CHD5 est régulée à la baisse par hyperméthylation de promoteur dans le cancer gastrique

CHD5 est régulée à la baisse par hyperméthylation de promoteur dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
histones protéines chromosomiques, de concert avec les histones jouent un rôle important dans la réplication et la réparation de l'ADN et dans la régulation de l'expression génique. La dérégulation de ces protéines peuvent contribuer au développement d'une variété de maladies telles que le cancer. Comme une protéine non histones chromosomique, la protéine de liaison d'ADN hélicase chromodomaine 5 (CHD5) a récemment été identifié comme étant le produit d'un gène suppresseur roman de tumeur (TSG), la promotion de la transcription de p19 INK4a
et p16 arf
. L'inactivation du CHD5 a été réalisée en partie par délétion génétique, car il se trouve à 1p36, une région fréquemment supprimée dans les tumeurs humaines. Dans cette étude, nous cherchons à étudier l'implication des CHD5 dans le cancer gastrique, le deuxième cancer le plus répandu dans le monde entier.
Méthodes
expression CHD5 dans un panneau de cellules de cancer gastrique ont été déterminées par RT-PCR quantitative. La méthylation de CHD5 a été évaluée par méthylation PCR spécifique et le séquençage du génome bisulfite. L'effet de CHD5 sur la croissance des cellules de cancer gastrique a été testé par un essai de formation de colonies.: Résultats
expression CHD5 été régulés à la baisse dans toutes les lignées cellulaires de cancer gastrique utilisé (100%, 7/7) et significativement restaurés après déméthylation pharmacologique. Méthylation du promoteur CHD5 a été détecté dans toutes les sept lignées cellulaires de cancer de l'estomac et dans la plupart des tissus de carcinome gastrique primaire examiné (73%, 15/11). Enfin, l'expression ectopique de CHD5 dans les cellules de cancer gastrique conduit à une inhibition de la croissance significative.
Conclusion
CHD5 était un TSG épigénétique régulée à la baisse dans le cancer gastrique.
Contexte
Tous les organismes eucaryotes ont développé des moyens élaborés d'emballage de l'ADN en chromatine à travers les interactions dynamiques de diverses protéines associées à l'ADN. Un tel conditionnement est important non seulement pour le stockage de l'information génétique avec une grande fidélité et son intégrité, mais aussi le transfert de l'information génétique de l'ADN à l'ARN d'une façon étroitement contrôlée. Les protéines qui se lient à l'ADN pour former la chromatine sont traditionnellement divisés en deux catégories générales: histones et des protéines chromosomiques non histones. Les histones sont un groupe de protéines de liaison à l'ADN hautement conservé et leurs diverses modifications post-traductionnelles constituent le «code des histones» qui guide l'emballage de l'ADN ou de remodelage de la chromatine. Le code histone est lancé, maintenu et interprété en grande partie par des protéines chromosomiques non histones [1-4]. Par exemple, l'acétylation des résidus de lysine sur histones queues par histones acétyltransférases (HAT) neutralise leur charge et diminue l'affinité des histones avec de l'ADN, ce qui rend l'ADN accessible aux facteurs de transcription pour initier la transcription des gènes. A l'inverse, la désacétylation de ces résidus par histone désacétylases (HDAC) restaure cette affinité et peut retirer l'ADN de machinerie transcriptionnelle [5]. En plus de l'acétylation, la phosphorylation et la méthylation des queues d'histones sont importants pour l'association dynamique de l'ADN avec des machines de transcription et d'autres protéines chromosomiques [6-8]. des protéines chromosomiques non histones jouent un rôle important dans l'interprétation du code histone en formant des complexes de remodelage de la chromatine. Les deux histones et des protéines chromosomiques non histones sont importants pour la régulation de l'expression génique, la réplication de l'ADN et la réparation d'ADN. Les dérèglements de l'expression et l'activité de ces protéines pourraient se traduire par le développement d'une variété de maladies telles que le cancer [9-13].
Dans une étude récente, une protéine de liaison à l'ADN hélicase à chromodomaine de 5 (CHD5) a été identifié en tant que nouveau gène suppresseur de tumeur (STG) dans le neuroblastome [14]. CHD5 appartient à une superfamille de ATPases SWI2 /SNF2 liés, un groupe important de protéines chromosomiques non histones. CHD5 code pour une combinaison unique de domaines fonctionnels consistant en deux chromodomains N-terminale, suivie d'un /SNF2 domaine SWI2 analogue ATPase /hélicase et un domaine de liaison à l'ADN [14]. Par le contrôle de la structure chromatinienne, CHD5 peut favoriser l'expression de la p19 arf qui sert à stabiliser p53, le gène suppresseur de tumeur inactivée dans plus de la moitié des cancers humains [15]. CHD5 est présent à raison d'un locus de gène (1p36.31) a été supprimé dans environ 35% des neuroblastomes [16]. CHD5 a déjà été pensé pour être spécifiquement exprimée dans le système nerveux, mais son rôle dans le cancer dans d'autres tissus commence à émerger [17]. gène CHD5 a été trouvé significativement supprimée dans les gliomes [18]. En dehors de la suppression du gène, CHD5 peut être supprimée par d'autres mécanismes. Dans certains cas de neuroblastome, il existe des preuves que l'expression de CHD5 est épigénétique supprimée par le promoteur hypermethylation [19], bien que cette observation n'a pas été confirmée par une autre étude [20]. Récemment, le promoteur CHD5 a été trouvée être méthylé dans les petits sous-ensembles de sein (4,4%), du côlon (10%), de l'ovaire (15%) et le gliome (17%), les tumeurs [17, 20], ce qui suggère silençage épigénétique de CHD5 par méthylation peut jouer un rôle partiel dans la tumorigenèse dans ces tissus. Ici, nous avons constaté que, contrairement à d'autres types de cancer signalés jusqu'à présent, était fréquemment CHD5 hyperméthylé dans le cancer gastrique (73% des tumeurs et des lignes 100% des cellules). L'expression ectopique de CHD5 dans les cellules de cancer gastrique conduit à une inhibition de croissance significative. Cette corrélation frappante de la suppression épigénétique de CHD5 et le cancer gastrique suggère une relation inconnue entre ce TSG et la tumorigenèse gastrique.
Méthodes
culture de tissus et de l'ARN /extraction d'ADN
Toutes les lignées cellulaires de cancer gastrique (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 et NCI-N87) ont été obtenus à partir de Riken Gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japon) et American type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Toutes les lignées cellulaires cancéreuses ont été établies à partir des carcinomes des cellules épithéliales gastriques. Sauf indication spécifique, les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplémenté avec du sérum de veau fœtal à 10% à 37 ° C avec 5% de CO 2, et 95% d'humidité. Pour déméthylation pharmacologique, les cellules ont été traitées avec 5 pM de 5-aza-2'-désoxycytidine (Aza) (Sigma, St Louis, MO, USA) pendant trois jours consécutifs [21]. Aza a été renouvelé tous les 24 heures. Une concentration équivalente du véhicule (DMSO) a été utilisé comme témoin. Pour les tissus primaires, les tissus gastriques normaux ont été définis comme des tissus non inflammatoires et non tumorales. Tous les tissus de carcinomes gastriques sont des tissus d'adénocarcinome. L'ARN total et l'ADN génomique a été extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Le plus quantitative en temps réel RT-PCR inverse
réaction de transcription a été réalisée en utilisant 1 pg d'ARN total avec le système de transcription inverse (Promega, Madison , WI, USA). Les niveaux de l'CHD5 d'expression de l'ARNm ont été déterminées par temps réel Kit RT-PCR SYBR Green Master Mix quantitative (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Glycéraldéhyde-3-phosohate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisé comme témoin interne de l'intégrité de l'ARN. Amorces utilisées pour CHD5 RT-PCR étaient CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC et CHD5-R:. Méthylation spécifique PCR (MSP) de 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
état méthylation de CHD5 a été déterminée par MSP utilisant bisulfate modifié génomique ADN comme matrice. L'ADN génomique a été traité au bisulfite avec Zymo Modification Kit ADN (Zymo Research, Orange, CA, USA) selon le protocole fourni. MSP a été effectuée pendant 40 cycles avec une température d'hybridation à 62 ° C, comme décrit précédemment [22]. des amorces spécifiques de méthylation sont les suivantes: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (-525 à -506 par rapport au site de début de transcription) et CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (-438 à -418) et de la non-méthylation spécifique des amorces étaient les suivantes: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT et CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Toutes les amorces ont été confirmées précédemment pour ne pas amplifier tout ADN unbisulfited
séquençage du génome bisulfite (BGS)
bisulfite ADN traité a été amplifié en utilisant des amorces BGS, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (-724 à -701) et CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (-324 à -301). Les produits de PCR ont été purifiés avec Illustra GFX ™ PCR et le kit de purification de bande de gel (GE Healthcare sciences de la vie, Uppsala, Suède) et clonées dans le vecteur pCR4-TOPO pour le séquençage (Invitrogen). Au moins 6 colonies ont été choisies au hasard pour l'extraction du plasmide et l'analyse de séquençage.
Construction de CHD5 plasmides d'expression
Le plasmide d'expression de CHD5 a été construit par clonage de la pleine longueur CHD5 cadre de lecture ouvert en vecteur d'expression mammifère pcDNA3.1. Le cadre de lecture ouvert CHD5 a été amplifié à partir d'ADNc d'estomac normal en utilisant une haute fidélité Pfu DNA polymerase (Invitrogen) et clone dans pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Après validation de séquençage, l'insert est sous-cloné dans pcDNA3.1 avec les enzymes de restriction Hind III et la formation de colonies de dosage de Xba I.
transfectées transitoirement les cellules AGS avec pcDNA3.1 vide ou pcDNA3.1-CHD5 ont été utilisées pour monocouche la formation de colonies dosage. Les cellules ont été cultivées pendant une nuit dans une plaque de 12 puits (1,0 x 10 5 /puits) et transfectées avec pcDNA3.1 ou le vecteur exprimant CHD5 utilisant de la lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen). 48 heures plus tard, les transfectants ont été ré-étalées en triple exemplaire et cultivées pendant 10-15 jours dans un milieu RPMI 1640 complet contenant G418 (400 pg /ml). les colonies survivantes ont été colorées avec du violet de gentiane après fixation du méthanol et des colonies dépassant certaine taille (≥ 50 cellules) ont été comptées. Les résultats de ces expériences ont été répétées trois fois.
régulation négative de l'expression CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique L'expression de ce membre CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique a été déterminée par RT-PCR quantitative. Alors que CHD5 a été fortement exprimée dans les tissus gastriques normales, ses expressions ont été régulés à la baisse dans toutes les 7 lignes gastriques de cellules cancéreuses (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 et NCI-N87 SNU1 et SNU16) (Fig. 1). Figure 1 CHD5 est régulée à la baisse dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. L'expression de la CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique a été déterminée par RT-PCR. GAPDH a été utilisée pour normaliser l'expression de CHD5. Le tissu de l'estomac normal (estomac) a été utilisé comme référence. L'hyperméthylation du promoteur de résultats de quantitative en temps réel RT-PCR ont été présentés dans le panneau supérieur et le résultat de la RT-PCR conventionnelle a été montré dans le panneau inférieur. de CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et les tissus de carcinome gastrique primaire
Un typique Île CpG (CGI) a été trouvé autour de CHD5 exon 1 en utilisant les critères suivants: contenu GC > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, et la longueur > 500 pb (figure 2A.). L'état de méthylation de ce CGI dans des cellules de cancer gastrique a été déterminée par PCR spécifique de la méthylation (MSP). Comme on le voit sur la Fig. 2B, la méthylation complète ou partielle a été détectée dans l'ensemble de 7 gastriques lignées cellulaires de cancer que nous avons examinés. En accord avec les données sur les lignées de cellules gastriques, le promoteur de CHD5 a également été méthylé dans la plupart des tissus de carcinome gastrique primaire testés (73%, 15/11) (Fig. 2C). Surtout, la méthylation du promoteur de CHD5 était soit détectée ou faiblement détectable dans les tissus normaux adjacents aux tumeurs des mêmes patients et dans les tissus gastriques des sujets normaux. En outre, la méthylation du promoteur de CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et les tissus de carcinome gastrique a été confirmée par le séquençage du génome du bisulfite (BGS) (Fig. 2D). Pris ensemble, CHD5 a été essentiellement réduite au silence dans le cancer gastrique et promoteur hypermethylation semblait être le principal mécanisme de CHD5 taire dans la tumorigenèse de ce tissu. Figure 2 CHD5 promoteur est hyperméthylés dans le cancer gastrique. A, CHD5 a une île typique CpG (CGI) autour de son exon 1. CGI a été tracée par le programme GeneTool. Les positions de BGS et MSP amorces ont été indiquées par des flèches. B, l'état de méthylation de promoteur CHD5 dans les cellules de cancer gastrique a été déterminée par PCR spécifique de la méthylation. M: méthylation; U: méthylation. C. L'état de méthylation de promoteur CHD5 dans les tissus du cancer gastrique primaire a été déterminée par PCR spécifique de la méthylation comme dans B. tissus gastriques normaux et les tissus non tumoraux adjacents ont été utilisées comme témoins. N1 et N2 sont des tissus gastriques normaux. T1 et T2 indiquent les tissus de carcinome gastrique tandis que A1 et A2 représentent les tissus non tumoraux adjacents. les résultats représentés ont été présentés. D, la méthylation du promoteur CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et les tissus de carcinome gastrique primaire a été confirmée par BGS. Chaque cercle indique un seul site CpG et les cercles remplis en noir représentent méthylés sites CpG. Une rangée de cercles représente une seule colonie.
Up-régulation de l'expression CHD5 après le traitement Aza
Pour confirmer davantage le promoteur CGI hypermethylation médiée CHD5 silencing dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, expressions CHD5 dans AGS et Kato III avant et après que le réactif de déméthylation traitement Aza ont été analysés. Les deux lignées cellulaires présentent une méthylation complète du promoteur CHD5. CHD5 expression dans ces deux lignées cellulaires ont augmenté significativement après déméthylation aza-induite du promoteur CHD5 (Fig. 3A et 3B), ce qui démontre que CHD5 est effectivement réduite au silence épigénétique dans le cancer gastrique. La figure 3 déméthylation PHARMACOLOGIQUE réactive expression CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. A, des expressions relatives CHD5 avant et après traitement Aza ont été déterminées par RT-PCR comme sur la Fig. 1. GAPDH a été utilisée pour normaliser la quantité de modèle. B, déméthylation du CHD5 promoteur dans les cellules AGS après traitement Aza a été confirmée par BGS comme dans la figure. La fonction de croissance inhibiteur de 2D. de CHD5
La propriété de suppression de tumeur CHD5 dans les cellules de cancer gastrique a été étudiée par une stratégie de gain de fonction. Plein cadre de lecture ouvert (ORF) de CHD5 a été cloné dans vecteur d'expression mammifère pcDNA3.1. L'effet de l'expression ectopique CHD5 sur la croissance des cellules cancéreuses gastriques AGS a été déterminée par essai de formation de colonies monocouche. L'expression forcée de CHD5 dans les cellules AGS a été confirmée par RT-PCR (Fig. 4A). Le nombre de colonies formées sur la plaque par des cellules surexprimant CHD5 a été significativement réduite (p
< 0,01) (figure 4B et 4C.), Indiquant que CHD5 peut inhiber la croissance des cellules cancéreuses gastriques. La figure 4 CHD5 inhibe la croissance de la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS. L'effet de l'expression ectopique CHD5 sur la croissance des cellules tumorales a été étudiée par le test de formation de colonies monocouche. Une expression dans les cellules AGS CHD5 après la transfection a été déterminée par RT-PCR. La photographie de colonies formées par les cellules AGS transfectées avec pcDNA3.1 (vector) ou pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) a été montrée dans B. C Analyses quantitatives des nombres de colonies sont présentés sous forme de valeurs de moyenne ± écart type. les valeurs P ont été calculées de l'aide du test de l'étudiant. L'astérisque indique une différence statistiquement significative (p
< 0,01). Discussion de
Au cours des dernières années, de nombreux TSG ont été trouvés pour être inactivé épigénétique dans le cancer gastrique, ce qui indique que le silençage épigénétique de TSG est un des grandes altérations moléculaires dans le processus de cancérogenèse gastrique [22-25]. Dans cette étude, CHD5 a été identifié comme un autre TSG potentiel dont l'inactivation épigénétique peut contribuer à la cancérogenèse gastrique. Il a souvent été régulée à la baisse par hyperméthylation de promoteur dans les lignées cellulaires de cancer gastrique. L'expression ectopique de CHD5 a conduit à l'inhibition de cellules cancéreuses gastriques de croissance, ce qui indique que les fonctions CHD5 comme STG épigénétique réduits au silence dans le cancer gastrique. Du promoteur de l'hyperméthylation CHD5 dans le cancer a été observé dans d'autres cancers [17, 20]. Toutefois, l'incidence de CHD5 méthylation de promoteur dans les lignées et les tumeurs de cellules cancéreuses gastriques a été trouvée dans cette étude pour être relativement élevée, par rapport à la fréquence de méthylation CHD5 dans d'autres cancers (généralement inférieurs à 20%) [17, 20]. Bien entendu, d'autres échantillons doivent être utilisés pour confirmer ce résultat avec les mêmes amorces de MSP dans les études suivantes. Néanmoins, notre découverte suggère que CHD5 inactivation pourrait être médiée par différents mécanismes dans différents tissus. Considérant que CHD5 est inactivé par le biais du nombre de copies d'anomalie dans divers cancers [15, 16], l'hybridation génomique comparative (CGH) a indiqué que 1p36, le locus du gène contenant CHD5, est pas significativement déséquilibrée dans les cancers gastriques [26]. Au lieu de cela, comme le montre cette étude, CHD5 semble être réduit au silence principalement par hyperméthylation de promoteur dans le cancer gastrique.
Il y a plus de preuves que l'hyperméthylation du promoteur de TSG représente l'une des principales altérations moléculaires dans le développement du cancer. L'incidence élevée de CHD5 promoteur hyperméthylation dans le cancer gastrique peut être exploré non seulement comme un diagnostic de cancer de l'estomac, mais aussi pronostic prédiction. À cette fin, il est important de caractériser la méthylation du promoteur CHD5 en association avec les caractéristiques cliniques, tels que l'âge, le sexe, l'infection à H. pylori, grade tumoral, classification Lauren et la différenciation. Étant donné que la forte hétérogénéité des tissus de carcinome gastrique primaire, la méthylation analyse avec une résolution plus élevée, comme l'analyse spécifique de la méthylation quantitative en utilisant Sequenom ou Taqman PCR en temps réel sera utile pour déterminer si le promoteur de CHD5 méthylation est utile pour la détection du cancer gastrique au début et la prédiction de pronostic.
Bien que la méthylation du promoteur inactivant fréquemment CHD5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, nous ne pouvons pas exclure la présence d'autres mécanismes pour la fonction de perte de CHD5 dans le cancer gastrique. l'expression CHD5 est extrêmement faible dans MKN28 et SNU16 (fig. 1), cependant, le promoteur de CHD5 n'a été que partiellement méthylés dans ces deux lignées cellulaires (Fig. 2B), ce qui indique que d'autres mécanismes peuvent être responsables de la réduction au silence de CHD5 dans certains des lignées cellulaires de cancer gastrique.
Conclusion
CHD5 a souvent été régulée à la baisse par hyperméthylation de promoteur dans les cellules de cancer gastrique. L'expression ectopique de CHD5 a conduit à l'inhibition de cellules cancéreuses gastriques de croissance, ce qui indique que les fonctions CHD5 comme un gène suppresseur de tumeur épigénétique réduits au silence dans le cancer gastrique.
Déclarations
Remerciements
Nous remercions Dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Runrun Hospital Shaw, Université de Zhejiang) pour ses précieux conseils et un soutien technique. Les travaux décrits dans le présent document a été partiellement financé par une subvention du Conseil des subventions de recherche de la Région administrative spéciale de Hong Kong, Chine (Projet n ° CityU 160.508). Les fichiers originaux soumis '
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Les auteurs déclarent qu'ils avoir aucun conflit d'intérêts.

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