CHD5 je navzdol urejeno s promotorja hypermethylation v želodca cancer

CHD5 je navzdol urejeno s promotorja hypermethylation na raka želodca
Abstract
Ozadje
Nonhistone kromosomskih proteinov v dogovoru z histones igrajo pomembno vlogo pri razmnoževanju in popravilo DNA in pri regulaciji genske ekspresije. Deregulacija teh proteinov lahko prispeva k razvoju številnih bolezni, kot so rak. Kot nonhistone kromosomsko beljakovino, zavezujoča chromodomain helikaza DNA protein 5 (CHD5) je pred kratkim bila opredeljena kot proizvod z novo zaviralnih genov (ZTP), spodbujanje prepisovanje P19 ink4a
in p16 ARF
. Inaktivacijo CHD5 smo dosegli tudi s pomočjo genske delecije, saj se nahaja v 1p36, regija pogosto črta v človeških tumorjih. V tej študiji želimo preučiti vključevanje CHD5 na raka želodca, drugi najpogostejši rak svetovni.
Metode
CHD5 izraz v senatu želodčne rakavih celic so bile določene s kvantitativno RT-PCR. Metiliranje CHD5 je bila ocenjena z metilacije specifične PCR in bisulfita zaporedja nukleotidov v genomu. Učinek CHD5 na rast želodca rakavih celic je bil testiran s tvorbe kolonij testom.
Rezultati
CHD5 izražanja je navzdol urejena v vseh želodčnih raka celičnih linij se uporablja (100%, 07/07) in znatno obnovi po farmakološki demetilacija. Metiliranjem CHD5 promotor smo odkrili v vseh sedem želodca raka celičnih linijah in v večini osnovnih karcinoma želodca tkiv pregledanega (73%, 11/15). Končno, zunajmaternične izraz CHD5 v celicah želodčne rakavih pripeljalo do znatnega zaviranja rasti.
Zaključek
CHD5 bil TSG epigenetically navzdol urejeno z rakom želodca.
Ozadje
vseh evkariontskih organizmov razvili zapletene načine embalaže DNK v kromatina skozi dinamične interakcije različnih proteinov, DNK povezana. Takšna embalaža je pomembna za shranjevanje genetskih informacij z visoko zvestobo in integritete, ampak tudi prenos genetske informacije od DNK do RNA v dobro nadzorovan način ne samo. Proteine, ki se vežejo na DNA, da se tvori kromatin so običajno razdeljeni v dve splošni razrede: histones in nonhistone kromosomskih proteinov. Histona skupina visoko ohranjenim beljakovin vezavo DNK in njihove različne post-translacijske modifikacije pomeni "histona kodo", ki usmerja embalažo DNK ali kromatina preoblikovanja. Koda histonov se začne, vzdrževana in v veliki meri razlagati nonhistone kromosomskih proteinov [1-4]. Na primer, acetiliranje ostankov lizina na histonskih repi po histonskih acetyltransferases (kape) nevtralizira njihove stroške in zmanjšuje afiniteto histones z DNA, ki dostopni DNA za transkripcijskih faktorjev sprožijo gensko transkripcijo. Nasprotno, deacetilacijska teh ostankov z histonskih deacetilaz (HDACs) vrača naklonjenost in lahko dvignejo DNK iz transkripcijske strojih [5]. Poleg acetilirani fosforilacije in metilacije histonskih repi so pomembni za dinamičen združenje DNK z transkripcijske strojev in drugih kromosomskih proteinov [6-8]. Nonhistone kromosomske proteini igrajo pomembno vlogo pri razlagi histon kodo, ki jo tvorijo kromatina remodeling kompleksov. Obe histona in nonhistone kromosomske proteini so pomembni za uravnavanje izražanja genov, replikacija DNA in popravilo DNA. Je deregulations pri izražanju in aktivnosti teh proteinov lahko povzroči razvoj številnih bolezni, kot so rak [9-13].
V nedavni študiji so chromodomain helikaza DNA vezavni protein 5 (CHD5) opredeljena kot roman zaviralnih genov (ZTP) v nevroblastoma [14]. CHD5 pripada naddružine povezanih SNF2 SWI2 /ATP, eno veliko skupino nonhistone kromosomskih proteinov. CHD5 kodira edinstveno kombinacijo funkcionalnih področjih, ki so sestavljeni iz dveh N-terminalnih chromodomains, ki mu sledi SWI2 /SNF2 podobnega ATPaze /helikaza domeno in DNA vezavni domeni [14]. Z ureditvijo kromatin strukturo, lahko CHD5 spodbujajo izražanje P19 ARF, ki deluje za stabilizacijo p53, je zaviralnih inaktiviran v več kot polovici človekovih raka [15]. CHD5 je prisoten pri genskem lokusu (1p36.31) črta v okoli 35% nevroblastoma [16]. CHD5 je prej mislil, da je posebej izražena v živčnem sistemu, vendar je njegova vloga pri raku v drugih tkivih se začenja pojavljati [17]. CHD5 gen je bilo precej črta v glioma [18]. Poleg genov izbrisa lahko CHD5 treba zatreti z drugimi mehanizmi. V nekaterih primerih nevroblastoma, obstajajo dokazi, da je CHD5 izraz epigenetically zatreti z promotorja hypermethylation [19], čeprav ta ugotovitev ni bilo potrjeno v drugi študiji [20]. Nedavno je bilo ugotovljeno, da je promotor CHD5 naj se metilira, v majhnih delih prsi (4,4%), debelega črevesa (10%), jajčnikov (15%) in glioma (17%) tumorji [17, 20], kar kaže epigenetsko utišanje CHD5 metiliranje lahko igrajo delni vlogo pri tumorigeneze v teh tkivih. Tukaj smo ugotovili, da je CHD5 v nasprotju z drugimi vrstami raka doslej poročali pogosto hypermethylated raka želodca (73% tumorjev in 100% celičnih linij). Ektopična izraz CHD5 v želodčnih rakavih celic privedlo do znatnega zaviranja rasti. Ta presenetljiva korelacija med epigenetske zatiranja CHD5 in raka želodca kaže na prej neznano razmerje med to ZTP in želodca tumorigeneze.
Metode
tkiva kultura in RNA /ekstrakcija DNA
vseh želodčnih raka celičnih linijah (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 in NCI-N87) so bili pridobljeni iz Riken genske banke (Tsukubi, Ibaraki, Japonska) in American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ZDA). Vse celične linije raka, so bile določene z karcinomov epitelijskih celic želodca. Razen če ni posebej označeno, so bile celice gojimo v RPMI 1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma pri 37 ° C s 5% CO 2, in 95% vlagi. Za farmakološkega demetilacijo, smo celice obdelali s 5 pM 5-aza-2'-deoksicitidinska (aza) (Sigma, St. Louis, MO, ZDA) za tri dni zapored [21]. Aza je polnijo vsakih 24 ur. Ekvivalentna koncentracija nosilca (DMSO) smo uporabili kot kontrolo. Za primarne tkiva so običajne želodca tkiva definiran kot ne-vnetja in brez tumorskih tkiv. Vse želodca karcinom tkiva adenokarcinomom tkiva. Skupno RNA in genomsko DNA smo ekstrahirali z uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen) po navodilih proizvajalca.
Kvantitativna realnem času RT-PCR
reverzna transkripcijska reakcija je bila izvedena z uporabo 1 ug celotne RNA z reverzno transkripcijo sistemom (Promega, Madison , WI, ZDA). Ravni mRNA izraz CHD5 so bile določene s kvantitativno realnem času RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster mesta, CA, ZDA). Gliceraldehid-3-phosohate dehidrogenaze (GAPDH) je bila uporabljena kot notranji nadzor integritete RNA. Temeljni premazi, ki se uporabljajo za CHD5 RT-PCR so bili CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC in CHD5-R. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
metilacije specifične PCR (MSP)
statusa metilacija CHD5 je določena s PPN uporabo bisulfata spremenjen genomske DNK kot predlogo. Genomsko DNA je bisulfit zdravljeni z Zymo DNK Sprememba Kit (Zymo raziskave, Orange, CA, ZDA) v skladu s protokolom, ki. PPN je bila izvedena pri 40 ciklih pri temperaturi žarjenja pri 62 ° C, kot je opisano predhodno [22]. Metilacije specifične primerji so bili: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (od -525 do -506 glede na začetnem mestu transkripcije) in CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (od -438 do -418) in unmethylation specifične primerji so bili: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT in CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Vse primerji so bili prej potrdili, da ni razširitev nobene unbisulfited DNK
bisulfit genomsko zaporedje (BGS)
Bisulfite obdelano DNA smo pomnožili z uporabo BGS temeljni premazi, CHD5-BF. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (od -724 do -701) in CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (od -324 do -301). produktov PCR smo očistili z Illustra GFX ™ PCR in čistilni gel trak kit (GE Healthcare znanosti o življenju, Uppsala, Švedska) in klonirali v pCR4-TOPO vektorja sekvenciranje (Invitrogen). Vsaj 6 kolonije so bili naključno izbrani za pridobivanje plazmida in analizo zaporedja.
Gradnja CHD5 izražanja plazmidov
CHD5 izraz plazmid je bil zgrajen s kloniranjem polne dolžine CHD5 odprtega bralnega okvirja v izražanje vektorja pcDNA3.1 sesalcev. CHD5 odprti bralni okvir je bila dopolnjena z normalnim cDNA želodcu uporabo visoko zvestobo PFU DNA polimerazo (Invitrogen) in klonirali v pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Po potrditvi zaporedja, je bil vložek subklonirali v pcDNA3.1 z omejitvijo encimov Hind III in Xba I.
Colony oblikovanje testa
prehodno transfekcije AGS celice prazne pcDNA3.1 ali pcDNA3.1-CHD5 so bili uporabljeni za enoplastni kolonija oblikovanje test. Celice gojimo preko noči pri 12 vdolbinami (1,0 x 10 5 /jamico) in transfektirana z pcDNA3.1 ali-CHD5 izražanje vektor z uporabo Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). 48 ur kasneje, transfektanti bile ponovno plated v trojniku in gojili 10-15 dni v popolni RPMI1640 mediju, ki vsebujejo G418 (400 mg /ml). Preživelih kolonij smo obarvali encijan Violeto ko so bili prešteti metanol fiksiranje in kolonije, ki presegajo določeno velikost (≥ 50 celic). Poskuse smo ponovili trikrat.
Rezultati
Downovim-regulaciji CHD5 izražanja v želodcu raka celičnih linijah
Izraz CHD5 v želodčnih raka celičnih linijah smo določili kvantitativno RT-PCR. Medtem ko je bila CHD5 močno izražen v normalnih želodčnih tkiva, njegovi izrazi so navzdol urejeno v vseh 7 želodčnih raka celičnih linijah (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 in NCI-N87 SNU1 in SNU16) (Sl. 1). Slika 1 CHD5 je navzdol urejeno v želodcu raka celičnih linijah. Izraz CHD5 v želodčnih raka celičnih linijah smo določili z RT-PCR. GAPDH smo uporabili za normalizacijo izraz CHD5. Normalna želodec tkivo (želodec), je bila uporabljena kot referenca. Rezultati kvantitativne realnem času RT-PCR je prikazano v zgornji ploskvi in ​​rezultat konvencionalne RT-PCR je prikazan v spodnjem delu.
Promotor hypermethylation od CHD5 v želodčnih raka celičnih linij in primarnih želodčnega karcinoma tkiv
Značilen CpG Island (CGI), je bilo okoli CHD5 eksonu 1 na podlagi naslednjih meril: GC vsebine > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65 in dolžina > 500 bp (slika 2A.). Status metilacija tega CGI v želodcu rakavih celicah je bila določena z metilacijo specifični PCR (PPN). Kot je prikazano na sliki. 2B je v celoti ali delno metilacije odkrili v vseh 7 želodca raka celičnih linij smo preučiti. V skladu s podatki o celičnih linij želodca je promotor CHD5 metiliramo tudi v večini karcinoma tkiv primarnega želodca testiranih (73%, 11/15) (sl. 2C). Pomembno je, da je metilacija promotorja CHD5 bodisi neodkrita ali šibko zaznati v normalnih tkivih, ki mejijo na tumorjev istih bolnikov in v želodčnih tkiva zdravih osebah. Poleg tega je bila metilacija CHD5 promotorja v želodcu raka celičnih linijah in želodčnega karcinoma tkiva potrjena s bisulfita zaporedja nukleotidov v genomu (BGS) (sl. 2D). Skupaj, je CHD5 pretežno utišan na raka želodca in promotor hypermethylation zdelo, da je glavni mehanizem CHD5 dušenje zvoka v tumorigeneze tega tkiva. Slika 2 CHD5 promotor hypermethylated pri raku želodca. A, CHD5 ima tipično otok CpG (CGI) okoli svoje ekson 1. SDZ je bila narisana s programom GeneTool. Stališča BGS in PPN primerji so označeni kot puščice. B status metilacija CHD5 promotorja v želodcu rakavih celicah je bila določena z metilacije specifične PCR. M: metiliranje; U: unmethylation. C status metilacija CHD5 promotorja v primarni želodčnega raka tkiva smo določili z metilacije specifične PCR kot B. Običajno želodčne tkiv in sosednjih non-tumorskih tkiv so bili uporabljeni kot kontrole. N1 in N2 so normalne želodčnih tkiva. T1 in T2 kažejo želodčne karcinomske tkiv medtem A1 in A2 predstavljata sosednje niso tumorskih tkiv. Zastopane Rezultati so bili prikazani. D je Metiliranie CHD5 promotorja v želodcu raka celičnih linij in primarnih želodčnega karcinoma tkiv potrjuje BGS. Vsak krog označuje enega CpG stran in krogi polnjene v črni barvi predstavljajo metilira CpG mest. Ena vrsta krogov predstavlja eno kolonijo.
Up-regulacijo CHD5 izražanja po zdravljenju aza
Da bi še dodatno potrdi promotor CGI-hypermethylation posredovano CHD5 utišanje v želodcu raka celičnih linijah, CHD5 izrazi v letnem pregledu rasti in Kato III pred in po demetilacija reagenta smo analizirali zdravljenje aza. Oba celične linije kažejo popolno metilacije promotorja CHD5. CHD5 izraz v teh dveh celičnih linijah so znatno povečal po Aza-inducirane demetilacijo CHD5 promotorja (sl. 3A in 3B), ki dokazuje, da je CHD5 res epigenetically utišani z rakom želodca. Slika 3 Farmakološko demetilacija aktivira CHD5 izraz v želodcu raka celičnih linijah. A Relativni CHD5 izrazi pred in po zdravljenju aza bila določena z RT-PCR, kot je na sl. 1. GAPDH smo uporabili za normalizacijo zneska predlogo. B je demetiliranje CHD5 promotorja v AGS celicah po obdelavi aza potrdili BGS kot v sl. 2d.
Rast Zaviralni funkcija CHD5
premoženja zatiranje tumor v CHD5 v želodcu rakavih celic smo preiskovali s strategijo gain-of-funkcijo. Polna Odprt bralni okvir (ORF) na CHD5 smo klonirali v ekspresijski vektor pcDNA3.1 sesalcev. Učinek zunajmaternične CHD5 izražanja na rast želodčnega raka celic AGS smo določili s formacijo enoplastna kolonijo testu. Prisilno izraz CHD5 v AGS celicah je bila potrjena z RT-PCR (sl. 4A). Število kolonij oblikovanih na plošči s celicami prekomerno izražanje CHD5 signifikantno zmanjša (p
< 0,01) (slika 4B in 4C.), Kar kaže, da lahko CHD5 zavirajo rast želodčnih rakavih celic. Slika 4 CHD5 zavira rast rakavih celic linije želodca AGS. Učinek zunajmaternične CHD5 izražanja na rast tumorskih celic je preiskovala oblikovanja testom enoplastna kolonije. A CHD5 izražanje v celicah AGS po transfekciji smo določili z RT-PCR. Fotografija kolonij, ki jih tvorijo AGS celic transfekciji s pcDNA3.1 (vektorski) ali pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) je bil prikazan v B. C Kvantitativna analiza števila kolonij so prikazani kot vrednosti povprečne ± standardna deviacija. P
vrednosti so bile izračunane z uporabo t-test. Zvezdica označuje statistično pomembno razliko (p
< 0,01).
Razprava
V zadnjih nekaj letih je bilo veliko ZTP ugotovljeno, da je epigenetically inaktivirano raka želodca, kar kaže, da je epigenetsko utišanje ZTP ena velikih molekulskih sprememb v procesu karcinogeneze želodca [22-25]. V tej študiji je bila CHD5 opredeljena kot drugi potencialni ZTP katerega epigenetsko deaktivacijo lahko prispeva k želodca rakotvornost. To je pogosto navzdol urejeno s promotorja hypermethylation v želodcu raka celičnih linijah. Ektopična izraz CHD5 privedla do zaviranja rasti želodca rakavih celic, kar pomeni, da CHD5 deluje kot zajamčene tradicionalne posebnosti epigenetically utišani z rakom želodca.
Promotor hypermethylation od CHD5 raka so opazili v druge oblike raka [17, 20]. Vendar pa je incidenca CHD5 promotor metilacije v želodcu raka celičnih linijah in tumorjev najdemo v tej študiji relativno visoka v primerjavi s pogostnostjo CHD5 metilacije na drugih vrst raka (na splošno pod 20%) [17, 20]. Seveda bi bilo več vzorcev treba uporabiti za potrditev tega rezultata z enakimi PPN primerji v naslednjih študijah. Kljub temu pa je naša ugotovitve kažejo, da se lahko CHD5 inaktivacijo posreduje različnih mehanizmov v različnih tkivih. Ker CHD5 inaktiviran s kopiranjem številka deformacije različnimi vrstami raka [15, 16], primerjalno genomsko hibridizacijo (CGH) je pokazala, da 1p36 je vsebuje CHD5 gen locus, ni bistveno neuravnotežena v želodcu raka [26]. Namesto tega, kot je prikazano v tej študiji, se zdi CHD5 se pretežno zatrejo promotorja hypermethylation raka želodca.
Vedno več je dokazov, da hypermethylation TSG promotorja predstavlja enega izmed glavnih molekularnih sprememb v razvoj raka. Visoka pojavnost CHD5 promotor hypermethylation raka želodca je mogoče raziskati ne le kot želodčni diagnozo raka, ampak tudi prognoza napovedi. V ta namen je treba označiti CHD5 promotor metilacije je v povezavi s kliničnimi lastnostmi, kot so starost, spol, okužbe s H. pylori, tumorja razredu, razvrščanja Lauren in diferenciacijo. Glede na to, da je visoka heterogenost primarnih želodca karcinomom tkiv, metilacija analize z višjo resolucijo kot kvantitativno metilacije posebne analize z uporabo sequenom ali TaqMan PCR v realnem času bo v pomoč, da se oceni, ali je CHD5 promotor metilacija koristno za zgodnje želodca odkrivanje raka in napoved prognoze.
Čeprav promotor metilacija pogosto onesposobi CHD5 v želodcu raka celičnih linijah, ne moremo izključiti prisotnosti drugih mehanizmov za delovanje izida CHD5 raka želodca. CHD5 izraz je MKN28 in SNU16 izjemno nizka (sl. 1), pa je promotor CHD5 le delno metiliran v teh dveh celičnih linijah (sl. 2B), kar kaže, da lahko drugi mehanizmi odgovoren za utišanje CHD5 v nekaterih želodcu raka celičnih linij.
Zaključek
CHD5 je pogosto navzdol urejeno s promotorja hypermethylation v želodcu rakavih celic. Ektopična izraz CHD5 privedla do zaviranja rasti želodca rakavih celic, kar pomeni, da CHD5 deluje kot gen supresor tumorja epigenetically utišani z rakom želodca.
Izjave
Zahvala
Zahvaljujemo se dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Runrun Shaw bolnišnica Zhejiang University) za njegovo neprecenljivo svetovanje in tehnično podporo. Delo je opisana v tem članku, je bila delno podprt z donacijo sveta za raziskovalne štipendije Hong Kong Posebno upravno regijo, Kitajska (Projekt št CityU 160508). Originalne predloženi datoteke
avtorjev za slike
Spodaj so povezave s prvotno predloženih spisov avtorjev za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg avtorjev 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg avtorjev prvotni datoteki Slika 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg avtorjev prvotni datoteki Slika 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg avtorjev prvotni datoteki številka 4 nasprotujočimi si interesi
Avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov.

• Prognostični Vpliv receptorji epidermalnega rastnega faktorja pri bolnikih z metastatskim rakom želodca
• Laparoskopsko nastavljiv odvisnih Roux-en-Y želodčni bypass kot glavni postopek za super-super-debelih (indeks telesne mase > 60 kg /m2)