHD5 en el cáncer gástrico. expresión CHD5 es extremadamente baja en MKN28 y SNU16 (Fig. 1), sin embargo, el promotor de CHD5 fue sólo parcialmente metilado en estas dos líneas celulares (Fig. 2B), lo que indica que otros mecanismos pueden ser responsables de la silenciamiento de CHD5 en algunos de líneas celulares de cáncer gástrico.
Conclusión
CHD5 era con frecuencia el regulado a través de la hipermetilación del promotor en células de cáncer gástrico. La expresión ectópica de CHD5 dio lugar a la inhibición del crecimiento de células de cáncer gástrico, lo que indica que las funciones CHD5 como un gen supresor tumoral epigenetically silenciados en el cáncer gástrico.
Declaraciones
Agradecimientos
Se agradece al Dr. Jin Hongchuan (Centro de Investigación Biomédica, hospital Sir Run Run Shaw, de la Universidad de Zhejiang) por su inestimable asesoramiento y apoyo técnico. El trabajo descrito en este trabajo fue parcialmente apoyado por una beca del Consejo de Ayudas a la Investigación de la Región Administrativa Especial de Hong Kong, China (Proyecto N CityU 160508). Archivos originales presentados
de los autores de las imágenes
A continuación se presentan la enlaces a los archivos originales presentados los autores de las imágenes. 'archivo original para la figura 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg autores 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Autores archivo original para la figura 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg autores archivo original para la figura 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg autores archivo original de la figura 4 Conflicto de intereses
Los autores declaran que tienen intereses en competencia.

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